4種調(diào)味料精油抗氧化及抑菌活性的評價

王麗霞，王 芳，劉孟宗，趙文華，王晨旭，陸藝菲

(天津科技大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457)

植物精油是一種具有揮發(fā)性植物特有芳香味的油狀液體，其主要來源于植物的花、葉、根、果實、種子等部位．陳建煙等[1]研究發(fā)現(xiàn)植物精油成分為萜類化合物、有機酸和微量元素等物質(zhì)，尤其以單萜類和倍半萜類為主．目前提取植物精油的方法繁多，其中廣泛使用的方法有傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法和溶劑萃取法．傳統(tǒng)方法設備簡單、操作容易，但是蒸餾過程中物料長期處于高溫狀態(tài)，容易造成熱敏性成分分解；溶劑萃取法獲得精油容易將植物里的樹脂等成分提取出來導致雜質(zhì)較多[2]．超臨界CO2萃取技術由于其萃取能力強、得率高、有效成分多、無溶劑殘留等優(yōu)點越來越受到人們的青睞，被廣泛地應用于食品工業(yè)、醫(yī)藥品和保健食品領域[3]．

植物精油成分復雜而且本身含有多種生物活性，最突出的兩個特性便是抗氧化活性和抑菌性．抗氧化活性對人體有重要作用，人類的糖尿病、心血管疾病、腫瘤等疾病都是由于體內(nèi)自由基過多引起的．Daniel-Jambun等[4]用甲醇提取生姜中的酚類物質(zhì)并測定了抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)生姜具有較強的抗氧化活性，并且有效成分為非極性物質(zhì)，親脂性高更易通過細胞膜在細胞內(nèi)部發(fā)揮作用．Wang等[5]研究了肉桂精油中的肉桂醛對牙齦卟啉菌生長有抑制作用，通過掃描電鏡觀察細胞膜破裂從而導致核酸和蛋白泄露，最終菌體死亡．本文比較生姜、大蒜、丁香、茴香這4種植物精油的抗氧化活性和抑菌活性，以期篩選出一種抑菌和抗氧化活性均較強的植物精油，作為食品添加劑用于食品行業(yè)，達到保鮮和抑菌等目的．

1 材料與方法

1.1 材料

選取黃爪姜塊莖、蒲棵紫皮蒜鱗莖、紫丁香花蕾和小茴香果實經(jīng)過超臨界萃取獲得植物精油(萃取條件為：萃取壓力 35MPa，萃取溫度 35℃，CO2流量15L/h，萃取時間 2h)．

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E. coli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和青霉(Penicillium)由天津科技大學菌種保藏中心提供．

抗壞血酸(VC)、1，1–二苯基–2–三硝基苯肼(DPPH)、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵均為國產(chǎn)分析純；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基均為生化試劑．

SP–2102UV 型紫外–可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DZF–6020型恒溫培養(yǎng)箱，上海益恒科技有限公司；LS–B50LB50L型立式壓力蒸氣滅菌器，上海?，攲嶒炗邢薰荆籊CMS–QP2010Ultra型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國瓦里安技術有限公司．

1.2 調(diào)味料精油的成分分析

參照白娟[6]氣質(zhì)條件，運用 GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀對 4種調(diào)味料精油進行定性、定量分析，通過質(zhì)譜圖庫檢索確定精油成分．

1.3 調(diào)味料精油抗氧化活性的測定

1.3.1 調(diào)味料精油對DPPH自由基(DPPH·)的清除

移取 2.0mL不同濃度的植物精油于具塞試管中，加入 2.0mL DPPH乙醇溶液(DPPH濃度為0.2mmol/L)，充分振蕩混合均勻，放置具塞試管在黑暗中避光 30min，反應結(jié)束后使用酶標儀測量其在517nm處的吸光度．為消除試劑本身顏色對實驗的影響，同時測定2.0mL DPPH乙醇溶液與2.0mL乙醇混合后的溶液的吸光度，以及同樣反應體積的各種精油與 2.0mL無水乙醇混合后溶液的吸光度[7]．選用VC作陽性對照．DPPH·清除率按照式(1)計算．

式中：A0為無水乙醇與 DPPH混合溶液的吸光度；A為精油與 DPPH混合溶液的吸光度；A1為各濃度精油與乙醇混合溶液的吸光度．

心肌肌鈣蛋白的分析問題:心肌損傷后cTn釋放入血液循環(huán)需要一定時間，cTn水平到達峰值后逐漸下落。在癥狀發(fā)作初期，cTn檢查結(jié)果與樣本采集時間密切相關。因此，不能因cTn變化較小而判定為心肌梗死。同時，許多并發(fā)癥也可導致患者基線cTn數(shù)值(特別是hs-cTn數(shù)值)上升，需引起注意。此外，圍術期不同時間cTn的變化情況可用于鑒別急、慢性事件。

向試管中分別加入4.5mL pH 5.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖液和1.0mL試樣溶液，搖勻后25℃恒溫水浴，同時將 3mmol/L鄰苯三酚溶液(用10mmol/L HCl溶液配制)放在相同溫度下預熱，反應20min后立即加入0.3mL已經(jīng)在水浴中經(jīng)過加熱的鄰苯三酚溶液啟動反應，反應 5min后加 4滴10mol/L HCl終止反應．測定其在 325nm處的吸光度．用 4.2mL的蒸餾水代替樣品液作為空白管，以Tris-HCl緩沖液作空白調(diào)零，各濃度試樣液用以各自反應管的調(diào)零[8]．選用VC作陽性對照．清除率按照式(2)計算．

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為樣品吸光度．

1.3.3 調(diào)味料精油對羥基自由基(·OH)的清除

在具塞比色管中分別加入 2.0mL FeSO4溶液(1mmol/L)、1.0mL H2O2溶液(2mmol/L)和 3.0mL(6.0mmol/L)水楊酸溶液，搖勻，37℃恒溫水浴15min，測定反應后溶液在510nm下的吸光度．然后向試管中各自再加入 1.0mL不同濃度精油溶液，振蕩混合均勻后，再次恒溫水浴反應 15min，反應完成后，分別對各溶液在 510nm處的吸光度進行測定.空白管不加 H2O2溶液，用 2.0mL蒸餾水代替，按上述實驗過程進行反應，測定最終反應液的吸光度[9].選用VC作陽性對照．·OH清除率按照式(3)計算．

式中：A0為未加入試樣的吸光度；A1為加入試樣的吸光度；A2為未加入H2O2的吸光度．

1.4 調(diào)味料精油抑菌活性的測定

1.4.1 抑菌圈直徑

采用瓊脂擴散法對調(diào)味料精油抑菌活性進行測定[10]．將已經(jīng)活化好的菌種接種于液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)使其數(shù)目級達到106～108，制備菌懸液以備后用．移取 100μL菌懸液于滅菌后的培養(yǎng)基表面，用無菌涂布棒涂布均勻，再將直徑為6mm的濾紙片置于平板表面．移取20μL植物油于濾紙片上使其滲透均勻，加藥后將平板置于相應溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．觀察實驗結(jié)果，測量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)．

1.4.2 最小抑菌濃度與最小殺菌濃度

最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)采用二倍數(shù)稀釋法進行測定．以 DMSO為溶劑，配制不同質(zhì)量濃度的植物精油，在無菌試管中加入 10mL滅菌的液體培養(yǎng)基、100μL菌懸液、0.1mL植物精油，在最適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 36h，以不渾濁試管的最小試樣濃度為最小抑菌濃度(MIC)．將試管混合液移取 100μL均勻涂布于平板上，培養(yǎng) 24h后，觀察菌落生長情況，以無菌生長情況為最小殺菌濃度(MBC)．

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均進行3次重復實驗，采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 調(diào)味料精油成分分析

對生姜精油、大蒜精油、丁香精油和茴香精油的成分進行了分析，文中共截取了 25種主要成分，結(jié)果見表1—表4．由表1可知生姜精油揮發(fā)性成分主要是一些單萜和倍半萜類物質(zhì)，其中相對含量最高的成分是姜烯，含量為 19.57%；其次為α–姜黃烯，含量為 7.51%；姜酮和 6–姜酚分別為 5.51%和 2.91%.Mesomo等[11]使用超臨界萃取的生姜精油主要成分為α–姜烯、β–倍半水芹烯、α–姜黃烯、α–金合歡烯、β–甜沒藥烯和香茅醛．

表1 生姜精油成分分析Tab. 1 Major chemical composition of ginger essential oil

通過分析發(fā)現(xiàn)大蒜揮發(fā)油成分主要是含硫化合物和成環(huán)烯烷類．二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚和二烯丙基四硫醚都是大蒜精油主要成分．

對丁香揮發(fā)油成分分析發(fā)現(xiàn)：其揮發(fā)油組分主要為倍半萜烯和酚類物質(zhì)，其中主要成分丁香酚相對含量為 85.82%；α和 β 葎兩種類型的 草烯含量都較高，分別為 2.17%、8.74%．González-Rivera等[12]分析了水蒸氣蒸餾獲得的丁香油成分，其中丁香酚含量為66.90%，石竹烯含量為 24.80%，葎草烯和乙酸丁香酚酯含量分別為3.10%和2.70%．

表2 大蒜精油成分分析Tab. 2 Major chemical composition of garlic essential oil

表3 丁香精油成分分析Tab. 3 Major chemical composition of clove essential oil

對超臨界萃取的茴香油運用氣質(zhì)聯(lián)用儀對其成分進行研究發(fā)現(xiàn)：茴香油主要成分為茴香腦(81.17%)、對烯丙基茴香醚(4.59%)、小茴香酮(1.49%)和檸檬烯(1.13%)．Díaz-Maroto 等[13]研究由同步蒸餾和超臨界萃取兩種方法獲得的茴香精油成分一致，主要成分為反式茴香腦、對烯丙基茴香醚和茴香酮．但是兩者的相對含量仍有較大差別．

表4 茴香精油成分分析Tab. 4 Major chemical composition of fennel essential oil

4種精油成分復雜，但共有一些相同成分，如蒎烯、欖香烯、石竹烯、松油醇等化合物．α–蒎烯在生姜精油和茴香精油中的含量分別為 0.82%和0.50%．生姜精油和茴香精油中都檢測出松油醇，其中生姜精油是α–松油醇，含量為 0.24%；茴香精油中的是 β–松油醇，含量為 0.10%．欖香烯在生姜精油、丁香精油和茴香精油中含量分別為 1.33%、0.01%和0.10%．

2.2 調(diào)味料精油對DPPH·的清除活性

4種調(diào)味料精油對 DPPH·的清除活性如圖 1所示．由圖 1可知：在實驗濃度范圍內(nèi)，調(diào)味料精油清除 DPPH·能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當質(zhì)量濃度達到200μg/mL時，丁香精油和茴香精油清除率分別為 62.72%、53.85%；當質(zhì)量濃度繼續(xù)增加到250μg/mL時，生姜、大蒜、丁香、茴香精油對DPPH·的清除率分別為 60.43%、30.77%、74.26%、67.95%．當VC質(zhì)量濃度為 150μg/mL時，清除率已超過 80%，說明其具有良好的抗氧化能力．當質(zhì)量濃度達到 200μg/mL時丁香精油、茴香精油、生姜精油和VC對DPPH·清除率相差不大．4種植物精油均對DPPH·有不同程度的清除能力，綜合來看精油清除能力從大到小依次為丁香精油、茴香精油、生姜精油、大蒜精油．實驗結(jié)果中丁香精油對 DPPH·清除能力最強，實驗結(jié)果與劉萬臣[14]的研究結(jié)果一致，其原因是采用超臨界萃取獲得的丁香精油中含有大量的丁香酚，酚類物質(zhì)具有較強的抗氧化活性，故而丁香精油本身清除DPPH·能力較強．

圖1 不同調(diào)味料精油對DPPH·的清除活性Fig. 1 Activity of DPPH· scavenging of different essen-tial oils

2.3 調(diào)味料精油對的清除活性

圖2 不同調(diào)味料精油對的清除活性Fig. 2 Superoxide anion radical scavenging of different essential oils

2.4 調(diào)味料精油對·OH的清除活性

4種調(diào)味料精油對·OH的清除活性如圖 3所示．由圖 3可知：4種調(diào)味料精油對·OH均具有較強的清除能力并且清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加．當精油質(zhì)量濃度為 50μg/mL時，生姜、大蒜、丁香、茴香精油清除·OH 的清除率依次為13.66%、3.55%、23.57%、6.72%．當質(zhì)量濃度為200μg/mL時，丁香對·OH 清除率達到 53.41%，生姜精油對其清除率為 34.83%，大蒜精油和茴香精油清除率分別為 22.84%和 27.53%．觀察 VC對·OH清除能力，除了質(zhì)量濃度為 50μg/mL清除率僅為 12.77%低于生姜精油和丁香精油的清除率，其余質(zhì)量濃度指標均高于實驗組．4種調(diào)味料超臨界精油對·OH清除能力從大到小依次為丁香、生姜、茴香、大蒜. Fujisawa等[15]發(fā)現(xiàn)丁香精油中的丁香酚物質(zhì)在抗氧化方面發(fā)揮了重要作用，主要由于丁香酚中不飽和雙鍵能夠貢獻酚氫原子，從而具有抗氧化活性．Mi等[16]說明生姜精油能夠作為自由基清除劑應用于食品工業(yè)中，主要緣于生姜中的酚類物質(zhì)如姜酚、姜烯酚等能夠給電子或氫原子，并且能夠捕捉自由基，從而終止過氧化鏈反應機制．

圖3 不同調(diào)味料精油對·OH的清除活性Fig. 3 Hydroxyl free radical scavenging of different essential oils

2.5 調(diào)味料精油的抑菌活性

采用瓊脂擴散法研究調(diào)味料精油對于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E. coli)、根霉(Rhizopus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和青霉(Penicillium)的抑菌活性．以抑菌圈直徑、MIC、MBC指標評定調(diào)味料精油對測試菌種的抑菌作用，結(jié)果見表5—表7．

表5 調(diào)味料精油的抑菌圈直徑Tab. 5 Inhibition zone diameters of essential oils

從表 5可以看出：調(diào)味料精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、根霉、黑曲霉和青霉都有不同程度的抑制作用．其中，大蒜精油對青霉抑制作用最強抑菌圈直徑為(29.25±0.17)mm，其次為根霉和黑曲霉．茴香精油對青霉的抑制效果最好，在測試濃度中青霉被完全抑制生長，其對金黃色葡萄球菌的抑制作用最不明顯，抑菌圈直徑為(9.05±0.13)mm．然而生姜精油對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，其抑菌圈直徑達(27.35±0.17)mm，對霉菌抑制作用比對細菌抑制作用較弱，抑菌圈直徑小于 16mm．根霉對丁香精油比較敏感，其抑菌圈直徑為(27.30±0.07)mm．每種精油對細菌和真菌抑制作用不同，大蒜精油及茴香精油對真菌的抑制作用大于對細菌抑制作用，細菌對生姜精油和丁香精油更為敏感．抑菌實驗中精油對實驗菌種抑菌圈直徑均大于 9mm，所以調(diào)味料精油對測試菌種均表現(xiàn)出較強的抑制作用．

表6 調(diào)味料精油的最小抑菌濃度Tab. 6 MIC of essential oils μg/mL

表7 調(diào)味料精油的最小殺菌濃度Tab. 7 MBC of essential oils μg/mL

從表6和表7中發(fā)現(xiàn)：精油品種不同對不同菌種的最小殺菌濃度和最小抑菌濃度也有所不同．金黃色葡萄球菌對生姜精油最為敏感，最小抑菌濃度為15.25μg/mL；生姜精油對金黃色葡萄球菌抑制作用最好，最小殺菌質(zhì)量濃度為 40μg/mL．在測試菌種中，丁香對大腸桿菌的抑制作用最強，最小抑菌質(zhì)量濃度為 16.75μg/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度為40μg/mL．MIC和MBC數(shù)據(jù)與抑菌圈直徑數(shù)據(jù)趨勢一致，說明所選精油的抑菌活性較好，有潛力作為食品防腐劑應用于食品工業(yè)中．精油能滲透進細胞結(jié)構(gòu)的磷脂雙分子層，通過作用于微生物的細胞膜結(jié)構(gòu)，從而使細胞膜形態(tài)發(fā)生改變，如出現(xiàn)褶皺、凹陷、破裂等現(xiàn)象，破碎的細胞膜使其滲透性發(fā)生改變，導致細胞內(nèi)溶物流出，最終致使菌體死亡[17-19]．

3 結(jié) 語