氣腫疽梭菌檢測(cè)方法概述

張 皓，任春宇，車 達(dá)，張永佳，李成輝，金 鑫*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.延邊州畜牧總站，吉林延吉 133000；3.延邊州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林延吉 133000)

氣腫疽梭菌檢測(cè)方法概述

張 皓1，任春宇2，車 達(dá)3，張永佳1，李成輝1，金 鑫1*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.延邊州畜牧總站，吉林延吉 133000；3.延邊州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林延吉 133000)

氣腫疽(Clostridiumchauvoeiinfection)病原體為氣腫疽梭菌，是一種發(fā)生于反芻動(dòng)物的急性、熱性、敗血性傳染病。常見的典型癥狀為發(fā)病動(dòng)物肌肉豐滿部位發(fā)生炎性、氣性腫脹，觸壓有捻發(fā)音，該病的流行有一定的地方性、季節(jié)性，多發(fā)生在潮濕的山谷、牧場(chǎng)，且在天氣炎熱的多雨季節(jié)。近幾年常有暴發(fā)牛氣腫疽的報(bào)道，給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的沖擊和經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也逐漸地威脅到畜牧生產(chǎn)和人類的安全。國(guó)內(nèi)關(guān)于該病的研究多數(shù)為病例報(bào)道，對(duì)于該病的詳細(xì)研究和綜述卻是少之又少，論文參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，從方法、原理、優(yōu)缺點(diǎn)等多個(gè)方面闡述氣腫疽的檢測(cè)方法，以期為該病的診斷提供參考。

氣腫疽梭菌；檢測(cè)方法；免疫學(xué)；分子生物學(xué)

氣腫疽又稱為黑腿病，是由氣腫疽梭菌(Clostridiumchauvoei)引起的細(xì)菌性傳染病[1]。氣腫疽梭菌以芽胞狀態(tài)侵入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)后，在腸腺中的無氧條件下出芽繁殖，通過淋巴組織和血液循環(huán)到達(dá)組織。病原體在肌肉組織受傷時(shí)生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生毒素，組織局部充血、出血和血漿滲出，并產(chǎn)生硫化氫、含鐵血黃素，導(dǎo)致肌肉污黑、發(fā)臭，觸壓有捻發(fā)音。隨著病情的發(fā)展，可引起中樞神經(jīng)機(jī)能障礙病程后期將引發(fā)致死性毒血癥或菌血癥[2]。該病多發(fā)生于牛羊等反芻動(dòng)物[3]，近幾年偶爾有人發(fā)生感染而死亡的病例，這使得該病迅速成為諸多國(guó)家共同關(guān)注的焦點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。根據(jù)其流行特點(diǎn)和病理變化等可做出初步診斷，但該病與炭疽、巴氏桿菌病、惡心水腫有相似之處。筆者通過深入分析，列舉并闡述該病病原體的幾種檢測(cè)方法，提出該病快速診斷的有效措施。

1 病原學(xué)特點(diǎn)

氣腫疽梭菌又名肖氏梭菌，梭狀芽胞桿菌屬，專性厭氧菌。菌體大小約為0.5 μm～1.7 μm ×1.6 μm～9.7 μm，兩端鈍圓，無莢膜，有周身鞭毛能運(yùn)動(dòng)，芽胞位于中央或偏向一端，可在土壤中生存5年之久。氣腫疽梭菌的最佳生長(zhǎng)溫度為37 ℃，最適pH為7.2～7.4。在葡萄糖血瓊脂培養(yǎng)基上菌落為圓形、半透明，中心略微隆起的紐扣狀菌落，有微弱的β溶血[4-5]。

2 流行病學(xué)特點(diǎn)

氣腫疽的主要傳染源是病牛，病原體來自患病動(dòng)物的尸體、分泌物或排泄物，在自然界中以芽胞的形式廣泛存在于土壤中，當(dāng)反芻動(dòng)物采食被污染的飼草或飲水時(shí)感染。通常經(jīng)過消化道黏膜創(chuàng)傷侵入組織引發(fā)感染，也可經(jīng)創(chuàng)傷或蚊蟲叮咬感染[6]。6月齡～2歲黃牛最易感，牦牛、山羊次之，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中豚鼠最為敏感[7]。潮濕山谷、沼澤地帶、降水量多的地區(qū)易使病原體孳生，該病極易暴發(fā)，夏秋兩季氣候溫?zé)幔邓渥?，因此成為該病的高發(fā)期。在過去幾年的報(bào)道中可見該病的流行有一定的地域性、季節(jié)性，發(fā)病率不高、病死率高，某一地區(qū)一旦發(fā)病，疫情將會(huì)反復(fù)發(fā)生，并導(dǎo)致牲畜死亡[8]。

3 檢測(cè)方法

3.1 常規(guī)檢測(cè)

主要根據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀及病理特征做出初步判斷。動(dòng)物感染氣腫疽后表現(xiàn)基本相似，呈現(xiàn)急性發(fā)病，體溫達(dá)到41℃～42℃，全身癥狀明顯，肌肉豐滿部位發(fā)生腫脹，出現(xiàn)跛行，患部皮膚干硬形成壞疽，食欲減退，呼吸困難，常常1 d～3 d內(nèi)死亡。病畜死后尸體迅速腐敗，四肢僵直，天然孔有泡沫樣血液流出。肌肉橫切面呈黑紅色，肌纖維束有小氣泡脹裂[9]。剖檢可發(fā)現(xiàn)口腔黏膜充血，胸腔、腹腔有暗紅色滲出液，腸管空虛，腎盂充血有豆粒大小的壞死灶[10-11]。

鏡檢可見肌肉呈玻璃樣病變，胞核溶解消失，肌纖維間存在病原菌，病變中心區(qū)域呈變性壞死。染色后鏡下可見兩端鈍圓的大桿菌，呈革蘭陽(yáng)性，芽胞位于菌體中央或偏于一端。菌體多為單個(gè)存在，也可見兩個(gè)相連[12]。

3.2 免疫學(xué)檢測(cè)

3.2.1 間接ELISA 間接ELISA是在保持抗原免疫活性的條件下，將其結(jié)合到某種固相載體表面，使被檢測(cè)疑似患病動(dòng)物血清和酶標(biāo)記物反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，并加入酶作用的底物，最終通過分析反應(yīng)結(jié)束后有色產(chǎn)物的量確定樣品中抗體含量[13]。車達(dá)等[14]首次成功構(gòu)建了氣腫疽間接ELISA檢測(cè)方法，以氣腫疽梭菌裂解菌體為抗原，當(dāng)濃度為50 μg/mL，酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶2 000的條件下，成功建立了病原菌的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。該方法是一種簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢測(cè)方法，有良好的特異性和重復(fù)性。

3.2.2 Dot-ELISA Dot-ELISA是將免疫酶固相載體法的反應(yīng)板用纖維素膜代替，而形成的一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，這種方法彌補(bǔ)了容易包被不牢而造成失敗的缺點(diǎn)，且樣品需求少，節(jié)省材料。該原理與ELISA相似，將抗原吸附在纖維素薄膜上，在保持其免疫活性的前提下，與抗原抗體酶標(biāo)記物產(chǎn)生免疫反應(yīng)并形成抗原抗體復(fù)合物。該復(fù)合物可在酶的參與下顯示出色斑，通過色斑的顏色深度即可判定檢測(cè)結(jié)果。姜詠越[15]應(yīng)用氣腫疽標(biāo)準(zhǔn)株純化抗原免疫動(dòng)物制備標(biāo)準(zhǔn)血清作為一抗載體膜，建立了檢測(cè)氣腫疽病原體毒素的雙抗體夾心Dot-ELISA檢測(cè)方法。確定了當(dāng)抗體稀釋度為1∶1 024時(shí)，可檢測(cè)到最低菌體抗原量為3.15 μg，最低分泌抗原量為1.89 μg，最適酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?∶4 000。該方法較ELISA有更高的特異性和敏感性,可以檢測(cè)到微量氣腫疽梭菌毒素，且抗體用量少、易于保存、操作方便。

3.2.3 免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。任春宇等[16]選用氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株制備菌體單克隆抗體，并將單克隆抗體與膠體金標(biāo)記結(jié)合，成功研制出了能夠?qū)饽[疽做出快速診斷的膠體金免疫層析試紙條。該方法與ELISA檢測(cè)相比有較高的靈敏度和特異性，可檢測(cè)出最低抗原量為1×105CFU/mL，且有較好的穩(wěn)定性，保存時(shí)間長(zhǎng)久。

3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.3.1 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是體外模擬核酸復(fù)制的過程，對(duì)細(xì)菌特異性部分進(jìn)行檢查。日本研究者Sasaki Y曾以氣腫疽鞭毛基因?yàn)槟康幕颍M(jìn)行了與其他4種細(xì)菌的鑒別檢測(cè)。德國(guó)幾位科研人員也應(yīng)用該P(yáng)CR成功鑒別出氣腫疽梭菌與其他腐敗梭菌。云巾宴等首次以氣腫疽細(xì)胞毒素A為基礎(chǔ)，建立了氣腫疽的PCR檢測(cè)方法[17-18]，該方法是檢測(cè)氣腫疽梭菌相對(duì)快速高效的方法，適用于臨床上氣腫疽的診斷。

3.3.2 套式PCR 套式PCR又稱巢式PCR，是一種特殊的聚合酶鏈反應(yīng)，使用兩對(duì)引物擴(kuò)增完整的片段。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于第1對(duì)引物擴(kuò)增若發(fā)生錯(cuò)誤，第2對(duì)引物將很難配對(duì)并擴(kuò)增，保證了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。姜丹丹等[19]以16 S rRNA為基礎(chǔ)成功建立了氣腫疽梭菌套式PCR檢測(cè)方法，該方法與傳統(tǒng)方法相比操作過程簡(jiǎn)單，適用于氣腫疽的流行病學(xué)調(diào)查。

3.3.3 二重PCR 二重PCR是以PCR為基礎(chǔ)，能夠通過一次反應(yīng)檢測(cè)多種病原，適用于病原體的鑒別和分離。彭小兵等[20]綜合了Sasaki Y等的研究方法，以16 S～23 S rDNA間隔區(qū)和23 S rDNA的部分序列作為菌株的識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)添加了腐敗梭菌α毒素基因的特異性引物，最終建立了具有特異、快速且準(zhǔn)確的既可以鑒別氣腫疽梭菌，又可以鑒別腐敗梭菌的二重PCR檢測(cè)方法。

3.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)是在PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積同步監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析的方法。Halm A等[21]以16 S rRNA基因序列為模板，建立了氣腫疽梭菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法能夠從32個(gè)梭菌屬和10個(gè)非梭菌屬中準(zhǔn)確地鑒定氣腫疽梭菌。Martin L等[22]以spo0A基因?yàn)榛A(chǔ)，建立了多重實(shí)時(shí)定量PCR，快速可靠地鑒定了氣腫疽梭菌與腐敗梭菌等臨床樣本。2011年Garofolo G等[23]建立了多重實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，以TPI基因序列為模板，設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，也能夠鑒別腐敗梭菌和氣腫疽梭菌。

4 展望

自20世紀(jì)以來，氣腫疽在國(guó)內(nèi)20多個(gè)地區(qū)的暴發(fā)為我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。及時(shí)鑒別和迅速診斷對(duì)于控制該病的流行和暴發(fā)極為重要，需要建立針對(duì)該病快速有效的診斷方法，采取有效的預(yù)防和治療方法控制氣腫疽的流行和蔓延。隨著近年來免疫學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多新型的鑒別診斷方法的出現(xiàn)為該病的防控奠定了基礎(chǔ)。

以上檢測(cè)方法各有優(yōu)勢(shì)與局限性，需要針對(duì)實(shí)際需求、臨床操作條件以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境，選擇符合條件的病原體檢測(cè)方法進(jìn)行疾病診斷，或同時(shí)采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法確保診斷的正確性。

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SummaryofMethodsforDetectionofClostridiumchauvoeiInfection

ZHANG Hao1, REN Chun-yu2, CHE Da3, ZHANG Yong-jia1, LI Cheng-hui1, JIN Xin1

(1.DepartmentofVeterinaryMedicine，AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,Yanji,Jilin,133000,China;2.AnimalHusbandryStationofYianbian,Yanji,Jilin,133000,China;3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofYianbian,Yanji,Jilin,133000,China)

Clostridiumchauvoeiinfection is an acute,febrile,septic infectious disease in ruminants.The typical symptoms of infected animals are inflammation and emphysematous swelling in muscular rich position.When pressing,there is a crepitus.The epidemic ofClostridiumchauvoeiinfection is regional and seasonal, and it usually occurs in the wet valley ranch or the season which is warm and rainy.Recently,the report showedClostridiumchauvoeiinfection erupted in some area,which brought huge economic losses to the development of animal husbandry,at the same time,Clostridiumchauvoeialso affected human security.Majority researches of the infection inland were descriptionS to the cases.The detailed research or summary of it was less.This article summarized the detection ofClostridiumchauvoeiinfection in methods,principles,advantages and disadvantages based on document literatures at home and abroad for providing beneficial reference to diagnose of the infection.

Clostridiumchauvoei;detection method;immunology;molecular biology

2017-02-27

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目(612014029)

張 皓(1994-)，女，吉林敦化人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究。*

S852.616

:A

:1007-5038(2017)09-0119-03