紅景天苷對實驗性高血壓大鼠血管功能的影響*

張 涵，陳海琪，賴世龍，張海寧

(廣州醫(yī)科大學，廣州 511436)

紅景天苷對實驗性高血壓大鼠血管功能的影響*

張 涵，陳海琪，賴世龍，張海寧△

(廣州醫(yī)科大學，廣州 511436)

目的:考察紅景天苷對實驗性高血壓大鼠血管功能的改善作用。方法:胸主動脈縮窄法(TAC)制備高血壓模型，觀察長期連續(xù)給予紅景天苷對大鼠血壓、胸主動脈血管反應性、COX1及COX2表達水平的影響，并觀察血管病理改變。結果:紅景天苷干預治療12周降低高血壓大鼠血壓值及死亡率，改善高血壓大鼠胸主動脈對PE的反應性增強及對Ach內(nèi)皮依賴性的血管舒張減弱;上調(diào)高血壓大鼠血管COX1表達水平，抑制COX2表達，并能明顯減少高血壓引起的胸主動脈中膜厚度，減輕血管內(nèi)皮損傷。結論:長期給予紅景天苷治療可明顯改善高血壓大鼠血管功能異常，有效降低血壓，并可能通過抑制血管重構發(fā)揮心血管保護作用。

高血壓;紅景天苷;血管功能;血管重構

高血壓是以體循環(huán)動脈壓增高為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，長期的血壓升高可以影響心、腦、腎等重要器官的功能，是引起猝死的高危因素和導致心血管疾病死亡的主要原因［1-2］。紅景天苷來源于生長在海拔1600～4000 m左右雪域高原的植物紅景天，是紅景天的主要活性成分。在臨床上，紅景天苷制劑已用于急性心肌缺血、心肌衰老、心力衰竭等多種心臟疾病的預防及治療，可明顯減輕心肌缺血損傷程度，改善心衰癥狀，延緩心肌衰老、心律失常和心肌梗死等心臟疾病的發(fā)展，但其具體機制仍不明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)［3-7］，紅景天苷可擴張阻力血管和容量血管，改善微循環(huán)。本課題組以往研究結果也顯示，紅景天苷對離體大鼠胸主動脈血管具有明顯的內(nèi)皮依賴性和非依賴性舒張作用［8］。此次研究進一步利用胸主動脈縮窄法建立實驗性高血壓大鼠模型，觀察紅景天苷長期給藥對高血壓模型大鼠血壓及血管功能的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

圖1顯示，紅景天苷(Salidroside)由南京春秋生物工程公司提供，140223高效液相鑒定純度 ＞98%。

圖1 紅景天苷高效液相色譜圖

1.2 試劑和儀器

乙酰膽堿(Ach)、苯腎上腺素(PE)、吲哚美辛(Indomethacin)均購自Sigma公司，水合氯醛、氯化鉀(KCl)均為國產(chǎn)分析純，COX1、COX2、β-actin抗體購自cell Signaling(CST)。紅景天苷、Ach、PE均用滅菌雙蒸水溶解，吲哚美辛用二甲基亞砜(DMSO)溶解。PowerLab生理記錄儀(北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司)，鼠尾無創(chuàng)血壓測量儀(北京益仁恒業(yè)科技有限公司)，小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量240～260 g，廣東省實驗動物中心提供(批號SCXK(粵)2014-0002)。

1.4 高血壓大鼠模型建立及分組

SD大鼠用10%水合氯醛麻醉后仰臥固定于手術臺上，行氣管插管并將插管連接小動物呼吸機。取前胸正中切口，無菌操作下開胸分離胸腺，推開肺臟暴露主動脈弓，根據(jù)主動脈直徑用4號無菌線在主動脈弓第一與第二分支之間對主動脈進行50%～60%的縮窄(TAC)，結扎確實后逐層關胸。將實驗動物隨機分為假手術組(Sham組)、高血壓組(TAC組)和高血壓+紅景天苷給藥組(Sal組)。Sham組大鼠行開胸暴露心臟，但不行主動脈縮窄;紅景天苷給藥組于胸主動脈縮窄術1 d后開始灌胃給予紅景天苷10 mg·kg－1，每日1次，連續(xù)給藥12周。給藥期間，觀察大鼠的一般情況，記錄各組大鼠死亡數(shù)目，并用鼠尾無創(chuàng)血壓測量儀定期測量大鼠血壓。

1.5 血管功能測定

實驗結束后斷頸處死大鼠，迅速開胸取出胸主動脈，放入氧飽和的 Kerb-Henseleit液(NaCl 118 mmol·L－1，KCl 4.7 mmol·L－1，NaHCO325 mmol· L－1，KH2PO41.2 mmol·L－1，MgCl21.2 mmol·L－1，CaCl225 mmol·L－1，Glucose 11 mmol·L－1)中并置于冰上，去除動脈周圍結締組織后制備長約3～4 mm的內(nèi)皮完整及無內(nèi)皮的血管環(huán)，連接張力換能器，靜息張力緩慢升至2 g，用PowerLab/4SP生物信號記錄分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。以0.1 μmol·L－1Ach引起1 μmol·L－1PE預收縮的血管環(huán)舒張達到15%～20%，且1 μmol·L－1Ach舒張達到60%為內(nèi)皮完整的判斷標準;以0.1 μmol·L－1Ach舒張小于1%且1 μmol·L－1Ach舒張小于10%為內(nèi)皮去除干凈的判斷標準。保留符合標準的血管環(huán)用于觀察各組血管環(huán)對PE的收縮反應及Ach的舒張反應，并觀察0.01 mmol·L－1吲哚美辛預處理后，各組血管環(huán)對PE收縮血管強度的影響。

圖2 紅景天苷對高血壓大鼠血壓的影響注:與Sham組比較:*P＜0．05;與TAC組比較:#P＜0．05

1.6 蛋白電泳

取大鼠胸主動脈，加入RIPA裂解緩沖液制備組織勻漿提取組織蛋白，裂解物在4℃、12 000×g離心5 min，吸取上清進行BCA蛋白定量。取等量蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，將電泳分離的蛋白轉移到PVDF膜上，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST封閉PVDF膜1 h，隨后加入一抗 (1∶1 000)4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入相應的二抗室溫孵育1 h，TBST再次洗膜后用化學發(fā)光法檢測蛋白水平，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

1.7 組織病理學檢查

實驗結束后，采集血管標本制備血管組織切片，行HE染色觀察血管病理變化。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀況、死亡率及血壓

圖2顯示，在實驗過程中，假手術組大鼠精神狀態(tài)、飲食、活動如常;模型組大鼠從8周開始陸續(xù)出現(xiàn)少動、松毛、進食減少、端坐呼吸、四肢皮下水腫、口鼻處出現(xiàn)粉紅色分泌物等癥狀;紅景天苷給藥組大鼠較模型組癥狀明顯減輕。實驗期間，假手術組大鼠無死亡(0/12)，模型組、紅景天苷給藥組死亡率分別為53.33%(8/15)和15.38%(2/13)，紅景天苷給藥組死亡率明顯較模型組低(P＜0.05)。實驗過程中，模型組及紅景天苷給藥組大鼠的血壓隨其自然病程均明顯上漲，但模型組各周血壓上漲的幅度明顯大于紅景天苷給藥組。

2.2 長期給予紅景天苷治療對高血壓大鼠PE誘導的胸主動脈收縮反應的影響

圖3顯示，取3組大鼠胸主動脈分別制備保留或去除內(nèi)皮的血管環(huán)，分別給予梯度濃度的 PE (10－8～10－4mol·L－1)以觀察血管的收縮反應。結果顯示，各組血管環(huán)對PE誘導的縮血管反應均呈濃度依賴性。但與假手術組比較，模型組血管對PE誘導的血管收縮反應明顯增強，而長期給予紅景天苷治療明顯降低高血壓大鼠血管對PE誘導血管環(huán)的收縮反應。與保留內(nèi)皮血管環(huán)比較，各組去除內(nèi)皮血管環(huán)的收縮曲線明顯左移，但假手術組和紅景天苷組收縮幅度增加較模型組更為明顯，PE在10－5～10－4mol·L－1時，假手術組收縮增加幅度分別為48.1%和28.4%，紅景天苷組25.7%和23.2%，而模型組19.3%和14.1%，提示血管內(nèi)皮功能異?？赡苁歉哐獕捍笫髮s血管物質(zhì)反應性增高的原因之一，紅景天苷降低PE誘導血管環(huán)的收縮作用與保護內(nèi)皮有關。

圖3 PE誘導各組血管環(huán)的收縮反應

2.3 吲哚美辛對PE誘導主動脈收縮反應的影響

圖4顯示，取3組大鼠胸主動脈制備保留內(nèi)皮的血管環(huán)，預先用0.01 mmol·L－1吲哚美辛處理血管環(huán)10 min后，再加入不同濃度的PE，觀察血管環(huán)的收縮反應。結果顯示，吲哚美辛預處理均可明顯增強3組PE誘導血管環(huán)的收縮反應。但與模型組比較，假手術組和紅景天苷組增加更為明顯，PE在10－6～10－4mol·L－1時，假手術組收縮增加幅度分別為 31.0%、38.6%和 16.4%，紅景天苷組為18.5%、18.7%和 15.8%，而模型組為 3.8%、11.2%和5.3%，提示紅景天苷降低PE誘導血管環(huán)的收縮作用與內(nèi)皮產(chǎn)生的前列腺素(PG)有關。

圖4 吲哚美辛對PE引起血管收縮反應的影響

2.4 長期給予紅景天苷治療對高血壓大鼠主動脈內(nèi)皮依賴性舒張反應的影響

圖5顯示，取3組大鼠胸主動脈制備保留內(nèi)皮的血管環(huán)，分別加入1 μmol·L－1PE誘導其收縮，然后給予梯度濃度的Ach(10－9～10－4mol·L－1)以觀察血管的舒張反應。結果顯示，各組血管環(huán)均對Ach呈濃度依賴性舒張反應，但Ach引起模型組的血管環(huán)舒張反應較假手術組明顯減弱，而長期給予紅景天苷治療明顯改善Ach引起的血管環(huán)舒張反應。提示模型組大鼠血管內(nèi)皮受損，而紅景天苷可以保護高血壓大鼠內(nèi)皮免受損傷。

2.5 紅景天苷對血管COX1、COX2表達影響

圖6顯示，模型組大鼠胸主動脈COX1表達水平明顯降低，COX2表達水平明顯增加;而給予紅景天苷治療后，血管 COX1表達水平被顯著上調(diào)，COX2表達有所下降。提示紅景天苷可能通過上調(diào)血管內(nèi)皮產(chǎn)生COX1，下調(diào)COX2發(fā)揮其舒張血管的作用。

2.6 組織病理學

圖7顯示，血管標本HE染色顯示，假手術組大鼠血管內(nèi)皮完整，彈性膜排列整齊，界限明晰;模型組大鼠血管壁顯著增厚，內(nèi)皮損傷，彈性膜層數(shù)顯著增多且排列紊亂、界限不清，有較多纖維結蹄組織增生，細胞核多且散亂分布;而紅景天苷給藥組血管管壁增厚但程度不及模型組，內(nèi)皮略有損傷，彈性膜層數(shù)稍增多，排列可分清層次，組織增生及細胞核分散程度均較模型組明顯改善。

3 討論

紅景天是近年開發(fā)的適應原樣藥物，具有抗缺氧、抗微波輻射、增強免疫及保護心腦血管等藥理作用。紅景天苷是其主要的有效成分，多項研究顯示，紅景天苷可以改善心肌缺血－再灌注、冠心病、心力衰竭、高血壓、心律失常等多種心血管疾病的病理學過程［3-7］。本研究中筆者也觀察到，長期給予紅景天苷治療可以明顯降低高血壓大鼠的收縮壓和舒張壓，改善由長期血壓升高引發(fā)的大鼠慢性心衰體征，降低大鼠死亡率，表明紅景天苷對高血壓大鼠具有良好的心血管保護作用。

圖5 Ach誘導的血管環(huán)舒張反應

圖6 各組血管COX1及COX2表達

圖7 各組血管組織切片HE染色(400×)

持續(xù)的血管功能異常是高血壓維持、惡化并導致靶器官損傷的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性、腎性等多種高血壓動物模型及高血壓患者存在血管反應性異常［9］。本研究中筆者觀察到，胸主動脈縮窄法誘導的高血壓大鼠胸主動脈對PE引起的收縮反應明顯增強，而對Ach的內(nèi)皮依賴性舒張明顯減弱。長期給予紅景天苷治療可以有效降低高血壓大鼠血管對PE的反應性，改善Ach血管內(nèi)皮依賴性舒張障礙，提示紅景天苷降低血壓保護心血管作用與改善血管功能異常有關。

眾多研究表明［10］，血管內(nèi)皮在介導正常的血管舒縮功能中發(fā)揮關鍵作用。已研究發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮源性舒血管物質(zhì)主要有NO和PGI2。以往筆者在對離體胸主動脈舒張作用的研究中發(fā)現(xiàn)［8］，NOS的抑制劑L-NAME對紅景天苷的舒血管作用無明顯影響，而Indomethacin預處理明顯減弱紅景天苷的血管舒張作用，提示紅景天苷的舒張血管作用部分與血管內(nèi)皮COX產(chǎn)生的PGI2有關，而NO-cGMP途徑可能并沒有參與紅景天苷的舒張血管作用。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，吲哚美辛預處理使紅景天苷降低PE誘導血管環(huán)的收縮作用明顯減弱，而L-NAME對此過程并無明顯影響(數(shù)據(jù)未顯示)，因此可以推斷紅景天苷改善高血壓大鼠血管功能的作用與調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴的PGs合成有關。已有研究資料表明［11］，生成PGs的COX亞型主要有COX1、COX2及COX3 3種亞型，COX1屬于結構型，主要在腎、血管、胃等組織中持續(xù)表達，血管內(nèi)皮中經(jīng)COX1生成的PGs(主要是PGI2)參與調(diào)節(jié)血管舒縮、外周血管阻力等生理活動，對機體穩(wěn)態(tài)的維持有重要意義;COX2屬于誘導型，主要在炎癥局部被誘導表達，與緩激肽等物質(zhì)協(xié)同產(chǎn)生致炎作用;COX3亦系固有表達模式，其表達因組織而異。本研究中COX表達的結果顯示，高血壓大鼠胸主動脈COX1表達水平明顯降低，COX2表達水平明顯增加;而經(jīng)紅景天苷干預治療后，血管COX1表達水平較模型組被顯著上調(diào)，COX2表達明顯降低，與本研究結果一致。Pooja等［12］亦研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰紅景天醇提物能夠顯著抑制COX2和磷脂酶A2(PLA2)等與炎癥相關的酶系，進而發(fā)揮抗炎作用，提示通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮不同亞型COX的表達，使內(nèi)皮依賴性舒張反應增加，可能是紅景天苷改善血管功能、降低血壓的主要機制之一。

高血壓血管重構是引發(fā)血管功能異常的結構基礎及基本機制，主要表現(xiàn)為由細胞的增殖、遷移、凋亡以及基質(zhì)成分合成、降解及重新排列等過程引起的血管壁增厚及組織學異常［13-14］。本研究中筆者觀察到，高血壓模型大鼠血管壁顯著增厚，內(nèi)皮損傷脫落，中層平滑肌膜層數(shù)顯著增多且排列紊亂，并伴有纖維結蹄組織增生。而長期給予紅景天苷治療可以明顯減少胸主動脈中膜厚度，并減輕血管內(nèi)皮損傷，表明紅景天苷可能通過抑制血管重構、改善血管功能，從而降低血壓發(fā)揮其心血管保護作用，但其作用機制有待深入研究。

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Effects of long-term administration of Salidroside on vascular function in experimental hypertension rats

ZHANG Han，CHEN Hai-qi，LAI Shi-long，ZHANG Hai-ning△
(Department of Pharmacology，Guangzhou Medical University，Guangzhou 511436，China)

Objective:To investigate the effects of long-term administration of 10 mg/kg of Salidroside on vascular function in experimental hypertension rats．Methods:Male Sprague-Dawley(SD)rats were subjected to thoracic aorta coarctation(TAC)to induce hypertension．One day later，rats in Salidroside groups received an oral administration of 10 mg/kg of Salidroside per day for 12 weeks．The effects of Salidroside were valued by monitoring the blood pressure，determining the vascular functions of thoracic aorta，the expression of COX1and COX2 in thoracic aorta and the histopathological changes of aorta．Results:Compared with model rats，Salidroside treatment significantly lowered the rat mortality and the blood pressure，and ameliorated the vascular function of thoracic aorta as evidenced by inhibiting vascular contraction in response to PE and improving the vasodilation in response to Ach．While，the inhibitory effect of Salidroside on vasoconstriction was significantly reduced by pretreatment of indomethacin．Salidroside administration also increased COX1 expression，but inhibited the expression of COX2 in aorta，which was reduced and increased in model group，respectively．Furthermore，the increased aortic intima-media thickness and vascular endothelial injury induced by hypertension were either reduced by long-term administration of Salidroside．Conclusion:Long-term administration of Salidroside can reduce blood pressure and exert cardiovascular protective effects possible through inhibiting the vascular remodeling and improving vascular functions

Hypertension;Salidroside;vascular function;vascular remodeling

R544．1

B

1006-3250(2017)01-0071-04

2015-07-27

廣州市教育局基金資助項目(10A179)-Th17細胞/ CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞免疫調(diào)節(jié)失衡在心衰炎癥反應中的作用;2015年“攀登計劃”廣東省大學生科技創(chuàng)新培育專項資金資助項目(pdjh2015b0444)-紅景天苷舒張血管的機制及其對壓力超負荷誘導的心衰的防治作用研究;2014年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201410570008)-紅景天苷舒張血管的機制及其對壓力超負荷誘導的心衰的防治作用研究

張 涵(1993-)，女，山西太原人，在讀本科，從事基礎醫(yī)學研究。

△通訊作者:張海寧，副教授，從事心血管藥理研究，Tel:020-37103267，E-mail:zhanghn_gz@126．com。