氧化槐定堿對(duì)福爾馬林致痛小鼠大腦GAT-1表達(dá)的影響

高進(jìn)賢，張秀娟，余建強(qiáng)，蔣袁絮

(甘肅省人民醫(yī)院1.藥劑科、3.質(zhì)控科，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

氧化槐定堿對(duì)福爾馬林致痛小鼠大腦GAT-1表達(dá)的影響

高進(jìn)賢1，張秀娟3，余建強(qiáng)2，蔣袁絮2

(甘肅省人民醫(yī)院1.藥劑科、3.質(zhì)控科，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

目的 觀察小鼠大腦GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GABA transporter-1,GAT-1)的變化對(duì)氧化槐定堿(oxysophoridine, OSR)鎮(zhèn)痛作用的影響。方法 采用福爾馬林舔足法觀察小鼠靜脈(intravenous injection，iv)給藥后OSR的鎮(zhèn)痛效果，免疫組織化學(xué)方法(SABC法)觀察OSR對(duì)小鼠大腦皮層和丘腦GAT-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞的影響，Real time RT-PCR方法檢測(cè)OSR對(duì)福爾馬林致痛小鼠大腦GAT-1 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果iv OSR 500、250、125 mg·kg-1可延長(zhǎng)福爾馬林所致小鼠的舔足潛伏期(P<0.05，P<0.01)；腹腔注射(intraperitoneal,ip)OSR 500 mg·kg-1可使小鼠丘腦和大腦皮層的GAT-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P<0.01)，對(duì)小鼠大腦的GAT-1 mRNA的表達(dá)也有明顯的抑制作用(P<0.05)。結(jié)論 OSR有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制與中樞GAT-1表達(dá)的下調(diào)相關(guān)。

氧化槐定堿；福爾馬林；鎮(zhèn)痛；GAT-1；GABA；大腦

γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid，GABA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過作用于特異的受體啟動(dòng)中樞抑制作用，而GABA能神經(jīng)信號(hào)突觸傳遞的強(qiáng)弱和時(shí)程長(zhǎng)短主要依賴GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體(GABA transporter,GAT)的調(diào)節(jié)。GAT可快速攝取突觸間隙和細(xì)胞外液的GABA，終止GABA對(duì)突觸后膜受體的作用，研究發(fā)現(xiàn)GAT與疼痛、癲癇、阿爾茨海默癥(AD)、酒精的耐受性等都有密切關(guān)系[1]。

氧化槐定堿(oxysophoridine, OSR)是從豆科槐屬植物苦豆子中提取的主要生物堿，基本結(jié)構(gòu)由2個(gè)3價(jià)氮原子稠和的雙哌啶環(huán)構(gòu)成[2]。本實(shí)驗(yàn)組前期的研究表明，OSR對(duì)多種致痛模型所致的疼痛均有明顯的緩解作用，其中鎮(zhèn)痛作用機(jī)制與中樞GABA、甘氨酸含量的升高和GABAA受體表達(dá)的增加有關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討OSR的鎮(zhèn)痛作用與高位中樞GAT-1的關(guān)系。

1 動(dòng)物與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年昆明種小白鼠，寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(寧)2005-001，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，所有小鼠給予常規(guī)飼料正常喂養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 OSR購(gòu)自寧夏紫金花藥業(yè)公司，批號(hào)：071217；鹽酸嗎啡注射液(morphine,Mor)購(gòu)自沈陽(yáng)第一制藥廠，批號(hào)051106；兔抗鼠GAT-1多克隆抗體(批號(hào)：BA0880)、即用型SABC試劑盒(批號(hào)：SA1022)、DAB顯色試劑盒(批號(hào)：AR1022)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。TransStart Green qPCR SuperMix 試劑盒(批號(hào)：D20729)、TransZol 試劑(批號(hào)：D70811)、2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒(批號(hào)：D10610)、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(批號(hào)：D20729)均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 低溫冰箱MDF290AT(日本Sanyo公司)；WD900G格蘭仕光波/微波爐(廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司)；LEICA RM2235切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；BMJ-Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺(tái)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(常州中威電子儀器廠)；OLYMPUS BH-2顯微鏡(中日合資 Olymous Optical CO. LTD)；實(shí)時(shí)定量IQ5 PCR儀、高速低溫離心機(jī)、核酸濃度測(cè)定儀( 美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 福爾馬林舔足法 小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為生理鹽水(normal saline,NS)組、Mor(20 mg·kg-1)組、OSR(500、250、125 mg·kg-1)組。Mor組ip，其余各組均iv，給藥容量為0.01 mL·g-1。給藥后60 min，在小鼠右后足跖皮下用微量注射器注射體積分?jǐn)?shù)為0.02福爾馬林20 μL，觀察并記錄注射后0～5 min(第Ⅰ時(shí)相)和10～60 min(第Ⅱ時(shí)相)兩個(gè)時(shí)間段累計(jì)舔足時(shí)間，分別代表Ⅰ相和Ⅱ相的疼痛指標(biāo)。

2.2 免疫組織化學(xué)法 小鼠20只，♀♂兼用，隨機(jī)分為2組：NS組和OSR組。OSR組ip OSR 500 mg·kg-1，NS組給予等容量的生理鹽水，45 min后麻醉，用100 mL體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛灌注至動(dòng)物發(fā)硬。迅速取腦，放入4℃的多聚甲醛固定液48 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制成4 μm切片，60 ℃烤箱加溫2 h，用于免疫組化染色。染色后每個(gè)動(dòng)物隨機(jī)取2張切片，每個(gè)切片隨機(jī)抽取2個(gè)不重疊代表性視野，在顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)和丘腦內(nèi)GAT-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2.3 Real time RT-PCR 小鼠30只，♀♂兼用，隨機(jī)分為3組，每組10只：福爾馬林組、正常對(duì)照組、OSR組。福爾馬林組和OSR組分別iv NS和OSR(500 mg·kg-1)，35 min后小鼠足下注射體積分?jǐn)?shù)為0.02福爾馬林20 μL，60 min后取大腦(去掉小腦)于液氮中。正常對(duì)照組iv NS后于95 min取大腦(去掉小腦)于液氮中。

總RNA提?。好?00 mg組織加1 mL TransZol勻漿，提取RNA。使用核酸測(cè)定儀測(cè)OA值及1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，按TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明配制體系反應(yīng)液，置于PCR儀中，42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

2.4 OSR對(duì)大腦GAT-1 mRNA表達(dá)的影響 采用熒光染料(SYBRgreenⅠ)實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)GAT-1和GAPDH基因的表達(dá)水平，反應(yīng)體系如下: TransStart Green qPCR SuperMixUDG(2×) 12.5 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，cDNA溶液2.5 μL，GAT-1上、下游引物分別為：5′-AACTCCTTCACCACGACC-3′和5′-TCCCAGAACTCCACCAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度125 bp，退火溫度52 ℃。GAPDH上、下游引物分別為：5′-AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG-3′和 5′-AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度294 bp，退火溫度52 ℃。GAT-1和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)和合成。PCR的參數(shù)為: 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。GAT-1和GAPDH基因同步擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果自動(dòng)以CT值給出。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算按照2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。反應(yīng)完畢后，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物做溶解曲線分析。

3 結(jié)果

3.1 OSR對(duì)福爾馬林致小鼠舔足潛伏期的影響 與NS組比較，Mor(20 mg·kg-1，ip)對(duì)福爾馬林所致小鼠舔足潛伏期的Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)均有明顯的延長(zhǎng)作用(P<0.01)， OSR(500、250、125 mg·kg-1，iv)對(duì)Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)也表現(xiàn)出明顯的延長(zhǎng)作用(P<0.05，P<0.01)，并隨劑量增加鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)；與Mor比較，OSR的抑制作用稍弱，但高劑量OSR在Ⅰ相的鎮(zhèn)痛效果接近于Mor，見Tab 1。

GroupDose/mg·kg-1Lickingtime/sPhaseⅠreaction(0～5min)PhaseⅡreaction(10～60min)NS-75.21±11.24179.56±17.65Mor2021.30±10.28**75.71±21.38**OSR50033.01±12.12**100.21±21.34**#25047.13±11.75*#107.87±21.23**#12565.58±17.21##143.84±23.15*##

*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05,##P<0.01vsMor group

3.2 OSR對(duì)小鼠大腦皮層和丘腦GAT-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞的影響 與NS組比較，ip OSR 500 mg·kg-1后小鼠大腦皮層和丘腦的GAT-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別降低了59%和69%，見Tab 2、Fig 1。

GroupDose/mg·kg-1Positivecellnumber/visualfieldsCerebralcortexHypothalamusNS-169.95±6.811118.50±7.695OSR50099.85±2.280**82.10±3.598**

**P<0.01vsNS group

3.3 OSR對(duì)福爾馬林致痛小鼠大腦GAT-1 mRNA表達(dá)的影響

3.3.1 總RNA和cDNA的檢測(cè) 提取的RNA的OD值A(chǔ)260/280均在1.8到2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見3條明顯的RNA特征條帶:5S、18S、28S，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA特異性強(qiáng)、質(zhì)量好，熔解曲線顯示GAPDH和GAT-1定量PCR產(chǎn)物峰值均一、未見到其他明顯的異常波形。見Fig 2～4。

3.3.2 Real time RT-PCR結(jié)果分析 與NS組比較，福爾馬林組小鼠大腦GAT-1 mRNA的表達(dá)明顯升高，是NS的3.54倍，而OSR(500 mg·kg-1，iv ) 可明顯抑制福爾馬林誘導(dǎo)的GAT-1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，接近于NS組，見Tab 3。

Fig 1 Effect of OSR on expression of GAT-1 in cerebral cortex and hypothalamus of mice(×100)

A:Cerebral cortex of control group;B:Cerebral cortex of OSR group;C:Hypothalamus of control group;D:Hypothalamus of OSR group

Fig 2 Agarose gel electrophoresis result of total RNA in brain

Fig 3 Solubility curve of GAPDH and GAT-1

GroupDoseGAT-1mRNArelativeexpressionNS-0.39±032ΔFormalin1μL·g-11.38±0.88*OSR500mg·kg-10.46±0.56Δ

*P<0.05vsNS group;ΔP<0.05vsformalin group

Fig 4 Cumulative results of GAPDH and GAT-1

4 討論

GAT是存在于囊泡膜、突觸前膜或膠質(zhì)細(xì)胞膜中Na+依賴的神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體，能快速重?cái)z取突觸間隙的GABA，對(duì)GABA能神經(jīng)信號(hào)突觸傳遞的強(qiáng)弱和時(shí)程長(zhǎng)短有調(diào)控作用。GAT-1在脊髓和腦組織中含量豐富，占GAT總數(shù)的80%[4-5]， GAT-1作為GABA代謝系統(tǒng)中重要的構(gòu)成部分，在痛覺信息的傳遞和調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，GAT-1過表達(dá)的小鼠會(huì)出現(xiàn)痛覺過敏，而GAT-1敲除的小鼠明顯的對(duì)疼痛有抗傷害作用[6-7]。鞘內(nèi)注射GAT-1抑制劑NO-711可明顯減輕坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏[8]。另有研究表明，通過強(qiáng)迫游泳激活內(nèi)源性阿片或非阿片依賴的下行痛覺抑制機(jī)制與阻斷GAT-1的功能有關(guān)[9]。

本實(shí)驗(yàn)組前期通過扭體、熱板和熱甩尾等致痛模型研究表明OSR具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[10]，鞘內(nèi)注射OSR可明顯升高福爾馬林致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1 mRNA和蛋白表達(dá)量[11]；側(cè)腦室注射OSR能增加大鼠皮層、海馬GABA免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于福爾馬林所致小鼠舔足潛伏期無(wú)論是Ⅰ相反應(yīng)還是Ⅱ相反應(yīng)，OSR均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，提示OSR的鎮(zhèn)痛作用涉及中樞和外周。OSR可明顯降低小鼠大腦GAT-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞和GAT-1 mRNA表達(dá)，提示OSR的鎮(zhèn)痛機(jī)制與高位中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GAT-1下調(diào)有關(guān)。OSR通過抑制GAT-1的表達(dá)，減少GAT-1對(duì)GABA的重?cái)z取，使神經(jīng)突觸間隙GABA的相對(duì)表達(dá)量增加，增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的中樞抑制作用，抑制痛覺信息的傳遞。OSR的鎮(zhèn)痛機(jī)制明顯與嗎啡不同，可能不會(huì)產(chǎn)生類似于嗎啡的成癮性和耐受性，因此，有關(guān)OSR更詳細(xì)的鎮(zhèn)痛機(jī)制及可能產(chǎn)生的副作用有待于進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室完成，感謝藥理實(shí)驗(yàn)室的各位老師和同學(xué)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的大力支持。)

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Analgesic effect of oxysophoridine and its effect on brain GAT-1 in mice

GAO Jin-xian1,ZHANG Xiu-juan3,YU Jian-qiang2,JIANG Yuan-xu2

(1.DeptofPharmacy,3.DeptofMedicalQualityControl,People′sHospitalofGansuProvince,Lanzhou730000,China;2.DeptofPharmacology，NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Aim To study the analgesic effect of oxysophoridine(OSR) on GABA transporter-1(GAT-1) mRNA expression and its influence on GAT-1 expression in mice.Methods Formalin test was used to detect the analgesic effect of OSR(iv). Immunohistochemistry was taken to inspect the expression of GAT-1 in cerebral cortex and thalamus in mouse brain. The quantitative real-time PCR method was used to inspect the influence of OSR on GAT-1 mRNA expression of brain in mice.Results OSR(500,250, 125 mg·kg-1，iv) could significantly increase the foot-licking latency.OSR(500 mg·kg-1,ip) could significantly decrease the number of GAT-1 immuopositive cells in cerebral cortex and thalamus in mouse brain,and reduce GAT-1 mRNA expression in brain(P<0.01，P<0.05) in the formalin test.Conclusion OSR has a significant analgesic effect, and its analgesic mechanism is related to the GAT-1 expression in mouse brain.

oxysophoridine; formalin;analgesic;GAT-1; GABA;brain

時(shí)間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.044.html

2016-10-25，

2016-12-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30860372)

高進(jìn)賢(1982-)，男，碩士，主管藥師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：gaojx82@163.com; 蔣袁絮(1957-)，女，碩士，教授，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者,E-mail：jiangyuanxu33@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.023

A

1001-1978(2017)03-0407-05

R-332；R284.1；R322.81；R441.1；R971.1