清熱活血方藥對(duì)CIA大鼠Wnt信號(hào)通路成骨細(xì)胞相關(guān)因子的影響*

李 波，姜 泉，鞏 勛，吳振宇，唐曉頗，楊 卉，焦 娟

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

【實(shí)驗(yàn)研究】

清熱活血方藥對(duì)CIA大鼠Wnt信號(hào)通路成骨細(xì)胞相關(guān)因子的影響*

李 波，姜 泉△，鞏 勛，吳振宇，唐曉頗，楊 卉，焦 娟

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

目的:分析清熱活血方(QRHX)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討清熱活血方藥對(duì)CIA大鼠骨破壞的保護(hù)機(jī)制。方法:SD大鼠40只按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、清熱活血方藥組、依那西普組。通過(guò)滑膜病理切片觀察各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理改變，采用RT-PCR方法對(duì)各組大鼠滑膜DKK-1、β-catenin基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)ELISA檢測(cè)各組大鼠血清DKK-1、β-catenin、TCF、LRP5的蛋白含量。結(jié)果:滑膜病理顯示清熱活血方藥組大鼠滑膜中的炎癥水平較模型組明顯減輕，清熱活血方藥組大鼠滑膜中DKK-1mRNA表達(dá)水平和血清中DKK-1含量較模型組明顯減少，β-catenin mRNA表達(dá)水平及血清β-catenin、TCF、LRP5含量與模型組比較顯著升高。結(jié)論:清熱活血方藥能降低滑膜炎癥水平，抑制Wnt信號(hào)通路中DKK-1細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)β-catenin、TCF、LRP5的表達(dá)，可能通過(guò)作用于Wnt/β-catenin通路在CIA大鼠骨破壞過(guò)程中發(fā)揮骨保護(hù)作用。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;Wnt信號(hào)通路;清熱活血方;骨保護(hù)作用

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜炎和骨質(zhì)破壞為主要病理特征，可以導(dǎo)致全身多系統(tǒng)損害的自身免疫性疾?。?］，發(fā)病以圍絕經(jīng)期女性多見，男女比例為1∶3。目前世界范圍內(nèi)患病率為1%左右，我國(guó)的發(fā)病率約為0.3% ～0.5%［2］。RA的骨破壞進(jìn)程呈高速型，可以引起骨局灶性、關(guān)節(jié)旁性和系統(tǒng)性破壞丟失，是世界上主要致殘性疾病之一［3］。預(yù)防和阻止骨破壞是治療RA的關(guān)鍵和目標(biāo)所在。RA骨破壞是由炎癥局部破骨細(xì)胞分化增加和成骨細(xì)胞功能降低引起，在 RA發(fā)病過(guò)程中骨吸收和骨形成都有不同程度的紊亂，即破骨細(xì)胞因子增加對(duì)RANKL的表達(dá)，因此增加局部破骨細(xì)胞的產(chǎn)生。同時(shí)，過(guò)度表達(dá)的Dickkopf1(Dkk-1)抑制Wnt信號(hào)通路［4］，而Wnt信號(hào)通路是成骨細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)揮作用的主要通路，因此減少成骨細(xì)胞的合成。本實(shí)驗(yàn)立足于成骨細(xì)胞研究其對(duì)Dkk/Wnt信號(hào)通路的作用，旨在從多靶點(diǎn)、多角度闡示清熱活血方藥治療RA骨破壞所發(fā)生護(hù)骨機(jī)制的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及分組

SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量(220±10)g，購(gòu)于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(動(dòng)物合格證編號(hào)BLARC (京)2015-0052)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、清熱活血方藥組、依那西普(Etanercept)治療組。

1.2 試劑及儀器

完全弗氏佐劑5 ml(貨號(hào)7024，批號(hào)130189)，生產(chǎn)廠家(Chondrex，inc);DMSO(貨號(hào)D-5790)，購(gòu)自Sigma公司;免疫源性牛II型膠原(貨號(hào)20313，批號(hào)130135)，生產(chǎn)廠家(Chondrex，inc);手提式均質(zhì)儀(型號(hào)T10 Basic Ultra-turrax，品牌IKA)。

1.3 藥物

清熱活血方中藥制劑由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院科研藥房提供，煎藥室制備成1 g/ml的藥液。注射用依那西普(貨號(hào)S1105，生產(chǎn)批號(hào)G97161)25 mg/瓶，購(gòu)自美國(guó)Pfizer公司，根據(jù)人體用藥量換算，制備成0.5 mg/kg依那西普注射液。

2 方法

2.1 免疫原制備

無(wú)菌條件下，將10 mg牛II型膠原加入至5ml乙酸中完全混勻，隨后于冰凍條件下，將5 ml完全弗氏佐劑緩慢加至牛II型膠原中，用均質(zhì)儀攪拌乳化10 min，制成濃度為1 mg/ml牛II型膠原乳劑。

2.2 CIA大鼠造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，在大鼠右側(cè)尾根部皮下注射0.2 ml牛II型膠原乳劑，進(jìn)行第1次免疫。1周后以同樣方式于大鼠左側(cè)尾根部進(jìn)行第2次強(qiáng)化免疫。

2.3 給藥方法

初次免疫后第10天起給藥，連續(xù)給藥28 d。清熱活血方藥組給予中藥水煎劑(24 g生藥/kg)灌胃，每日1次。依那西普治療組大鼠皮下注射依那西普0.5 mg/kg，每周2次。正常對(duì)照組及模型組給予生理鹽水灌胃2 ml，每日1次，生理鹽水皮下注射0.5 mg/kg，每周2次。

2.4 血液采集

首次免疫后的第38天，以10%的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈無(wú)菌取血，離心后血清置于－80℃冰箱保存待測(cè)。

2.5 滑膜病理切片

無(wú)菌下取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，于10%多聚甲醛溶液中固定48 h，用無(wú)菌水清洗24 h后放到5%硝酸溶液中進(jìn)行脫鈣2周，每周換液2次。脫鈣完全后，重新置于多聚甲醛溶液中固定、石蠟包埋、染色。

2.6 滑膜組織DKK1、β-catenin mRNA檢測(cè)

表1顯示，無(wú)菌條件下取各組大鼠滑膜組織，用RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系得到cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative real-time PCR)，PCR儀檢測(cè)各樣本CT值，比較各組DKK1、β-catenin基因表達(dá)差異。

2.7 細(xì)胞因子測(cè)定

采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中DKK-1、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP-5)、T細(xì)胞因子(TCF)蛋白含量，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

表1 DKK1、β-catenin基因定量PCR引物序列

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜病理分析

圖1顯示，大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜病理切片顯示，正常組大鼠膝骨關(guān)節(jié)囊和滑膜形狀整齊規(guī)則。與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜明顯增多，滑膜組織內(nèi)可見廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜內(nèi)微血管密布擴(kuò)張，厚度增寬，形成血管翳;關(guān)節(jié)囊可見囊性炎癥增生，囊內(nèi)韌帶神經(jīng)損傷，滑膜和纖維組織增生。清熱活血方藥組和依那西普治療組大鼠的膝骨關(guān)節(jié)滑膜同樣可見炎癥細(xì)胞聚集，滑膜和纖維組織增多，關(guān)節(jié)囊囊性炎癥，但與模型組比較滑膜數(shù)量明顯減少，炎癥程度明顯降低。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色病理切片觀察(×40)

3.2 關(guān)節(jié)滑膜DKK1、β-catenin mRNA表達(dá)分析

表2顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜DKK-1mRNA的表達(dá)水平較正常組顯著升高，β-catenin的mRNA表達(dá)水平較正常組顯著降低。清熱活血方藥組和依那西普治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中DKK-1mRNA的表達(dá)水平較模型組顯著降低(P＜0.05);而 β-catenin mRNA表達(dá)水平較模型組明顯升高(P＜0.05)。依那西普治療組與清熱活血方藥組比較，DKK1、βcatenin mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜基因DKK1、β-catenin表達(dá)水平(±s)

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜基因DKK1、β-catenin表達(dá)水平(±s)

注:與正常組比較:#P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05，△P＜0.05

組別 鼠數(shù) DKK-1 β-catenin正 常 組10 1.39±0.23 2.96±0.23模 型 組 10 2.93±0.28# 1.12±0.30#依 那 西 普 組 10 1.72±0.17* 2.13±0.25*清熱活血方藥組 10 1.78±0.44△ 2.49±1.07△

3.3 血清細(xì)胞因子DKK1、β-catenin、TCF和 LRP5的表達(dá)差異

表3顯示，模型組大鼠血清中DKK-1的表達(dá)水平較正常組顯著升高，而β-catenin、TCF和LRP5表達(dá)水平較正常組顯著降低。清熱活血方藥組和依那西普治療組大鼠血清中DKK-1含量較模型組顯著減少(P＜0.05);β-catenin、TCF和LRP5含量較模型組顯著升高(P＜0.05)。依那西普治療組與清熱活血方藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠血清中DKK-1和β-catenin含量(±s)

表3 各組大鼠血清中DKK-1和β-catenin含量(±s)

注:與正常組比較:#P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05，△P＜0.05

組別 鼠數(shù) DKK-1(pg/ml) β-catenin(pg/ml) TCF(pg/ml) LRP5(pg/ml) 10 1.39±0.26 3.15±0.81 1.11±0.96 1.97±0.48模 型 組 10 2.24±0.35# 1.07±0.22# 0.41±0.13# 0.59±0.18#依 那 西 普 組 10 1.16±0.23* 1.78±0.54* 0.79±0.18* 1.19±0.21*清 熱 活 血 方 藥 組 10 1.21±0.33△ 1.63±0.38△ 0.73±0.09△ 1.31±0.25正常組△

4 討論

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成骨細(xì)胞形成過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)效應(yīng)的重要信號(hào)通路［5-6］。β-catenin作為Wnt信號(hào)通路中的中樞性因子發(fā)揮核心作用［7］。當(dāng)Wnt蛋白與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5和6(LPR5/6)及共受體Fizzled受體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，引起 β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度堆積，甚至轉(zhuǎn)入許多細(xì)胞核內(nèi)，與T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子(LEF)產(chǎn)生反應(yīng)，誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因的活化，加速成骨細(xì)胞的生成和反應(yīng)［8-9］。而Dkk1作為Wnt通路的拮抗劑，可以與Wnt蛋白的共同受體LPR5/6發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，導(dǎo)致β-catenin生成減少，抑制成骨細(xì)胞生成和活化，阻礙骨的形成［10］。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-a作為炎癥因子能夠?qū)е翫KK-1分泌增多［11］。本研究選擇可溶性TNF-a受體質(zhì)量組抗體融合蛋白依那西普作為陽(yáng)性對(duì)照，該藥物能與細(xì)胞表面TNF-a受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，減少TNF-a受體的生成作用，降低DKK-1的分泌水平，進(jìn)而減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥水平和骨損壞程度?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究已經(jīng)證實(shí)，依那西普具有延緩RA骨破壞、促進(jìn)新骨形成的作用［12］。本研究檢測(cè)各組大鼠滑膜基因DKK1、β-catenin mRNA轉(zhuǎn)錄水平和血清細(xì)胞因子DKK1、β-catenin的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)清熱活血方藥和依那西普可以有效下調(diào)CIA大鼠滑膜中基因DKK-1的表達(dá)水平和血清中DKK-1蛋白的含量，上調(diào)CIA大鼠滑膜中基因βcatenin的表達(dá)水平和血清中β-catenin、TCF、LRP5蛋白的含量。清熱活血方藥在抑制DKK-1分泌和促進(jìn)β-catenin、TCF、LRP5表達(dá)上與依那西普作用相同，說(shuō)明清熱活血方藥也可能是通過(guò)作用于Wnt/ β-catenin通路在CIA大鼠骨破壞過(guò)程中發(fā)揮骨保護(hù)作用。

當(dāng)前，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的認(rèn)識(shí)主要基于“破骨細(xì)胞”與“成骨細(xì)胞”的骨免疫學(xué)說(shuō)。前期實(shí)驗(yàn)已表明，清熱活血方藥可以作用于OPG/RANKL/ RANK信號(hào)通路，減少炎癥因子和破骨細(xì)胞的分化生成，發(fā)揮一定的骨保護(hù)效應(yīng)［13-14］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究清熱活血方藥對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)清熱活血方藥可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成來(lái)減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞，說(shuō)明清熱活血方藥可能通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的平衡發(fā)揮骨保護(hù)作用。近期研究［15］發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞具有緊密的聯(lián)系，破骨細(xì)胞可以間接地抑制成骨細(xì)胞的活性，減少體內(nèi)骨的形成。清熱活血方藥在抑制破骨細(xì)胞形成和促進(jìn)成骨細(xì)胞形成上同時(shí)發(fā)揮作用，抑制破骨細(xì)胞的同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成，對(duì)RA骨破壞的抑制和骨的重塑發(fā)揮了重要作用。

［1］EWAM，PALEOLOG．The vasculature in rheumatoid arthritis: cause or consequence［J］．Int J Exp Pathol，2009，90:249-261．

［2］王吉波，呂振華．類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:5．

［3］GOSSEC L，DOUGADOS M，GOUPILLE P，et al．Prognostic factors for remission in early rheumatoid arthritis:a multiparameter prospective study［J］．Ann Rheum Dis，2004，63:675-680．

［4］王露霏，白丁，韓向龍．Wnt信號(hào)通路拮抗劑Dkk1調(diào)節(jié)骨代謝的最新進(jìn)展［J］．中國(guó)組織工程研究，2013，17(2):337-341．

［5］ARNETT FC，EDWORTHY SM，BLOCH DA，et al．The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，1988，31(3):315-324．

［6］馬瑩瑩，張育．Wnt信號(hào)通路與RA的骨質(zhì)代謝［J］．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2010，26(12):1143-1145．

［7］ISSACK PS，HELFET DL，LANE JM．Role of Wnt signaling in bone remodeling and repair［J］．HSS J，2008，4(1):66270．

［8］熊雪婷，許碧蓮．Wnt信號(hào)通路在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30(1):13-15．

［9］SANGHA O．Epidemiology ofrheumatic diseases［J］．Rheumatology，2000，39(Suppl2):3-12．［10］許連靜，秦明群．Wnt/Dkk在骨改建中對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)作用［J］．江蘇醫(yī)藥，2010，36:1933-5．

［11］DIARRA D，STOLINA M，POLZER K，et al．Dickkopt-1 is a master regulator of joint remodeling［J］．Nature Ivied，2007，13: 156-63．

［12］劉旸．腫瘤壞死因子-a與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［J］．Labeled Immunoassays＆Clin Med，2003，10(3):174-176．

［13］孔祥英，吳文斌，蘇曉慧，等．風(fēng)濕清對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞OPG，RANKL，TNF-a及IL-17表達(dá)的影響［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，22(11):287-290．

［14］姜泉，周新堯，唐曉頗，等．清熱活血方在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外研究中對(duì)白介素17的影響［J］．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2013，19(8):907-909．

［15］DEFANG Li，JIN LIU，et al．Osteoclast-derived exosomal miR-214-3p inhibits osteoblastic bone formation［J］．Nature communications，2016:1-15．

Effect of Qingre Huoxue Recipe on the Wnt Signal Pathway Related Factors in CIA Rats

LI Bo，JIANG Quan△，GONG Xun，WU Zhen-yu，TANG Xiao-po，YANG Hui，JIAO Juan
(Guang’anmen Hospital，CACMS，Beijing 100053，China)

Objective:To study the effect of QingreHuoxue Recipe(QRHX)on the expression of Wnt signaling pathway related factors in collagen-induced arthritis(CIA)rats，thus exploring the bone protection mechanism．Methods: 40 SD rats were randomly divided into the normal group，the model group，the QRHX group and the etanercept group．The changes of synovium pathomorphology were observed using synovial pathological．The DKK-1 and beta-catenin gene expression level of mRNA in rats synovial were analyzed by using RT-PCR method，and the protein content of DKK-1，beta -catenin，TCF，LRP5 beta in serum were detected by ELISA．Results:Compared with the model group，the synovium inflammation level significantly decreased in the QRHX group，and the DKK-1 mRNA expression in synovial and DKK-1 levels in serum decreased in QRHX group．The beta-catenin gene expression level and serum beta-catenin TCF，LRP5 content increased．Conclusion:QRHX Recipe could reduce the inflammation level，and play the bone protection effects by inhibiting expression of DKK-1 cytokines in the Wnt signaling pathway，increasing the expression of β-catenin，TCF，LRP5，beta cell factors，and promoting the formation of osteoblast．

Rheumatoid arthritis;Wnt signal pathway;Qingre Huoxue Recipe;Bone protection funtion

R285．5

B

1006-3250(2017)01-0075-03

2016-07-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273719)-從DKK/Wnt信號(hào)通路探討清熱活血方藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的護(hù)骨機(jī)制

李 波(1991-)，男，安徽六安人，醫(yī)學(xué)碩士，師從姜泉教授，從事類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床與基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:姜 泉，E-mail:doctorjq@126．com。