Botryosphaeria dothidea突變體庫的構建及分析

鄭偉,賈曉曼,王玉珂,王怡霖,孫庚午,何邦令*,劉會香*

1.山東農業(yè)大學植物保護學院,山東泰安271018

2.西北農林科技大學林學院,陜西楊凌712100

3.山東省泰安市第二中學,山東泰安271000

Botryosphaeria dothidea突變體庫的構建及分析

鄭偉1,2,賈曉曼1,王玉珂3,王怡霖1,孫庚午1,何邦令1*,劉會香1*

1.山東農業(yè)大學植物保護學院,山東泰安271018

2.西北農林科技大學林學院,陜西楊凌712100

3.山東省泰安市第二中學,山東泰安271000

Botryosphaeria dothidea是重要的林果潰瘍病害病原，分布廣，危害重。本研究應用ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）介導的B.dothidea遺傳轉化體系成功構建了1053個轉化子的突變體庫，并且通過繼代培養(yǎng)、PCR驗證和Southern blot證明潮霉素B抗性基因整合到B.dothidea基因組中且可穩(wěn)定遺傳。以B.dothideasdau11-126為對照，對526株轉化子的菌落形態(tài)、生長速率和致病性進行分析，篩選獲得了8個變異明顯且穩(wěn)定的突變體，以期為B.dothidea致病基因的分離、克隆和功能鑒定奠定基礎。

Botryosphaeria dothidea;農桿菌介導轉化（ATMT）;突變體;篩選

Botryosphaeria dothidea屬子囊菌門，葡萄座腔菌屬，是引致林果潰瘍病的重要病原，其分布廣泛、寄主范圍廣，可侵染楊樹、蘋果樹、梨樹、桃樹、桉樹以及橄欖樹等多個樹種[1]，引致果實腐爛、葉片斑點、枝干潰瘍、頂梢枯死、樹體流膠乃至整株樹木的死亡[2]，危害嚴重。因此，揭示B.dothidea致病的分子機制是國內外學者關注的熱點之一。

酶和毒素是B.dothididea致病機制研究最多的內容。酶和毒素可同時或分別在致病過程中起作用[3]。Ki Woo Kim等人對B.dothidea侵染果實的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在無傷口和自然孔口存在的情況下，B.dothidea能分泌類似角質層降解酶的物質幫助其順利侵染[4]。韓國學者對被B.dothidea侵染過的蘋果果實的提取物進行了分析，發(fā)現(xiàn)其產生多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、聚甲基半乳糖醛酸酶（pectin methyl galacturonic acid enzymes，PMG）和多聚半乳糖醛酸反式消除酶（poly-galacturonic acidtrans-elimination enzyme，PGTE）等一系列果膠酶[5]。但目前對B.dothidea致病機理的研究還處于初級階段，并不能直接證明哪種物質在致病過程中起主要作用，更不能在深層次上揭示其致病機理。真菌ATMT突變體庫的構建為真菌突變基因的篩選及生長發(fā)育相關機理的研究提供了良好的平臺[4]。雖然目前多種真菌ATMT突變體庫的構建方法及相關基因的分離和克隆已取得了重要研究進展[6-8]，但B.dothidea在突變體庫方面的研究較少，本研究旨在建立B.dothideaATMT介導的突變體，并從中隨機選取部分菌株，對其表型和致病性等進行分析，尋找致病突變體，進而對致病相關基因進行分離和初步注釋，為尋找調控B.dothidea生長發(fā)育和致病性相關基因奠定基礎。為明確其致病機理、掌握其與寄主的互作關系以及明確其發(fā)病規(guī)律等提供了科學依據(jù)，最終為B.dothidea引致病害的有效控制提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Botryosphaeria dothideasdau11-126菌株（對照菌株）分離自蘋果果實（遼寧，瓦房店E121°13′; N39°45′），經檢測為強致病菌株；質粒載體pBHt2（含1.4 kb的潮霉素抗性基因hph），農桿菌AGL-1放于30%甘油中-80℃凍存。上述菌株均保存在山東農業(yè)大學林木與病原分子互作研究室。

1.2 實驗方法

1.2.1B.dothidea突變體庫的構建

1.2.1.1 對照菌株對潮霉素B敏感性測定將對照菌株接種在PDA平板上，28℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)4 d，用直徑5 mm的滅菌的打孔器在菌落周邊打取菌絲塊，接種于含不同潮霉素濃度（0μg/mL、25 μg/mL、50μg/mL、75μg/mL）的PDA平板的中央，置于28℃培養(yǎng)，每個處理設3個重復。后用十字交叉法測量菌落直徑，篩選出能夠抑制菌株生長的最佳濃度。

1.2.1.2 對照菌株原生質體的制備對照菌株在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5 d后，加入3 mL無菌水，用火焰滅菌的涂布器將平板上菌絲刮斷，將菌絲液轉移到200 mL PD培養(yǎng)基中，100 r/min 28℃培養(yǎng)48 h。在超凈工作臺中，用四層紗布過濾收集菌絲，用0.7 M NaCl溶液沖洗菌絲幾次，用滅菌的濾紙和吸水紙濾干水分，用50 mL滅菌離心管盛裝菌絲，稱量干菌絲的重量備用。用0.7 M NaCl溶液溶解酶，0.7 M/mL NaCl溶解0.015 g崩潰酶和0.015 g裂解酶，酶解液體積與菌絲質量的關系為：3 mL/g。酶完全溶解后用注射器吸取酶液，經過濾器將濾液加到盛菌絲的離心管中，在31℃、100 r/min的搖床中酶解3.5 h。菌絲酶解后用細胞篩過濾除去殘渣，用1～2 mL 0.7 M NaCl沖洗殘留在細胞篩上的原生質體兩次，收集所有的濾液盛于一滅菌的50 mL離心管中，在4℃、3000 r/min條件下離心15 min，小心棄上清，用1～2 mL的STC輕輕用槍頭吹打懸浮沉淀，再離心1次，再棄上清，最后用1 mL的STC懸浮原生質體，使其濃度為6×106/mL，于-80℃條件下保存。

1.2.1.3 根癌農桿菌介導轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）首先將凍融法轉化好的攜帶標記基因的農桿菌AGL-1，在LB固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長出菌落后挑選單菌落克隆，牙簽接種到LB液體培養(yǎng)基，200 r/min 28℃過夜培養(yǎng)。

取上述培養(yǎng)液1 mL，12000 r/min離心1 min，棄上清，用200μL AIM液體充分懸浮菌體，12000 r/min離心1 min，棄上清，再用200μL AIM充分懸浮菌體后轉移菌體到試管中，調節(jié)試管中農桿菌的濃度大約為OD600=0.15，28℃水平搖床培養(yǎng)5～6 h，此時農桿菌的濃度OD600值約為0.5～0.6。

在超凈工作臺中往用STC保存的原生質體的1.5 mL離心管中加入500μLYPS，放到DNA混合儀上恢復或者搖床28℃條件下100 r/min，6 h。

加熱已經準備好的固體AIM使之溶化，等液態(tài)AIM涼到不燙手時加入（spore element 500μL/100 mL；乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）200μmol/L；卡那霉素50μg/mL）倒平板，AIM凝固后再其上面覆蓋硝酸纖維素膜（NC膜）。100μL培養(yǎng)好的經AS誘導培養(yǎng)的農桿菌和250μL恢復細胞壁的原生質體混合后涂布在貼有硝酸纖維素膜的AIM平板，22℃黑暗條件誘導培養(yǎng)48 h。

農桿菌和原生質體共培養(yǎng)后，將AIM上的NC膜用火焰滅菌的手術刀切成約3 mm寬的細條，轉移到篩選培養(yǎng)基中（不含5%山梨醇的PDA加熱融化后加入潮霉素50μg/mL；頭孢霉素40μg/mL；鏈霉素50μg/mL)，28℃培養(yǎng)7 d左右出現(xiàn)轉化子，將轉化子再轉移到篩選培養(yǎng)基上重復篩選2次。

隨機挑選出B.dothidea菌株的轉化子轉接到含潮霉素的PDA平板上，待長出后，再轉接至不含潮霉素的PDA連續(xù)繼代培養(yǎng)5代后，轉接到含潮霉素的PDA平板上，觀察轉化子是否仍對潮霉素表現(xiàn)出抗性。

分別對上述繼代培養(yǎng)后的轉化子采用CTAB法提取DNA，然后以DNA為模板，用擴增潮霉素B抗性基因的上下游引物hph1（5’-CAGCCTTGCTATCACATT-3’）序列，hph2（5’-AGCCCTGCTT CTTCCA-3’）序列進行PCR和Southern blot檢測。

1.2.2B.dothidea突變體的篩選

1.2.2.1 菌落形態(tài)觀察和生長速率測定將供試的突變菌株在PDA平板上28℃恒溫培養(yǎng)4 d后，觀察記錄各菌株菌落形狀、顏色、氣生菌絲的生長情況。分別于2 d、3 d、4 d用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算菌落生長速率并用SPSS軟件分析其差異顯著性。每個菌株設3個重復，并重復3次。

1.2.2.2 致病性測定對照菌株和突變體菌株PDA培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)4 d，菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅作為接種體備用。將紅富士蘋果果實表面洗凈后用75%的酒精表面消毒，最后用無菌水沖洗3次，風干待用。試驗采用人工接種法[9,10]，28℃下培養(yǎng)。將野生型菌株和突變體菌株分別接種到蘋果表面，測量其在相同時間內病斑擴展直徑。選用“海棠”葉片，葉片表面處理方法同上，然后用滅菌的濕棉花包住葉柄保濕。接種后的葉片放入托盤內（盤底鋪上滅菌的紗布），盤口覆上保鮮膜，于28℃保濕培養(yǎng)。試驗采用針刺傷（均勻分布在直徑2 mm的圓形區(qū)域）的傷口處理方式，刺傷部位避開葉片主脈。將PDA空白餅塊、野生型菌株和突變體菌株分別接種到葉片表面，測量其在相同時間內病斑擴展直徑。SPSS軟件分析其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 B.dothidea突變體庫的構建

2.1.1 對照菌株在PDA上的菌落形態(tài)對照菌株在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4 d后菌落直徑約5 cm，菌落邊緣初生長的菌絲為白色，中心菌絲為灰黑色，產生黑色色素（見圖1a）。

2.1.2 對照菌株對潮霉素B的敏感性測定試驗設置不同濃度梯度的潮霉素B對對照菌株進行敏感性測試，結果所示（見圖2），當潮霉素濃度為50 μg/mL時，對照菌株不能生長，故本試驗中采用50 μg/mL的潮霉素B用于篩選。

2.1.3 原生質體制備獲得的原生質體在顯微鏡下呈圓球形，大小不一，直徑在6.72 μm～32.35 μm之間，平均21.71 μm（見圖1b）。

圖1 a：對照菌株在PDA上菌落形態(tài)（4d）；b：10×40光學顯微鏡下原生質體；c：通過ATMT獲得的轉化子Fig.1 a:The colonial morphology of control strain on PDA (4d);b:Protoplasts were observed under 10×40 optical microscope;c:Transformants were obtained by ATMT

圖2 對照菌株對潮霉素B的敏感性測定Fig.2 Assessment of sensitivity of control strain to hygromycin B

2.1.4 根癌農桿菌介導轉化農桿菌介導原生質體的轉化效率為每106個原生質體產生25～40個轉化子。本試驗轉化pBHt2獲得具有潮霉素抗性轉化子1053個（見圖1c）。

2.1.5 轉化子的遺傳穩(wěn)定性分析隨機挑選轉化子菌株轉接在不含潮霉素B的PDA平板上連續(xù)繼代培養(yǎng)5代后，再接種到含有潮霉素B的培養(yǎng)基上，轉化子仍然能夠在含有潮霉素B的平板上生長（見圖3），表現(xiàn)出對潮霉素B的抗性，而對照菌株在含潮霉素B的PDA上不能生長。說明轉化子T-DNA的插入具有遺傳穩(wěn)定性。

圖3 轉接5代后在含潮霉素B的PDA上生長1：對照菌株，2-6：轉化子Fig.3 The fifth generation on PDAcontaining hygromycin B1:cotrol strain,2-6:transformants

2.1.6 轉化子潮霉素B抗性基因PCR檢測隨機挑選的轉化子均可以擴增獲得一條約1.4 kb的片段，與從質粒擴增出來的潮霉素B抗性基因片段相同，而以對照菌株DNA為模板沒有擴增出任何條帶（見圖4），說明hph基因已經整合進對照菌株的基因組中。以潮霉素B基因片段為探針對轉化子進行Southern blot檢測，結果顯示T-DNA以單拷貝插入基因組中（見圖5）。

圖4 隨機插入轉化子潮霉素抗性基因PCR檢測1：Marker；2：對照菌株；3-11：轉化子Fig.4 PCR amplification ofhphgene of random inserted-transformants1:Marker;2:controlstrain;3-11:PCRampliconsoftransformants

圖5 轉化子T-DNA插入拷貝數(shù)檢測1：質粒pBHt2；2-7：轉化子Fig.5 Copy number of T-DNAinsert of transformants1:plasmid pBHt2;2-7:Transformants

2.2 B.dothidea突變體的篩選

2.2.1 突變體菌落形態(tài)觀察對照菌株在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)4d后菌落形態(tài)同圖1a。在供試526個轉化子中有8株菌落形態(tài)發(fā)生了明顯變化，其中突變體LW-31和LW-26氣生菌絲疏松且旺盛，菌落正面和反面一直保持為乳白色；突變體LW-27、LW-22氣生菌絲稀薄且不旺盛，菌落正面和背面均為淡黃色；LW-100氣生菌絲稀薄不旺盛，菌落呈輪紋狀，菌落正面和反面都是紅褐色；LW-93氣生菌絲稀薄不旺盛，菌落邊緣有水溶現(xiàn)象，菌落正面和反面都是紅褐色；LW-7氣生菌絲疏松且旺盛，菌落初期為灰白色，后期變?yōu)榛液稚?；LW-111菌絲稀松旺盛，菌落為乳白色并有兩個同心環(huán)狀凹陷（見圖6）。

圖6 對照菌株和突變菌株在PDA上菌落形態(tài)（4d）Fig.6 Colony morphology of control strain and mutants strains on PDA(4d)

2.2.2 突變體生長特性測定分析對照菌株和8個突變體菌株菌落直徑（見圖6）、生長速率（見圖7）測定結果發(fā)現(xiàn)突變體LW-7、LW-31、LW-111菌株生長速率明顯比對照菌株快，生長速率分別增快了27.60%、29.35%、27.83%，并且與對照菌株相比存在顯著差異（見表1）。突變體LW-27和LW-26菌株生長速率明顯比對照菌株慢，生長速率分別減慢26.84%和24.43%，并且與對照菌株相比存在顯著差異。

圖7 對照菌株與突變菌株菌落生長速率的比較Fig.7 Comparison of the growth rate between control strain and mutants strains

圖8 對照菌株與突變菌株侵染蘋果速率比較Fig.8 Comparison of infection rate between control strain and mutants strains

表1 對照菌株和突變菌株在菌落生長速率和致病性兩方面方差分析Table 1 Variance analysis of two aspects of colony growth rates and pathogenicity of control strain and mutants strains

2.2.3 突變體致病性測定測量對照菌株和突變菌株在蘋果果實上病斑擴展直徑（見圖9），計算病斑平均擴展速率（見圖8）。突變菌株LW-7和LW-31致病性比對照菌株致病性增強，分別增強了13.76%和10.65%，并且與對照菌株存在顯著差異；突變菌株LW-27、LW-26、LW-100比對照菌株致病性減弱，分別減弱了54.90%、25.68%、26.86%，并且與對照菌株存在顯著差異；突變菌株LW-93、LW-22、LW-111與對照菌株沒有差異顯著性（見表1）。

圖9 對照菌株和突變菌株致病力測定（4 d）Fig.9 Pathogenic force measurement of control strain and mutants strains(4 d)

測量對照菌株和突變體接種于離體海棠葉片上病斑擴展直徑（見圖10）。經多次重復實驗統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)：突變菌株在海棠葉片的致病性和在蘋果果實的致病性基本一致。突變菌株LW-7和LW-31致病性比對照菌株致病性增強，分別增強了40.38%和54.28%，并且與對照菌株存在顯著差異；突變菌株LW-27、LW-26比對照菌株致病性減弱，分別減弱了49.52%、37.14%，并且與對照菌株存在顯著差異；突變菌株LW-93、LW-22、LW-111、LW-100與對照菌株沒有差異顯著性（見表1）。

圖10 對照菌株和突變菌株致病力測定（4 d）Fig.10 Pathogenic force measurement of control strain and mutants strains(4 d)

3 討論

目前，已有很多研究人員運用ATMT方法成功實現(xiàn)了多種病原菌功能基因的定點突變和功能分析。根癌農桿菌介導的真菌遺傳轉化還具有高效產生標記突變體和分離、克隆相關突變基因的優(yōu)勢。與PEG法相比它可以用原生質體、菌絲、孢子和蘑菇的菌褶組織等材料轉化，受體廣泛[11]；農桿菌介導轉化方法得到的突變體單插入較多；根癌農桿菌介導的真菌遺傳轉化的效率是常規(guī)轉化效率的100～1000倍；而PEG介導的真菌遺傳轉化主要特點是操作簡單，對原生質體有一定的毒性，變異率高，且轉化率也比較低[11]。

本研究對B.dothidea突變體庫內526個轉化子篩選發(fā)現(xiàn)大部分菌株在菌落形態(tài)、菌落生長速率、致病性等性狀上與對照菌株沒有明顯差異，僅少數(shù)突變體表現(xiàn)出明顯的差異。這與宋哲[5]、王梅娟等[7]的報道是一致的。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因有：外源基因是隨機插入病原菌基因組的；表型的改變不僅受外源基因的影響，還同時受病原菌本身的株系、遺傳轉化體系以及插入拷貝數(shù)等眾多因素影響。

4 結論

本研究在已建立并優(yōu)化ATMT介導的B.dothidea遺傳轉化體系的基礎上，重點進行了突變體庫的構建和表型篩選，使B.dothidea突變體庫容達1053個轉化子，其轉化效率為每106個原生質體產生25～40個轉化子，并且通過繼代培養(yǎng)、PCR和Southern blot證明hph基因已經整合進對照野生菌株的基因組中，而且可穩(wěn)定遺傳。通過對突變體菌落形態(tài)、生長速率、氣生菌絲茂密程度及致病性等因子進行系統(tǒng)分析和重復篩選，發(fā)現(xiàn)該菌株突變效率較低，比較保守，菌落顏色與該菌株的生長速率和致病性沒有相關性，菌株的生長速率與致病性存在正相關性。

[1]Phillips AJL,Alves A,Correia ACM,et al.Two new species ofBotryosphaeriawith brown,1-septate ascospores andDothiorellaanamorph[J].Mycologia,2005,97(2):513-529

[2]Liu HX,Li XD,Zhu XP,et al.First report of pomegranate stem scab caused byBotryosphaeria dothideain China[J]. Plant Pathology,2009,58(2):400

[3]陳亮.Botryosphaeria dothidea和Valsa malivar.mali遺傳轉化體系的建立[D].泰安:山東農業(yè)大學,2014:1-2

[4]Kim KW,Park EW,Kim KS.Glyoxysomal nature of microbodies complexed with lipid globules inBotryosphaeria dothidea[J].Phytopathology,2004,94(9):970-977

[5]宋哲.蘋果輪紋病菌突變體庫建立和突變體表型分析[D].楊凌:西北農林科技大學,2014:3-5

[6]范雷.灰葡萄孢T-DNA插入突變體庫的構建及其致病相關基因研究[D].武漢:華中農業(yè)大學,2012:7-13

[7]王梅娟，李坡，吳敏，等.玉米大斑病菌ATMT突變體庫的構建及其分析[J].中國農業(yè)科學,2012,45(12):2384-2392

[8]朱荷琴.我國棉花黃萎病菌的致病力分化及致病相關基因的克隆與分析[D].楊凌:西北農林科技大學,2013:13-15

[9]韋潔玲,黃麗麗,郜佐鵬,等.蘋果樹腐爛病室內快速評價方法的研究[J].植物病理學報,2010,40(1):14-20

[10]臧睿.陜西省蘋果樹腐爛病菌不同分離株的生物學特性及致病性研究[D].楊凌:西北農林科技大學,2006:31-33

[11]王陽.小麥條繡菌遺傳轉化體系的建立[D].楊凌:西北農林科技大學,2006:10-15

Construction and Evaluation of the Mutant Library ofBotryosphaeria dothidea

ZHENG Wei1,2,JIAXiao-man1,WANG Yu-ke3,WANG Yi-ling1,SUN Gen-wu1, HE Bang-ling1*,LIU Hui-xiang1*
1.College of Plant Protection/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China
2.College of Forestry/Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling712100,China
3.Tai’an City Second Middle School in Shandong Province,Tai’an271000,China

Botryosphaeria dothideais an important pathogen of forest and fruit trees and it is widely distributed and causes serious damage.In this study,mutant library ofB.dothideawas constructed via ATMT mediated transformation and 1053 transformants were obtained.Hygromycin B resistance genes were integrated into the genome of theB.dothidea,and mitotically stable after several subcultures were tested by PCR amplification and Southern blot.The strainB.dothideasdau11-126 was used as control to analyze colonial morphology,growth rate and pathogenicity of 526 transformants.Eight stable and obvious mutants were obtained by screening.This study will lay a foundation for isolating,cloning and functional identification of the pathogenic genes.

Botryosphaeria dothidea;Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT);mutants;screening

S763.1

:A

:1000-2324(2017)01-0001-06

2016-08-01

:2016-10-27

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0201100);國家科技部基礎平臺項目中國樹木潰瘍病重要病原微生物多樣性及在中國的生態(tài)地理分布和危害調查(2009FY210100)

鄭偉(1990-),男,河南安陽人,碩士研究生.E-mail:610965956@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:hebangling@126.com;hxliu722@126.com