翹嘴鱖微衛(wèi)星標記及其與主要經濟性狀的相關分析

孫際佳，李桂峰，劉麗，王海芳，胥鵬

（1.華南農業(yè)大學海洋學院，廣東 廣州 510642；2.中山大學生命科學學院，水生經濟動物研究所，南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510275；3.佛山市南海百容水產良種有限公司，廣東省工程技術研究中心，廣東 佛山 528216）

翹嘴鱖微衛(wèi)星標記及其與主要經濟性狀的相關分析

孫際佳1，李桂峰2,3，劉麗1，王海芳2，胥鵬2,3

（1.華南農業(yè)大學海洋學院，廣東 廣州 510642；2.中山大學生命科學學院，水生經濟動物研究所，南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510275；3.佛山市南海百容水產良種有限公司，廣東省工程技術研究中心，廣東 佛山 528216）

利用篩選出的7對具有較高多態(tài)性的微衛(wèi)星標記，檢測106尾翹嘴鱖Siniperca chuatsi選育個體的基因組DNA，分析這些微衛(wèi)星標記與翹嘴鱖體長、體質量和體高的相關性。結果獲得67個等位基因，各位點的等位基因數(shù)為3～19，片段大小在147～530bp之間；期望雜合度0.5092～0.9207，均值為0.7574；各位點的多態(tài)信息含量在0.4639～0.9101之間，均值為0.7197，表明所選擇的SSR標記識別力較高，適用于翹嘴鱖選育群體遺傳分析和標記輔助育種研究。相關性分析結果表明，G4位點中含有的片段為219bp等位基因的基因型（229/219或219/219）個體的體質量、體長和體高的表型效應顯著高于其他的基因型，G10位點中246/246基因型的體質量和體高表型效應顯著高于其他基因型，可作為未來翹嘴鱖分子標記輔助育種的重要參考位點。

翹嘴鱖；微衛(wèi)星標記；經濟性狀；相關性分析

在分布于我國的2屬9種鱖類中，翹嘴鱖Siniperca chuatsi個體大、生長快、肉質鮮嫩而具有很高的經濟價值，是我國養(yǎng)殖的主要經濟鱖類。近年來，隨著翹嘴鱖養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，其種質質量與生產要求之間的矛盾，如生長速度降低、種質退化和病害頻發(fā)等，嚴重制約了翹嘴鱖養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[1-3]。因此，急需通過選擇育種來改善翹嘴鱖的種質質量，以滿足鱖養(yǎng)殖業(yè)的需求。

近年來，隨著基于DNA多態(tài)性的分子標記技術的迅速發(fā)展和廣泛應用，分子標記輔助選擇（Marker Assisted Selection，MAS）給魚類育種提供了一種更有效的途徑[4]。分子標記輔助選擇育種的目標是尋找到與某個或某些數(shù)量性狀基因座位（Quantitative Trait Locus，QTL）連鎖的分子標記，并在育種過程中通過這些連鎖遺傳標記實現(xiàn)對目標數(shù)量性狀基因型的直接選擇，從而縮短育種周期，加快育種進程[5]。目前，在鯉Cyprinus carpio[6]、虹鱒Oncorhynchus mykiss[7]、大菱鲆Scophthalmus maximus[8]、美洲紅點鮭Salvelinus fontinalis[9]和紅鰭東方鲀Takifugu rubripes[10]等魚類中已有不少與性狀連鎖的分子標記的報道，而在鱖類研究中與性狀連鎖的分子標記鮮有報道。Wang等[11]利用SNP（Single Nucleotide Polymorphism）分子標記篩選到IGF-I基因的兩個SNP位點（g.A321G和g.A537G）與翹嘴鱖♀×斑鱖♂雜交F1的體質量和體寬生長性狀相關，但至今未見微衛(wèi)星標記與翹嘴鱖生長性狀間相關分析的報道。

微衛(wèi)星DNA又稱簡單序列重復（Simple Sequence Repeat，SSR），是由Miesfeld等[12]首次發(fā)現(xiàn)的一種簡單串聯(lián)重復DNA序列，因具有數(shù)目多、分布廣、多態(tài)性高、信息含量豐富、突變快、雜合度高、共顯性遺傳和檢測方法簡便等優(yōu)點[13]，成為第二代DNA遺傳標記的核心，已廣泛應用于QTL定位和分子標記輔助育種等方面[14,15]。近年來，微衛(wèi)星標記技術已廣泛應用于鱖選育群體遺傳多樣性分析[16,17]。

本研究在已經獲得的翹嘴鱖微衛(wèi)星標記的基礎上，分析微衛(wèi)星標記與翹嘴鱖主要經濟性狀（體質量、體長和體高）之間的相關性，期望發(fā)現(xiàn)與主要經濟性狀相關聯(lián)的微衛(wèi)星標記，為翹嘴鱖的分子標記輔助選擇育種研究和實驗提供基礎參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的野生翹嘴鱖親魚分別引自湖南省和江蘇省，按1∶1親本比例分別培育3個湖南翹嘴鱖家系、1個江蘇翹嘴鱖家系、以及2個湖南翹嘴鱖和江蘇翹嘴鱖雜交家系，構建由6個家系組成的翹嘴鱖選育群體。將同期孵出的6組家系各取1 000尾，共6 000尾全長約1cm的魚苗混合養(yǎng)殖在同一池塘中，以消除環(huán)境和飼料的影響。保證餌料魚充足的條件下，飼養(yǎng)至8月齡后，隨機選取106尾進行表型和基因型分析。

1.2 微衛(wèi)星引物

參考匡剛橋[18]分離的翹嘴鱖微衛(wèi)星序列，用軟件Primer Premier 5.0設計微衛(wèi)星引物。在設計的20對引物中，根據(jù)擴增穩(wěn)定、6%變性PAGE條帶清晰、多態(tài)性較高的選取原則，篩選出7對SSR引物（表1）分析群體遺傳多樣性和主要經濟性狀的相關性。所設計的引物由Invitrogen生物技術公司進行合成。

表1 篩選的7對微衛(wèi)星引物的核心序列、退火溫度及其引物序列Tab.1 Core repeats,primer sequences and annealing temperatures of the 7 microsatellite DNA loci

1.3 方法

1.3.1 表型性狀的度量

根據(jù)魚類學方法測定和計算翹嘴鱖的體質量、體長和體高等表型性狀。

1.3.2 基因組DNA的提取及SSR分析

提取106尾樣本魚的背部肌肉用于基因組DNA分析。魚類基因組DNA抽提方法參照傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法基本原理，并根據(jù)本實驗實際情況對離心時間和抽提次數(shù)稍作更改。

PCR反應體系總量25μL，包括2×PCR Reaction Mix12.5μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、模板DNA（30ng/μL）2μL、Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）0.25μL和ddH2O8.25μL。擴增反應使用Bio-Rad公司的MyCycler型PCR儀，采用梯度PCR法篩選最佳退火溫度。PCR反應程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，退火45s（退火溫度依引物而異，見表1），72℃延伸1min，經35個循環(huán)后，72℃延伸10min，4℃保存。6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，掃描儀記錄電泳圖譜，用Gel-Proanalyzer32軟件手動分析SSR片段的大小。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計體質量、體長、體高表型性狀的變異，計算各性狀間的相關系數(shù)。采用SAS 9.2軟件進行Shapiro-Wilk檢驗表型性狀的頻率分布是否顯著偏離正態(tài)分布。利用POPGENE version 1.32和PIC-CALC軟件統(tǒng)計各位點的等位基因數(shù)目、基因型、期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量 PIC（Polymorphism Information Content）。利用SPSS17.0軟件對微衛(wèi)星標記與體重、體長和體高性狀進行單因素方差分析。利用SAS 9.2軟件進行基因型與性狀間的多重比較：對符合正態(tài)分布的性狀采用參數(shù)檢驗的Tukey-Cramer法進行比較，不符合的性狀則采用非參數(shù)檢驗的秩和檢驗法進行比較。由于部分基因型在微衛(wèi)星位點中的頻率太低，缺乏統(tǒng)計分析意義，因此在實際分析中僅考慮至少有2次觀測值的基因型。

2 結果和分析

2.1 表型性狀的統(tǒng)計分析

翹嘴鱖選育群體的體質量范圍在88.4～648.1g，體長范圍在14.40～29.40cm，體高范圍在5.32～11.30 cm。體質量、體長和體高的變異系數(shù)分別為44.59%、13.86%和18.90%，體質量性狀的變異最大（表2）。

表2 翹嘴鱖的體質量、體長和體高的表型統(tǒng)計量Tab.2 The phenotypic statistics of body weight,body length and body height in mandarin fish Siniperca chuatsi

體質量、體長和體高的正態(tài)性檢驗Q-Q（Quantile-Quantile）圖如圖1所示。圖1中給出的體質量、體長和體高性狀的Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗結果表明，體長符合正態(tài)分布（P=0.3930＞0.05），而體質量和體高不符合正態(tài)分布（P＜0.0001）。因此，基因型與體長的多重比較應采用Tukey-Kramer法檢驗，而基因型與體質量、體高的多重比較應采用秩和檢驗法檢驗。

2.2 體質量、體長和體高的Pearson相關分析

圖1 正態(tài)性檢驗的Q-Q圖（體質量（a），體長（b），體高（c））Fig.1 Normal quantile-quantile plots of body weight（a）,body length（b）and body height（c）

利用Pearson相關性檢驗方法分析3個性狀之間的相關程度（表3）。由表3可知，體質量、體長和體高的Pearson相關系數(shù)均達0.9以上，且相關極顯著（P＜0.01）。

表3 翹嘴鱖的體質量、體長和體高的Pearson相關系數(shù)Tab.3 Pearson correlation coefficient of body weight, body length and body height in mandarin fish Siniperca chuatsi

2.3 電泳結果

用7對微衛(wèi)星引物對翹嘴鱖基因組DNA進行PCR擴增和6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，各微衛(wèi)星引物均獲得了清晰、穩(wěn)定的DNA條帶，并在個體間表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性。

2.4 微衛(wèi)星多態(tài)性檢測

本研究中翹嘴鱖群體的遺傳多樣性信息及性狀F值見表4。在7對微衛(wèi)星標記中共檢測到67個等位基因，平均等位基因數(shù)為9.57個，等位基因片段大小在147～530bp之間。7個位點共檢測到基因型61個，平均每個位點8.71個；期望雜合度He變化在0.5092～0.9207之間，平均0.7574；多態(tài)信息含量PIC在0.4639～0.9101之間，平均0.7197。

2.5 微衛(wèi)星位點與體質量、體長和體高的相關分析

采用單因素方差分析方法檢驗了微衛(wèi)星位點與翹嘴鱖體質量、體長、體高性狀連鎖的顯著性。各微衛(wèi)星位點對體質量、體長和體高影響的F檢驗值見表4。7個微衛(wèi)星位點中有4個位點（G4、G10、G12和G13）與體質量、體長和體高均顯著相關（P＜0.01）。對上述4個差異顯著的標記進行了不同基因型間不同性狀的多重比較（體長用Tukey-Kramer法，體質量和體高用秩和檢驗法），結果見表5。

在標記G4中共檢測到4個基因型，其中基因型219/219的12個個體和基因型229/219的18個個體的平均體質量、體長和體高值均顯著高于其他基因型個體的平均值（P＜0.05），且基因型219/219與基因型229/219個體的平均體質量、體長和體高值均差異不顯著（P＞0.05），說明G4位點中219bp片段的等位基因可能對體質量、體長和體高性狀起正面影響。

在標記G10中共檢測到4個基因型?；蛐?46/246的39個個體的體質量和體高均顯著高于其他基因型個體的平均值（P＜0.05），說明該基因型與體質量和體高正相關（圖2）。基因型248/248個體的平均體高顯著小于基因型255/248和255/255的個體（P＜0.05），因而推測248bp片段的等位基因可能對體高性狀起負面影響。

在標記G12中共檢測到13個基因型?；蛐?29/279的2個個體和359/305的9個個體的體質量和體高顯著高于其他基因型個體（P＜0.05），但基因型329/279與基因型359/305個體的平均體質量、體長和體高差異不顯著（P＞0.05）。

在標記G13中也檢測到13個基因型?；蛐?75/237的2個個體和304/268的9個個體的體質量和體高顯著高于其他基因型個體（P＜0.05），但基因型275/237與基因型304/268個體的平均體質量、體長和體高差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 所研究翹嘴鱖群體的遺傳信息及性狀F值Tab.4 Genetic information and F values in populations of mandarin fish Siniperca chuatsi

表5 翹嘴鱖群體的4個微衛(wèi)星位點不同基因型體質量、體長和體高的平均值及多重比較Tab.5 Mean and multiple comparisons of bod weight,body length and body height in 4 microsatellite loci in mandarin fish Siniperca chuatsi

3 討論

3.1 分子標記輔助育種SSR標記的篩選

動物遺傳育種的分子標記中，SSR標記已成為分析群體遺傳結構和與重要經濟性狀的遺傳連鎖關系最理想的標記之一，并已經獲得了廣泛的應用[19]。有關翹嘴鱖SSR標記的開發(fā)已有一些研究。Zhang等[20]、匡剛橋等[21]和Liu等[22]利用FIASCO（Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats）法分別篩選出18、18和40個具有多態(tài)性的SSR標記。Qu等2012年[23]和2013年[24]分析了翹嘴鱖♀×斑鱖♂雜交子代的轉錄組，分別篩選到適用于翹嘴鱖遺傳分析的43和29個多態(tài)SSR位點。但是，至今未見有應用SSR標記進行翹嘴鱖分子標記輔助育種的報道。本研究利用匡剛橋[18]分離的20個翹嘴鱖SSR序列，對選育群體進行擴增，篩選出7個具有多態(tài)性的4核苷酸重復的SSR標記。已有研究表明，核心序列過長的雙核苷酸重復的SSR標記易產生影子帶，對結果的判定有一定的影響，而3、4核苷酸重復的SSR標記具有多態(tài)性高，產生影子帶的幾率較低，結果判定更準確等優(yōu)點[25,26]。本研究篩選的SSR標記擴增條帶穩(wěn)定、清晰，PIC結果顯示，除G4位點表現(xiàn)為中度多態(tài)外（0.25＜PIC＜0.5），其余6個位點均為高度多態(tài)（PIC＞0.5），表明這7個SSR標記具有較高的識別力，適用于翹嘴鱖群體遺傳分析和標記輔助育種的研究。

3.2 選育群體的遺傳多樣性

在分子標記輔助育種的選育體系中，維系選育群體的遺傳多樣性是選育體系能否可持續(xù)性發(fā)展的關鍵。如果選育群體的遺傳多樣性持續(xù)降低，極可能導致選育群體陷入近交衰退和較差選擇響應的惡性循環(huán)[27]。方展強[1]等利用RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）技術、楊宇暉等[28]利用線粒體控制區(qū)（D-loop）核苷酸序列、吳旭等[29]和梅秋蘭等[30]利用SSR標記技術對翹嘴鱖群體遺傳多樣性的研究結果均表明：翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平顯著低于野生或原種群體。因此，開展翹嘴鱖的遺傳育種工作應維持連續(xù)的選育遺傳改良與高遺傳多樣性水平之間的平衡。本研究中，翹嘴鱖選育群體的平均期望雜合度（He=0.7574）和平均多態(tài)信息含量（PIC=0.7197）均高于吳旭等[29]（He= 0.5210，PIC=0.4071）和梅秋蘭等[30]（He=0.4109，PIC=0.5043）報道的翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。這是由于本研究所構建的翹嘴鱖選育群體中包含由湖南和江蘇野生翹嘴鱖親本遠緣雜交形成的子一代群體，因而能保持較高的遺傳多樣性水平，有利于后續(xù)進一步的遺傳選育。

3.3 SSR標記與性狀的相關性分析

分子標記輔助選擇育種是通過與目的基因緊密連鎖或共分離的分子標記，直接篩選DNA目標區(qū)域，因而不受環(huán)境條件的影響，可以提高選擇的準確性和可靠性[4]。分子標記輔助選擇育種的關鍵是尋找對目標性狀具有較大遺傳貢獻率的主效基因或標記。分子遺傳標記與數(shù)量性狀間存在一定的關聯(lián)關系，即標記與控制這些數(shù)量性狀的基因處于連鎖不平衡狀態(tài)是確定影響目標性狀的主效基因或分子標記的先決條件。如王宣朋等[31]利用SSR、EST-SSR（Expressed Sequence Tag-SSR）、SNP標記對鯉的3種性狀進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)分別有27、35和27個標記與食物轉化率、體厚和體質量顯著相關（P＜0.05），且標記SNP0041、SNP0044與食物轉化率相關極顯著（P＜0.001）。Cnaani等[32]分別利用20個和6個SSR標記對莫桑比克羅非魚Oreochromis mossambica與奧利亞羅非魚Oreochromis aureus的2個雜交F2群體進行分子標記與耐寒能力和魚體規(guī)格的QTL分析，結果發(fā)現(xiàn)在同一個連鎖群中的兩個相距22cM的微衛(wèi)星位點與目標性狀相關顯著，其中UNH879與羅非魚的耐寒能力顯著相關（P＜0.05），UNH130與羅非魚的體質量顯著相關（P＜0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星位點G4、G10、G12和G13位點與翹嘴鱖選育群體的體質量、體長和體高性狀均極顯著相關（P＜0.01），說明這些標記位點與相關的性狀間存在關聯(lián)。在這些關聯(lián)關系中，發(fā)現(xiàn)了一個性狀的表現(xiàn)受多個不同標記位點的基因影響，或者一個標記位點可以影響多個性狀的表現(xiàn)，說明這些位點中存在“多因一效”和“一因多效”的現(xiàn)象。

3.4 基因型與性狀的連鎖分析

基因型-性狀連鎖分析是對個體的數(shù)量性狀值與標記位點的基因型進行顯著性檢驗，差異顯著則表明基因型與數(shù)量性狀存在關聯(lián)[33]。如孫效文等[34]對28個多態(tài)性SSR標記的基因型與208尾鏡鋰Cyprinus carpio var.specularis繁殖群體的體質量值進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)有12個基因型與鏡鯉體質量相關，且有3個基因型緊密相關。本研究對數(shù)量性狀相關的微衛(wèi)星位點進行不同基因型性狀均值的多重比較，結果表明在G4位點中，含有219bp片段的等位基因的基因型（229/219或219/219）個體的體質量、體長和體高的表型效應顯著高于其他基因型；在G10位點中246/246基因型的體質量和體高表型效應顯著高于其他的基因型。上述結果表明，G4位點的229/219和219/219基因型可作為體質量、體長和體高選擇的輔助標記，而G10位點的246/246基因型可作為體質量和體高選擇的輔助標記。

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Analysis of Microsatellite DNA Markers Emphasis on Correlation with Some Economically Important Traits in Mandarin fish Siniperca chuatsi

SUN Ji-jia1,LI Gui-feng2,3,LIU Li1,WANG Hai-fang2,XU Peng2,3
（1.College of Marine Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China; 2.South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center,Institute of Aquatic Economic Animals,School of Life Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China;3.Guangdong Engineering Technology Research Center,Foshan Nanhai Bairong Aquatic Breeding Co.Ltd.,Foshan 528216,China）

The genomic DNA properties and the correlation between the microsatellite markers and three economic traits including body weight,body length,and body height were analyzed in 106 individuals of mandarin fish Siniperca chuatsi based on the seven high polymorphism microsatellite markers.A total of 67 different alleles were observed,with alleles ranging from 3 to 19 per locus, and the DNA fragment length was varied from 147 bp to 530 bp.The expected heterozygosity was found to be from 0.5092 to 0.9207 with mean value of 0.7574,and the polymorphism information content（PIC）to be ranged from 0.4639 to 0.9101 with mean value of 0.7197,indicating that the selected microsatellite markers were practicable for the genetic analysis and molecular marker assisted breeding of the mandarin fish.The correlation analysis revealed that the genotype in locus G4 with DNA fragment length of 219（229/219 or 291/219）had significantly higher phenotype effect on body weight,body length and body height than others.However, the genotype（246/246）in locus G10 had significantly higher phenotype effect on body weight and body height.Both loci appear to offer some important reference information in the future research on molecular marker assisted breeding of the mandarin fish.

Siniperca chuatsi;microsatellite marker;economic trait;correlation analysis

S917

A

2016-07-29

廣東省戰(zhàn)略性新興產業(yè)核心技術攻關項目（2012A020800001）；廣東省教育廳項目（cxzd1104）；佛山市引進科技創(chuàng)新團隊資助計劃（2014IT100122）.

孫際佳（1976-），女，博士，從事水產動物遺傳育種研究.E-mail:jjsun@scau.edu.cn

李桂峰（1963-），男，教授，博士生導師.E-mail:liguif@mail.sysu.edu.cn

1005-3832（2017）01-0011-08