子午流注納甲法對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠腦區(qū)NSE、NGF、bFGF的影響*

王亞軍，方曉麗，黃春換，何應(yīng)學(xué)，劉丁龍，高 原

(1．甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000;2．甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000)

子午流注納甲法對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠腦區(qū)NSE、NGF、bFGF的影響*

王亞軍1，方曉麗1，黃春換1，何應(yīng)學(xué)1，劉丁龍2，高 原1

(1．甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000;2．甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000)

目的:通過(guò)制作大鼠大腦中動(dòng)脈永久性閉塞模型，觀察不同時(shí)段NSE、NGF、bFGF的表達(dá)變化，探究子午流注針?lè)▽?duì)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)源性激活作用及其機(jī)制，從而為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。方法:選用體質(zhì)量200～250 g的144只Wistar大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、手術(shù)組、辨證取穴組(簡(jiǎn)稱辨證組)和納甲法組(簡(jiǎn)稱納甲組)5大組各45只動(dòng)物，再將5大組動(dòng)物根據(jù)針刺治療時(shí)間的長(zhǎng)短，在各組內(nèi)再隨機(jī)分為術(shù)后6 h、3、7、14、21 d 5個(gè)小組，其中每小組各8只動(dòng)物。參照Longa法建立大腦中動(dòng)脈栓塞模型局灶性缺血模型(MCAO)。治療于實(shí)驗(yàn)第2天開(kāi)始針灸治療，每日同一時(shí)間治療。常規(guī)辨證組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選穴，選取水溝、合谷和三陰交用平補(bǔ)平瀉法，每天1次，每次留針30 min。納甲組根據(jù)鄭魁山《子午流注與靈龜八法》所記載的徐氏子午流注納甲法，依日按時(shí)開(kāi)穴針刺治療，手法與留針時(shí)間同辨證組。處死動(dòng)物觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)病理變化，用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)大腦勻漿中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)濃度。結(jié)果:與正常組比較MCAO組大鼠的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受損，與正常組比較MCAO大鼠大腦的NSE、NGF、bFGF均呈現(xiàn)先升高再降低的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，各治療組均可抑制NSE的升高，增加NGF、bFGF的含量，其作用效應(yīng)也呈現(xiàn)出同樣的先升高再降低動(dòng)態(tài)表達(dá)變化規(guī)律，其中子午流注納甲法組、綜合組作用在早期優(yōu)于常規(guī)組。結(jié)論:針刺能促進(jìn)MCAO大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)修復(fù)，促進(jìn)MCAO大鼠缺血側(cè)大腦勻漿NGF、bFGF的表達(dá)，抑制NSE的表達(dá)，納甲組、聯(lián)合組效果優(yōu)于常規(guī)針刺。針刺在缺血早期促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞的激活、增殖、分化作用更明顯，提示針刺早期干預(yù)的作用更加明顯。

電針;MACO模型;神經(jīng)干細(xì)胞;NSE;神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，社會(huì)人口壽命延長(zhǎng)，老齡化進(jìn)程加快，國(guó)內(nèi)缺血性腦血管病的比例也越來(lái)越高，腦血管病具有極高的發(fā)病率、病殘率、病死率和復(fù)發(fā)率。針灸治療缺血性腦血管病效果良好，能夠促進(jìn)患者的神經(jīng)功能康復(fù)，從而提高生存質(zhì)量。但是研究發(fā)現(xiàn)，針灸的治療效果受多種因素影響，包括中風(fēng)病介入時(shí)機(jī)、針刺刺激量、2次針刺之間的時(shí)間間隔、擇時(shí)針灸等。相關(guān)研究表明，子午流注針?lè)ㄖ委熑毖阅X血管病療效良好，能夠明顯提高患者的生存質(zhì)量，并能縮短針刺治療時(shí)間，改變血流變學(xué)、免疫功能而發(fā)揮作用，提示子午流注針?lè)ㄊ侵档眠M(jìn)一步研究的方向之一［1］。以往的研究主要集中在臨床研究上，實(shí)驗(yàn)研究(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))卻比較少［2］。本研究旨在進(jìn)一步探索子午流注針?lè)ㄖ委熑毖阅X血管病與常規(guī)針刺方法的療效差異，進(jìn)而揭示其微環(huán)境的變化，探討其治療缺血性腦血管病的促神經(jīng)再生機(jī)理，從而為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)SD雄性成年大鼠144只(合格證號(hào)0001062，許可證號(hào)SCXK (甘)2011-0001)，體質(zhì)量(200±20)g，適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器

多聚甲醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所(20121001);水合氯醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所(20110305);鼠抗brdu單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司提供;NSE、NGF、bFGF ELISA試劑，武漢博士德生物工程有限公司提供;石蠟切片機(jī)Leitz1410型德國(guó);光學(xué)顯微鏡 BX60型，日本OLYMPUS公司;酶標(biāo)儀680型，美國(guó) Bio-Red(伯樂(lè))公司;洗板機(jī)1575型，美國(guó) Bio-Red(伯樂(lè))公司;數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)BI-2000，成都泰盟;針灸針30號(hào)華佗牌1寸美容針，蘇州針灸器械廠。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 將體質(zhì)量(200±20)g的144只SPF級(jí)SD健康雄性大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、模型組、常規(guī)針刺組、納甲法組(簡(jiǎn)稱納甲組)和常規(guī)針刺組+納甲法組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)6大組，按照針刺治療時(shí)間的長(zhǎng)短每組再隨機(jī)分為術(shù)后6 h，3、7、14、21 d 5個(gè)時(shí)間段亞組共18小組，每小組8只大鼠。

1.3.2 模型復(fù)制 參考改良的Zea-Longa［3］等方法，所有大鼠均選擇右側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCA)區(qū)作為梗死側(cè)，大鼠在10%水合氯醛(30 mg/100 g)腹腔麻醉下，取仰臥位固定于鼠板上，在頸部正中做長(zhǎng)約2 cm的縱行切口，鈍性剝離皮下筋膜、肌肉及甲狀腺，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)及分支頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、游離頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，分別在CCA近心端、ECA及CCA遠(yuǎn)心端掛線備用，用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉 ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。之后在CCA上距分叉部4 mm處剪一小口，將栓線插入至ICA，扎緊CCA遠(yuǎn)心端的線以固定栓線，松開(kāi)動(dòng)脈夾直至遇到少許阻力為止。從CCA分叉部起插入深度約為18～19 mm，縫合傷口單籠飼養(yǎng)觀察。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。成模后大鼠在20℃環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和水。參照Z(yǔ)ea-Longa［3］的5分制神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于大鼠清醒后進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分在1～3分的大鼠用于本實(shí)驗(yàn)，其他剔除。

1.3.3 治療 由于采用子午流注納甲法，6 h組治療于術(shù)后(約1 h)大鼠清醒即開(kāi)始治療，3 d組和7 d組在第2天開(kāi)始治療，每日同一時(shí)間治療1次;穴位定位參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸分會(huì)華興邦等制定的《常用動(dòng)物腧穴圖譜》［4］;針刺深度以穴位而定，采用平補(bǔ)平瀉法，每次留針20 min;30號(hào)1寸華佗牌美容針灸針，具體如下。

正常組、假手術(shù)組和模型組每日只進(jìn)行相同抓取，同期同步飼養(yǎng)，不作其他任何治療。常規(guī)針刺組百會(huì)穴(頂骨正中)向后斜刺2 mm，合谷(前肢第一和第二掌骨之間)直刺深度1 mm，三陰交(后肢內(nèi)踝尖直上10 mm)直刺深度5 mm，選用30號(hào)1寸華佗牌無(wú)菌美容針灸針，留針20 min，針刺每日1次。納甲組根據(jù)鄭魁山［5］《子午流注與靈龜八法》所記載徐鳳“子午流注納甲法逐日按時(shí)開(kāi)穴法”，依“陽(yáng)日陽(yáng)時(shí)開(kāi)陽(yáng)經(jīng)之穴，陰日陰時(shí)開(kāi)陰經(jīng)之穴”的原則，于每日辰時(shí)或巳時(shí)納甲法按時(shí)開(kāi)穴(見(jiàn)表1)針刺治療，時(shí)間以當(dāng)?shù)貢r(shí)間為準(zhǔn)，手法與留針時(shí)間等同常規(guī)針刺組一致。

表1 每日辰時(shí)或巳時(shí)開(kāi)穴表

聯(lián)合組聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)針刺組和納甲組的治療方法。取穴同時(shí)選取常規(guī)針刺組和納甲組所選之穴，手法與留針時(shí)間等同常規(guī)針刺組和納甲組一致。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo) 分別在術(shù)后6 h、第3天、第7天、第14天、第21天取出組內(nèi)相應(yīng)小組的動(dòng)物進(jìn)行取材。將大鼠用乙醚麻醉，仰臥位固定四肢于手術(shù)臺(tái)上，行心臟灌注取右腦組織，放入4%多聚甲醛緩沖固定液過(guò)夜、固定。分別在術(shù)后6 h、第3天、第7天、第14天、第21天取出組內(nèi)相應(yīng)小組的動(dòng)物進(jìn)行取材實(shí)驗(yàn)結(jié)束，動(dòng)物以10%的水合氯醛3.5 mL/ kg腹腔麻醉后，迅速斷頭開(kāi)顱取腦，將右側(cè)腦組織用4℃生理鹽水，迅速制成1∶9勻漿液，離心(3000 r/min)15 min，取上清液低溫冷凍，用于檢測(cè) NSE、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量。

①腦組織HE染色:制作病理切片，常規(guī)包埋，脫臘，行蘇術(shù)素一伊紅HE染色。觀察各組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)缺血神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，壞死現(xiàn)象。②ELISA法檢測(cè):NSE、NGF，bFGF，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，正態(tài)分布且方差齊性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用其項(xiàng)下Dunnetf’s T3檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MACO模型大鼠腦組織HE染色病理變化

光鏡下缺血腦組織大腦海馬CA1區(qū)變化如下:正常組大鼠海馬細(xì)胞層次分明，細(xì)胞排列有序，結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量多，細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核圓形呈淡染，細(xì)胞周圍間隙無(wú)水腫。假手術(shù)組腦神經(jīng)細(xì)胞同正常組，未見(jiàn)明顯異常變化。模型組缺血側(cè)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞數(shù)量較少，染色淺，細(xì)胞變性壞死，表現(xiàn)為核碎裂、溶解、核固縮、胞漿深染、間質(zhì)水腫，神經(jīng)元細(xì)胞和小血管周圍可見(jiàn)空隙，梗死灶中心有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膠質(zhì)細(xì)胞少量增生。針刺治療組與模型組比較，治療組腦組織神經(jīng)細(xì)胞水腫、變性、壞死現(xiàn)象減輕，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多;納甲組、聯(lián)合組病理改變減輕，膠質(zhì)細(xì)胞增生較多，其中納甲組與聯(lián)合針刺組比較病理改變差異不明顯。

2.2 針刺對(duì)大鼠腦組織勻漿NES含量的影響

與正常對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠腦組織勻漿NSE含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);MCAO模型組大鼠腦組織勻漿NSE含量顯著上升(P＜0.01)，說(shuō)明腦缺血造?？纱龠M(jìn)模型大鼠腦組織勻漿NSE含量。

與模型對(duì)照組比較，常規(guī)針刺組、納甲組和聯(lián)合組均可使大鼠腦組織勻漿NSE含量表達(dá)顯著下降( P＜0.05或P＜0.01);與常規(guī)針刺組比較，納甲組和聯(lián)合組大鼠不包括12 d各時(shí)間點(diǎn)(21 d時(shí)間點(diǎn)，常規(guī)針刺組、納甲組和聯(lián)合組無(wú)明顯差異)，腦組織勻漿NSE含量的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)或P＜0.05)。與納甲組比較，聯(lián)合組大鼠腦組織NSE含量的表達(dá)降低差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明針刺可以降低鼠腦組織勻漿NSE含量。

組內(nèi)同組不同時(shí)段比較，模型大鼠腦組織勻漿NSE含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(P＜0.01)，3 d時(shí)含量達(dá)到峰值。模型大鼠腦組織NSE含量的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨時(shí)間推移，各組大腦海馬NSE的表達(dá)在6 h、3 d時(shí)段呈上升趨勢(shì)，均是后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)高于前一時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05);7、14、21 d時(shí)段呈下降態(tài)勢(shì)，均是后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)低于前一時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但與14 d比較，21 d的常規(guī)針刺組、納甲組和聯(lián)合組的NSE無(wú)明顯差異。

表2 大鼠腦組織勻漿NSE含量(ng/dl，±s)

表2 大鼠腦組織勻漿NSE含量(ng/dl，±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05;各個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間與模型組比較:★P＜0.05;與常規(guī)組比較:#P＜0.05;與納甲組比較:◇P＜0.05。同組內(nèi)與6 h比較:▲P＜0.05;與3 d比較:■P＜0.05;與7 d比較:⊙P＜0.05;與14 d比較:○P＜0.05

組 別 鼠數(shù)6 h 3 d 7 d 14 d 21 d空 白 組 8 31.70±3.45 30.69±2.33 32.06±5.36 34.06±5.38 35.14±2.42假手術(shù)組 8 30.72±1.33 35.19±1.35▲ 31.81±8.31 30.21±1.97 33.12±3.74模 型 組 8 65.09±1.47* 81.57±2.26＊▲ 70.45±3.82＊■ 50.12±3.23＊⊙ 48.75±3.19*常 規(guī) 組 8 54.39±2.51★ 68.57±4.18★▲ 60.33±4.38★■ 37.57±6.24★⊙ 35.36±1.85★納 甲 組 8 42.34±3.71★# 54.34±2.60★#▲ 46.19±2.89★#■ 36.26±2.09★#⊙ 35.40±1.43★聯(lián) 合 組 8 39.12±4.23★★# 52.73±1.67★★#▲ 44.42±2.42★★#■ 36.58±3.34★★⊙ 35.67±3.52★★

2.3 針刺對(duì)大鼠腦組織勻漿NGF含量的影響

組間比較，與正常對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠腦組織勻漿NGF含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MCAO模型組大鼠腦組織勻漿中NGF含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)，說(shuō)明造?？纱龠M(jìn)NGF的表達(dá)。

表3 大鼠腦組織勻漿NGF含量pg/ml(±s)

表3 大鼠腦組織勻漿NGF含量pg/ml(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05;各個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間與模型組比較:★P＜0.05;與常規(guī)組比較:#P＜0.05;與納甲組比較:◇P＜0.05。同組內(nèi)與6 h比較:▲P＜0.05;與3 d比較:■P＜0.05;與7 d比較:⊙P＜0.05;與14 d比較:○P＜0.05

組 別 鼠數(shù)6 h 3 d 7 d 14 d 21 d正 常 組 8 14.93±2.14 14.88±2.16 15.20±2.02 14.96±1.99 15.97±1.15假 手 術(shù) 組 8 15.09±3.46 15.15±1.86 14.78±2.17 14.90±3.15 15.12±3.53模 型 組 8 20.52±2.89* 23.52±2.37* 28.65±2.69* 19.31±1.25⊙ 16.03±1.43常 規(guī) 組 8 28.16±2.64★ 30.67±1.47★▲ 36.35±4.21★■ 27.87±4.13★⊙ 24.62±3.61★納 甲 組 8 35.60±2.15★# 40.60±4.75★#▲ 45.02±3.60★#■ 35.26±2.52★#⊙ 30.72±2.27★#聯(lián) 合 組 8 37.60±3.14★★# 40.23±3.90★★#▲ 43.75±2.16★★#■ 42.20±1.89★★#⊙ 38.02±2.36★#

與模型組比較，常規(guī)組、納甲組、綜合組的NGF含量上升有顯著差異 (P＜0.05);與常規(guī)組比較，納甲組、綜合組NGF含量上升有顯著差異 (P＜0.05)，與納甲組比較，綜合組NGF含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明針刺可以升高鼠腦組織勻漿NGF含量。

組內(nèi)同組不同時(shí)段比較，在6 h及3 d、7 d時(shí)段，模型大鼠腦組織勻漿NGF含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(P＜0.01)，7 d時(shí)含量達(dá)到峰值。14 d、21 d時(shí)段，模型大鼠腦組織NGF含量表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

隨時(shí)間推移，在6 h及3 d、7 d時(shí)段，各治療組大腦NGF的表達(dá)呈增加趨勢(shì)，均是后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)高于前一時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);14 d、21 d時(shí)段，腦組織NGF含量表達(dá)呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05)。但與14 d比較，21 d的常規(guī)針刺組、納甲組和聯(lián)合組的NGF含量表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 針刺對(duì)大鼠腦組織勻漿bFGF含量的影響

組間與正常對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠腦組織勻漿NGF含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;MCAO模型組大鼠腦組織勻漿中bFGF含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明造?？纱龠M(jìn)bFGF的表達(dá)。

表4 大鼠腦組織勻漿bFGF含量(ng/L，±s)

表4 大鼠腦組織勻漿bFGF含量(ng/L，±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05;各個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間與模型組比較:★P＜0.05;與常規(guī)組比較:#P＜0.05;與納甲組比較:◇P＜0.05(同組內(nèi))，與6 h比較:▲P＜0.05;與3 d比較:■P＜0.05;與7 d比較:⊙P＜0.05;與14 d比較:○P＜0.05

組 別 鼠數(shù)6 h 3 d 7 d 14 d 21 d正 常 組 8 86.43±7.27 87.13±5.78 88.22±12.54 84.71± 8.56 87.90±10.83假 手 術(shù) 組 8 89.67±8.19 85.43±7.67 86.45±11.83 83.87± 6.25 88.54± 7.36模 型 組 8 102.20±4.58* 118.28±9.01＊▲ 129.52±13.46＊■ 110.74±12.14＊⊙ 91.14±10.80*常 規(guī) 組 8 118.45±3.14★ 134.30±3.48★▲ 145.70± 9.382★■ 128.57±11.23★⊙ 112.15±10.33★納 甲 組 8 134.82±6.50★# 151.10±4.15★#▲ 164.37± 6.49★#■ 146.23±13.40★#⊙ 130.87± 8.13★#聯(lián) 合 組 8 140.02±7.57★★# 159.65±5.50★★#▲ 169.71± 3.13★★#■ 151.82±13.40★★#⊙ 136.87± 6.52★★#

與模型組比較，常規(guī)組、納甲組、綜合組bFGF含量上升差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與常規(guī)組比較，納甲組、綜合組bFGF含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，納甲組、綜合組，納甲組、綜合組NGF含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組內(nèi)比較，在6 h、3 d、7 d時(shí)段，模型大鼠腦組織勻漿bFGF含量呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)(P＜0.01)，7 d時(shí)含量達(dá)到峰值。14 d、21 d時(shí)段，模型大鼠腦組織NGF含量表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

隨時(shí)間推移，在6 h、3 d、7 d時(shí)段各治療組大腦bFGF的表達(dá)均呈增加的趨勢(shì)，均是后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)高于前一時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);14 d、21 d時(shí)段，腦組織bFGF含量的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但與14 d比較，21 d的常規(guī)針刺組、納甲組和聯(lián)合組的bFGF的含量表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

缺血性腦血管疾病屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，是針灸治療的有效病癥之一。相關(guān)臨床研究顯示，時(shí)間因素是影響針灸治療中風(fēng)的療效因素之一，包括中風(fēng)病介入時(shí)機(jī)、針刺刺激量、2次針刺之間的時(shí)間間隔、擇時(shí)針灸等。子午流注針?lè)ㄊ菗駮r(shí)針灸的方法之一，是按照人體氣血虛衰的周期性應(yīng)對(duì)自然界變化，采取逐日按時(shí)開(kāi)穴的針灸治療方法，以達(dá)到調(diào)和氣血、補(bǔ)虛瀉實(shí)、平衡陰陽(yáng)的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過(guò)檢測(cè)人體多種生理指標(biāo)如體溫、血壓、血紅蛋白、血糖及各種激素等，發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)的數(shù)值呈周期性節(jié)律變化［6］。有研究提出，腦缺血的發(fā)病存在24 h時(shí)間節(jié)律差異，上午6～12時(shí)發(fā)病率較高，其中6～10時(shí)為最高時(shí)間段［7-8］。夏蘇建應(yīng)用圓形分布法分析腦缺血平均發(fā)病的高峰時(shí)點(diǎn)為8時(shí)21分［9］，此時(shí)間段正為卯、辰、巳時(shí)，當(dāng)大腸、胃、脾主時(shí)，高峰時(shí)間段正當(dāng)手足陽(yáng)明經(jīng)主時(shí)，高峰時(shí)點(diǎn)正為辰時(shí)足陽(yáng)明胃經(jīng)主時(shí)?！鹅`樞·經(jīng)脈》:“足陽(yáng)明脈是主血所生病者?！标?yáng)明經(jīng)多氣多血，此時(shí)開(kāi)穴治療，可鼓動(dòng)經(jīng)氣、疏經(jīng)通絡(luò)，達(dá)益氣養(yǎng)血、活血化瘀、調(diào)和陰陽(yáng)之目的。我們應(yīng)用子午流注納甲法，選擇在辰時(shí)或巳時(shí)開(kāi)穴進(jìn)行針刺治療，這與“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”理論可謂殊途同歸。

子午流注治療中風(fēng)符合人體氣血首尾相銜的循環(huán)流注，盛衰開(kāi)合有時(shí)間節(jié)奏、時(shí)相特性的規(guī)律，因時(shí)、因病、因人、因地從而準(zhǔn)確、有效地調(diào)整中風(fēng)患者臟腑氣血陰陽(yáng)，在特定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行治標(biāo)培源，恢復(fù)患者氣血運(yùn)行的正常時(shí)間規(guī)律，以達(dá)到改善癥狀的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合組和納甲組效果明顯好于常規(guī)針刺組，聯(lián)合組優(yōu)勢(shì)比納甲組更明顯，再次證明子午流注納甲法的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)臨床提示納甲法結(jié)合常規(guī)辨證取穴治療效果更好。

NSE主要存在于神經(jīng)組織，屬于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特有。NSE是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì)，NSE被認(rèn)為是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志物［10］。NSE作為腦損傷患者臨床監(jiān)測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，是神經(jīng)元損傷的敏感性和特異性標(biāo)志，對(duì)腦缺血損傷的整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程有重大意義。

本研究觀察到，MACO模型大鼠在6 h、3 d時(shí)段與6 h比較，模型組3 d大鼠腦組織勻漿NSE含量表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，含量達(dá)到峰值。7 d、14 d、21 d時(shí)段，各組大腦海馬組織NSE含量的表達(dá)開(kāi)始下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示缺血性損傷誘導(dǎo)NSE表達(dá)上調(diào)，可能是細(xì)胞損傷后的自我保護(hù)機(jī)制。腦缺血后，腦勻漿中 NSE濃度顯著升高，說(shuō)明出現(xiàn)腦損傷。本研究結(jié)果與相關(guān)研究［11-12］一致，提示NSE的表達(dá)呈現(xiàn)出先升后降的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

與模型對(duì)照組比較，常規(guī)針刺組、納甲組和聯(lián)合組均可使大鼠腦組織勻漿NSE含量的表達(dá)顯著下降(P＜0.05或P＜0.01);與常規(guī)針刺組比較，納甲組和聯(lián)合組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)(21 d除外)腦組織勻漿NSE含量的表達(dá)顯著降低(P＜0.05或 P＜0.01)。與納甲組比較，聯(lián)合組大鼠腦組織NSE含量的表達(dá)降低，盡管顯示作用有更強(qiáng)的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明針刺治療能夠抑制腦缺血后腦區(qū)NSE的表達(dá)，對(duì)大鼠腦缺血組織的神經(jīng)細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，從而減輕腦損傷，并提示納甲法早期使用對(duì) NSE的抑制作用更優(yōu)。本研究和相關(guān)研究［13-14］結(jié)果提示，抑制腦缺血后腦區(qū)的NSE表達(dá)，減輕腦損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用，可能是針刺治療的機(jī)制之一。

研究表明，NGF不僅具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用，而且能促進(jìn)受損神經(jīng)元的再生，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)［15］。體外實(shí)驗(yàn)表明，NGF對(duì)中樞神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、維持正常狀態(tài)及神經(jīng)損傷后的保護(hù)和軸突的有效再生都有重要的調(diào)控作用。bFGF是一種具有多種生物活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，體內(nèi)、外對(duì)多種神經(jīng)元有維持生存和促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，并能促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生腦缺血損傷后腦內(nèi)bFGF表達(dá)增高，一定程度上可延緩缺血后神經(jīng)元損傷［16］。

本研究結(jié)果顯示，模型組與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，NGF、bFGF蛋白表達(dá)的明顯增加(P＜0.01)，說(shuō)明腦梗死可促進(jìn)模型大鼠腦內(nèi)NGF、bFGF蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腦缺血損傷后大鼠腦組織勻漿NGF、bFGF含量6 h開(kāi)始增高，3 d、7 d繼續(xù)增加，7 d時(shí)大鼠腦組織勻漿NGF含量達(dá)高峰，14 d后其表達(dá)水平開(kāi)始下降，21 d后其表達(dá)繼續(xù)下降但仍高于模型組。本研究與相關(guān)報(bào)道［17-20］結(jié)論是類似的。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在各時(shí)段與模型組比較，常規(guī)組、納甲組、綜合組的NGF(21 d除外)、bFGF含量上升差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.05);與常規(guī)組比較，納甲組、綜合組NGF含量上升差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，納甲組、綜合組NGF含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明針刺可以促進(jìn)缺血區(qū)NGF蛋白的表達(dá)，納甲組、綜合組對(duì)升高NGF、bFGF的作用要強(qiáng)于常規(guī)組，提示針灸有可能通過(guò)促進(jìn)缺血區(qū)NGF、bFGF的表達(dá)，從而對(duì)腦缺血后損傷的神經(jīng)元起到修復(fù)作用。還有研究觀察電針對(duì)高血脂合并腦缺血大鼠血脂及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的影響。結(jié)果顯示，腦缺血前即開(kāi)始治療可以使NGF含量顯著升高(P＜0.01)［19］;還有研究顯示，EA、rTMS和EA+rTMS組大鼠梗死灶周圍以及海馬區(qū)NGF、BDNF及mRNA的表達(dá)增強(qiáng)［18］，這與我們的研究結(jié)果近似。

我們的研究驗(yàn)證了針刺可以升高缺血腦區(qū)NGF、bFGF的表達(dá)，同時(shí)降低NSE的表達(dá)，從而改善神經(jīng)元細(xì)胞生存的微環(huán)境，最終使得腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，推測(cè)這可能是針刺促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生的機(jī)理之一。

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1006-3250(2017)01-0063-05

2016-10-10

甘肅省財(cái)政廳基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2010-6)

王亞軍(1970-)，男，陜西西安人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事針灸治療老年病的臨床療效評(píng)價(jià)與實(shí)驗(yàn)機(jī)理研究。