針刺手厥陰經(jīng)穴對心肌缺血再灌注損傷大鼠CRTmRNA表達率的影響*

田岳鳳，袁 葉，王 軍，李雷勇

(1．山西中醫(yī)學院針灸推拿學院，太原 030024;2．山西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，太原 030024; 3．山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，太原 030001)

針刺手厥陰經(jīng)穴對心肌缺血再灌注損傷大鼠CRTmRNA表達率的影響*

田岳鳳1，袁 葉2，王 軍1，李雷勇3

(1．山西中醫(yī)學院針灸推拿學院，太原 030024;2．山西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，太原 030024; 3．山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，太原 030001)

目的:觀察電針手厥陰經(jīng)“內(nèi)關(guān)”“郄門”穴對缺血再灌注損傷過程大鼠心肌組織CRTmRNA表達率的影響，探討經(jīng)穴與臟腑間的特異性聯(lián)系。方法:50只Wistar大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血-再灌注模型組、針刺“內(nèi)關(guān)”治療組、針刺“郄門”治療組以及針刺“合谷”對照組5組各10只。除假手術(shù)組外，其他4組均制備缺血-再灌注動物模型，假手術(shù)組穿線但不結(jié)扎冠狀動脈?！皟?nèi)關(guān)”、“郄門”、“合谷”3組穴位針刺20 min后，結(jié)扎冠狀動脈左前降支40 min，再次針刺上述穴位20 min松扎，恢復冠脈灌流60 min后摘取心臟取心尖部組織，采用RT-PCR方法測定CRTmRNA表達率，實驗過程中心電圖(ECG)全程監(jiān)測。結(jié)果:假手術(shù)組CRTmRNA的表達很低，模型組與“內(nèi)關(guān)”組、“郄門”組比較，CRTmRNA表達率下降非常明顯;模型組與“合谷”組比較，CRTmRNA表達率比較差異無統(tǒng)計學意義;“內(nèi)關(guān)”組與“郄門”組比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論:針刺手厥陰經(jīng)穴可有效促進CRTmRNA的表達，提高CRTmRNA的表達率，減輕胞漿鈣超載對心肌細胞的損傷。

針刺;心肌缺血再灌注損傷;鈣網(wǎng)蛋白;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應

心肌缺血再灌注損傷(I/R)在導致心肌細胞壞死的同時，促發(fā)凋亡細胞，凋亡的出現(xiàn)與Ca2+超載密切相關(guān)。我們以往的研究表明，針刺可明顯降低心肌缺血再灌注損傷細胞內(nèi)Ca2+超載的程度，抑制心肌細胞凋亡。而針刺在心肌細胞內(nèi)Ca2+超載和細胞凋亡之間的影響及作用機制一直是我們思考的問題。本研究以往實驗證實，針刺可明顯提高血清CRT含量，促進CRT表達上調(diào)的基礎(chǔ)上，通過RTPCR技術(shù)檢測針刺手厥陰經(jīng)穴對心肌缺血再灌注損傷CRTmRNA表達率的影響，試圖闡明心包經(jīng)和心之間的特異性聯(lián)系，以豐富中醫(yī)學經(jīng)脈－臟腑相關(guān)理論的內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

50只清潔級Wistar大鼠，體質(zhì)量250 g～300 g，雌雄各半，由山西醫(yī)科大學動物中心提供(許可證號SCXK(晉)2009-0001)。按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血-再灌注模型組、針刺“內(nèi)關(guān)”治療組、針刺“郄門”治療組和針刺“合谷”對照組5組各10只。

1.2 干預方法

心肌缺血再灌注損傷模型制備方法采用我們長期使用經(jīng)典模型［1］。除假手術(shù)組外，其他4組均制備缺血-再灌注動物模型，假手術(shù)組穿線但不結(jié)扎冠狀動脈?！皟?nèi)關(guān)”“郄門”“合谷”3組穴位針刺20 min后，結(jié)扎冠狀動脈左前降支40 min，再次針刺上述穴位20 min，松扎、恢復冠脈灌流60 min后，摘取心臟取心尖部組織，采用 RT-PCR方法測定CRTmRNA表達率。

1.3 儀器與試劑

采用ECG-6511心電圖機將針形電極刺于動物皮下，接標準Ⅱ?qū)?lián)，每次記錄5個心動周期，走紙速度50mm/s，靈敏度10mm/mv，以STⅡ段變化值(結(jié)扎后ST段電位值－結(jié)扎前ST段電位值)反映心肌缺血程度。記錄結(jié)扎前、結(jié)扎后即刻、結(jié)扎后20 min、結(jié)扎后40 min、松扎后即刻、松扎后30 min、松扎后60 min 7個時間段S-T段的變化情況。

寧波新芝科器研究所JY92-2D超聲波細胞粉碎機，德國Heraeus低溫冷凍離心機，eppendorf PCR儀。TransGen Biotech提供 Trizol和 RT-PCR試劑盒。引物由上海生工設(shè)計，瓊脂糖凝膠電泳用德國產(chǎn)UVP(紫外透射儀)凝膠成像系統(tǒng)上掃描，電泳條帶用Photo shop7.0讀取均值。

1.4 標本處理

取大鼠心臟左心室心尖部心肌組織10mm× 7mm×3mm大小，用生理鹽水反復沖洗后濾紙吸盡組織表面水分，電子天平秤取質(zhì)量，取100 mg心肌組織置于液氮罐中。

1.5 RT-PCR檢測

兩步法測定心肌組織CRT含量，對CRTmRNA進行相對定量分析。按照Trizol試劑盒說明進行，實驗由山西醫(yī)科大學實驗中心檢測完成。

觀光農(nóng)業(yè)以農(nóng)業(yè)為基礎(chǔ)，以旅游為手段，以城市為市場，以參與為特點，以文化為內(nèi)涵，它的形式和類型很多，其中規(guī)模較大的主要有5種：觀光農(nóng)園、農(nóng)業(yè)公園、教育農(nóng)園、森林公園和民俗觀光村。

經(jīng)過PCR反應后在凝膠成像系統(tǒng)成像，采用圖像識別分析系統(tǒng)(Photo shop7.0)掃描電泳條帶的光密度。按照以下公式進行計算:RT-PCR產(chǎn)物比值=靶mRNA灰度值/內(nèi)對照(GAPDHmRNA灰度值) ×100%。上述過程需重復3次取其平均數(shù)值。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SAS8.2統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ECG的變化

表1、2顯示，冠狀動脈左前降支未結(jié)扎，各組STⅡ比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)扎后20 min、40 min，各組STⅡ值較結(jié)扎前均有不同程度的提高。缺血再灌注模型組抬高明顯，“內(nèi)關(guān)”組、“郄門”組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，“合谷”組的變化趨勢與模型組相近似，2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。松扎后，抬高的ST段開始回落，30 min和60 min后“內(nèi)關(guān)”組、“郄門”組STⅡ變化值與模型組、“合谷”組比較差異仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表1 各組動物缺血前STⅡ的比較(±s，mv)

表1 各組動物缺血前STⅡ的比較(±s，mv)

組別 例數(shù) 結(jié)扎前FP假 手 術(shù) 組10 0.043±0.031缺 血 -再 灌 注 模 型 組 10 0.036±0.021針 刺 “ 內(nèi) 關(guān) ” 組 10 0.042±0.040 0.68 ＞0.05針 刺 “ 郄 門 ” 組 10 0.037±0.017針 刺“合 谷 ”對 照 組10 0.036±0.025

表2 再灌注過程中STⅡ差值的變化(±s，min)

表2 再灌注過程中STⅡ差值的變化(±s，min)

注:與缺血-再灌注模型組比較:ΔΔP＜0.01;與針刺“合谷”對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例 數(shù) 結(jié)扎后20ˊ 結(jié)扎后40ˊ 松扎后30ˊ 松扎后60ˊ缺血-再灌注模型組 10 0.310±0.045 0.312±0.044 0.274±0.037 0.0260±0.037針 刺“ 內(nèi) 關(guān) ”組 10 0.241±0.026ΔΔ＊＊ 0.249±0.034ΔΔ＊＊ 0.177±0.040ΔΔ＊＊ 0.163±0.041ΔΔ*針 刺“ 郄 門 ”組 10 0.226±0.040ΔΔ＊＊ 0.228±0.046ΔΔ＊＊ 0.159±0.039ΔΔ＊＊ 0.148±0.036ΔΔ*針刺“合谷”對照組 10 0.307±0.057 0.309±0.057 0.260±0.050 0.248±0.051 F 10.14 8.53 18.88 18.79 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 CRTmRNA表達率的變化

表 3圖 1顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織CRTmRNA的表達率很低，與模型組、“合谷”組比較差異顯著(P＜0.05);模型組與“內(nèi)關(guān)”治療組、“郄門”治療組比較，CRTmRNA表達率降低非常明顯(P＜0.01);模型組與“合谷”對照組比較，CRTmRNA表達率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);“內(nèi)關(guān)”組與“郄門”組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，鈣網(wǎng)蛋白(CRT)在缺血缺氧損傷中的作用非常重要，其過度的表達能夠抑制腎小管上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，由此使得胞漿內(nèi)的鈣超載得以減輕［2］。在電誘導犬血栓模型上，冠脈灌流液中加入CRT可防止冠狀動脈左旋支梗塞，顯示鈣網(wǎng)蛋白可能是通過誘導內(nèi)皮細胞NO合成與釋放來預防血栓形成的。徐菲菲等［3］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預處理24 h后心肌細胞內(nèi)鈣網(wǎng)蛋白的表達增加，表明其參與了預處理對心肌細胞的保護。

與上述研究相反，有報道人類胚胎腎細胞中過表達CRT，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+增多，活化鈣調(diào)節(jié)磷酸酶，增加細胞凋亡的敏感性。還有學者報道大鼠H9c2成肌細胞過表達鈣網(wǎng)蛋白，細胞數(shù)量減少，DNA雙鏈斷裂增加，易于發(fā)生凋亡;蛋白磷酸酶(PP2A)表達及活性上調(diào)，提示鈣網(wǎng)蛋白的過表達，改變Ca2+穩(wěn)態(tài)上調(diào)PP2A表達，促進細胞凋亡［4］。實驗結(jié)果的不同是否與細胞類型的不同或是應激刺激的不同有關(guān)，需要進行深入的研究。

表3 各組大鼠心肌組織CRTmRNA表達率比較(±s，%)

表3 各組大鼠心肌組織CRTmRNA表達率比較(±s，%)

注:與假手術(shù)組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與缺血-再灌注模型組比較:△△P＜0.01

組別 例數(shù) CRTmRN FP假 手 術(shù) 組8 0.560±0.095缺血-再灌注模型組 8 0.735±0.123*針 刺 “ 內(nèi) 關(guān) ”組 8 0.955±0.212＊＊△△15.10 ＜0.01針 刺 “ 郄 門 ”組 8 1.058±0.144＊＊△△針刺“合谷”對照組 8 0.776±0.100*

圖1 內(nèi)參基因(307bp)、CRT基因(197bp)RT-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

RT-PCR方法是在蛋白質(zhì)水平進行基因分析直觀、特異的方法，它將特異性的免疫反應、可見的組織化學變化與具有顯像、放大作用的顯微鏡相結(jié)合，簡便、快速地對細胞因子的mRNA進行定性或定量分析［5］。

從RT-PCR實驗結(jié)果可以看出，“內(nèi)關(guān)”組、“郄門”組CRTmRNA表達率明顯上調(diào)，較模型組及“合谷”組均有顯著升高。此項指標的觀察結(jié)果與血清CRT含量的變化及心肌組織CRT蛋白表達的變化相一致［5］，進一步說明經(jīng)穴對靶器官的特異性調(diào)節(jié)作用。

大量研究證明，在缺血－再灌注前后給予預處理，可阻斷細胞的壞死、凋亡過程，減輕缺血再灌注損傷［6］。本項的實驗結(jié)果與相關(guān)文獻報道的高表達鈣網(wǎng)蛋白可對心肌細胞起到保護作用相吻合，反映了鈣網(wǎng)蛋白的高表達對心肌細胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)作用，Ca2+超載的減輕可能是通過鈣網(wǎng)蛋白表達的上調(diào)使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+結(jié)合能力增強，由此起到了保護心肌細胞的作用。對于電針激發(fā)鈣網(wǎng)蛋白參與細胞保護作用的相關(guān)機制我們會進一步研究。

［1］袁葉，田岳鳳，王軍，等．針刺手厥陰心包經(jīng)穴對心肌缺血再灌注損傷大鼠鈣網(wǎng)蛋白的影響［J］．中醫(yī)雜志，2011，52(3): 227-230．

［2］XIA C M，CHEN J，WANG J，et al．Differential expressions of nNOS and iNOS in the rostral ventrolateral medulla induced by electroacupuncture in acute myocardial ischemia rats［J］．Acta Physiologica Sinica，2008，60(4):453-461．

［3］徐菲菲，劉秀華，祝筱梅．鈣網(wǎng)蛋白參與缺氧預處理對氧化應激損傷大鼠成心肌H9C2細胞的保護作用［J］．中國病理生理雜志，2008，24(8):1457-1463．

［4］IHARA YS，URATA YS，GOTO SJ，et al．Role of calreticulin in the sensitivity of myocardiac H9c2 cells to oxidative stress caused by hydrogen peroxide．American Journal of Physiology［J］．Cell Physiology，2006，290(1):208-221．

［5］陳名紅，陳毅堅，葉艷青，等．用半定量RT-PCR法分析基因表達水平的影響因素［J］．貴州農(nóng)業(yè)科學，2009，37(8):28-30．

［6］徐菲菲，劉秀華，張振英，等．低氧后處理誘導鈣網(wǎng)蛋白表達上調(diào)的心肌保護機制［J］．生理學報，2009，61(1):35-42．

Effects of Electroacupuncture at the Points of the Pericardium Meridian in rate of Calreticulin Gene Expression in Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

TIAN Yue-feng1，YUAN Ye2，WANG Jun1，LI Lei-yong3
(1．Department of Acupuncture＆Massage，Shanxi College of TCM，Taiyuan 030024，China; 2．The Affiliated Hospital of Shanxi College of TCM，Taiyuan 030024，China; 3．The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective:To investigate the effects of electroacupuncture(EA)of the points at the Pericardium Meridian of Hand-Jueyin on the changes of gene expression rates of CRTmRNA in myocardial ischemia and reperfusion injury rats so as to explore the specific relation between Meridian and Zangfu．Methods:Fifty Wistar rats anesthetized by 10%urethane were evenly randomized into sham，model，EA-“Neiguan”(PC6)，EA-“Ximen”(PC5)，EA-“Hegu”(LI4)groups．Under artificial respiration，MI/R model was established by ligation of the left descending anterior branch(DAB)of the coronary artery for 40 min，followed by reperfusion for 60 min．EA was applied to the above mentioned acupoints for 20 min，two times altogether．Then，the myocardial sample(below the ligationsite of DAB)of the left cardiac ventricle was taken for observing the changes gene expression of CRTmRNA．Results:The expression of sham group is less．Model group compared with“Neiguan”group，“Ximen”group，CRTmRNA expression is reduced very significant;model group compared with the“Hegu”group，CRTmRNA expression was no significant difference;between“Neiguan”and“Ximen”group there was not significantly different．Conclusions:The points of the Pericardium Meridian can obviously improve the gene expression rate of CRTmRNA，reduce injury caused by the calcium overload of myocardial cell．

Acupuncture;Myocardial ischemia/reperfusion injury;Calreticulin;RT-PCR

R246．9

B

1006-3250(2017)01-0105-03

2016-07-13

國家自然科學基金資助項目(30873240)-針刺對缺血再灌注損傷心肌細胞CaMKⅡ信號傳遞作用及Akt心肌保護作用的研究;山西省自然科學基金資助項目(2010011056-1)-針刺激活Akt信號通路對再灌注損傷心肌細胞凋亡干預機制的研究

田岳鳳(1963-)，女，山西五臺人，教授，博士研究生導師，從事穴位特異性研究。