西瓜枯萎病菌拮抗枯草芽孢桿菌BTF發(fā)酵條件優(yōu)化

李 萍，劉 冬，2，代玉立，高智謀

(1．安慶職業(yè)技術學院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2．安徽農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，安徽 合肥 230036；3．福建省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，福建 福州 350013)

西瓜枯萎病菌拮抗枯草芽孢桿菌BTF發(fā)酵條件優(yōu)化

李 萍1，劉 冬1，2，代玉立3，高智謀2*

(1．安慶職業(yè)技術學院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2．安徽農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，安徽 合肥 230036；3．福建省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，福建 福州 350013)

為提高拮抗細菌對西瓜枯萎病菌的拮抗作用，應用單因素和響應面對拮抗枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最適發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀5 g/L。最佳發(fā)酵培養(yǎng)的時間為60 h，初始pH為7.0，接種量、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速分別為9.95%、36℃和120 r/min。在該條件下進行驗證，抑菌率為62.12%，可作為西瓜枯萎病生物防治的潛在微生物制劑選項。

西瓜枯萎病菌；拮抗細菌；響應面；發(fā)酵條件優(yōu)化

尖孢鐮刀菌西瓜?；蚚Fusarium oxysporum Schl. f.sp. niveum ( E.F. Smith) Snyder et Hansen]引起的西瓜枯萎病是一種世界毀滅性的土傳病害，該病于1894年Smiht首次報道，廣泛分布于非洲、澳大利亞、亞洲、歐洲、北美和南美等國家，現(xiàn)已上升為主要病害[1-3]。西瓜枯萎病防治十分困難，選育和利用抗病品種是最經(jīng)濟有效的措施。目前生產(chǎn)上既抗枯萎病又高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的西瓜品種很少，常采用輪作換茬、嫁接和化學藥劑等方法防治枯萎病。實行多年輪作倒茬的農(nóng)業(yè)措施，對減少病害傳播雖能起到一定的作用，但有些地區(qū)土地有限，輪作不易實施[4]；嫁接栽培能明顯降低枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，但費工費時并降低了西瓜的品質(zhì)和風味，限制了這一技術在生產(chǎn)實踐中的廣泛應用；化學藥劑防治可以收到一定的效果，但成本高、用工多，且造成農(nóng)藥殘留和大氣污染，使化學防治失去其應有的效力[5]。生物防治方法對環(huán)境友好，風險低，其中，微生物源生物農(nóng)藥研究和開發(fā)十分活躍，但潛力尚沒有得到充分的發(fā)揮，作為低毒性新型農(nóng)藥其具有重要的開發(fā)價值[6-7]。

目前，細菌中的芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas spp.)，真菌中的綠色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，放線菌中的鏈霉菌 (Streptomyces spp.)等對西瓜枯萎病菌都有一定程度的抑制效果。王卿等[8]發(fā)現(xiàn)2株B. subtilis和1株多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa )對西瓜枯萎病的防治效果優(yōu)于化學藥劑百菌清，田間防效達64.9%。陸楚月等[9]探究了T. viride對西瓜枯萎病的防控效果，結(jié)果表明T. viride對西瓜枯萎病的防控效果達到60%。李歡等[10]發(fā)現(xiàn)西瓜種子與放線菌拌種處理，對苗期西瓜枯萎病的防控效果達52.17%。Faheem等[11]將豬糞與鏈霉菌YCXU堆肥發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)對盆栽西瓜枯萎病的防效達67%。甘良等[12]開展了放線菌混合菌劑對西瓜枯萎病的防治作用研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合菌劑對西瓜植株鮮重的提升和西瓜枯萎病的防治效果明顯優(yōu)于單個菌株。

本實驗從健康的西瓜根際土壤中篩選一株對西瓜枯萎病菌具有較好拮抗作用的細菌BTF，經(jīng)形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列鑒定為枯草芽孢桿菌。為進一步提高生防效果，采用單因素和響應面對拮抗細菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，對生防細菌的推廣應用及抑菌活性物質(zhì)的提取均有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 枯草芽孢桿菌BTF(Bacillus subtilis)和西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. niveum.)由安徽農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水10 mL，pH自然。發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、葡萄糖10 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株BTF對病原菌抑制率測定 采用平板對峙法，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中央接種6 mm培養(yǎng)5 d的西瓜枯萎病菌，并在距病原菌菌落中央2.5 cm處注入50 ul拮抗菌發(fā)酵液，以只接種西瓜枯萎病菌作為對照，26～28℃條件下培養(yǎng)，待對照菌落菌絲即將布滿整個平板時，測量菌落之間的距離，計算抑菌率，抑制率(%)=[(對照菌落直徑―處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)]×100。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

(1)氮源的篩選。以硫酸銨、大豆蛋白胨和酵母膏作為氮源取代發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中的蛋白胨配置成3種不同發(fā)酵培養(yǎng)基，并以蛋白胨為氮源的基礎培養(yǎng)基作為對照。以2%的接種量接種至4種發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝液50mL)，30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，設3次重復。72 h后，測定拮抗菌對病原菌的抑制率，根據(jù)抑制率確定發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的最佳碳源。

(2)碳源的篩選。以蔗糖、可溶性淀粉和乳糖作為碳源取代發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖配置成3種不同發(fā)酵培養(yǎng)基，并以葡萄糖為碳源的基礎培養(yǎng)基作為對照。其他條件同上，根據(jù)抑制率確定發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的最佳氮源。

(3)無機鹽篩選。添加磷酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鋅到發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中作為無機鹽，并以發(fā)酵基礎培養(yǎng)基為對照，測定抑制率。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 采用單因素法對枯草芽孢桿菌BTF菌株發(fā)酵時間和初始 pH進行優(yōu)化。發(fā)酵時間分別為24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，初始pH分別為6.5、7.0和7.5。綜合單因素試驗利用Box-Behnken試驗設計對發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速和接種量進行優(yōu)化，并用Design-expert 10.0對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源及其含量對抑菌率的影響

氮源及其含量對抑菌率的影響結(jié)果如圖1所示。相同濃度下以硫酸銨作為氮源與大豆蛋白胨、蛋白胨和酵母膏相比抑菌率最低。氮源在4～8g/L范圍內(nèi)隨著大豆蛋白胨、蛋白胨和酵母膏添加量的增加抑菌率呈增加趨勢，當酵母濃度繼續(xù)增加時抑菌率呈下降趨勢。當?shù)鞍纂藵舛葹?0g/L時，其抑菌效果與12g/L的大豆蛋白胨相當(約為46%)，為節(jié)約原料選擇濃度為10g/L的蛋白胨作為氮源。

2.2 碳源及其含量對抑菌率的影響

以蔗糖、可溶性淀粉和乳糖替換NA培養(yǎng)基中的葡萄糖，考察碳源及其含量對抑菌率的影響，結(jié)果如圖2所示。在相同濃度下，與對照(葡萄糖)相比，上述三種碳源的抑菌率均較葡萄糖低。在5～20g/L范圍內(nèi)，抑菌率與碳源濃度呈正相關性。當碳源濃度大于20g/L時抑菌率與碳源濃度呈負相關性，即最適碳源為葡萄糖，其濃度為20g/L。

圖1 不同氮源及濃度下的抑菌率 圖2 不同碳源及濃度下的抑菌率

2.3 無機鹽及其濃度對抑菌率的影響

無機鹽及其濃度對抑菌率的影響如圖3所示。與對照相比，添加1～7g/L的硫酸鎂和氯化鋅對抑菌率幾乎無影響。與對照相比，添加3～7g/L的磷酸二氫鉀可不同程度地提高抑菌率。當磷酸二氫鉀的濃度為5g/L時，抑菌率最大值為55.6%，較對照提高了8.4%。

圖3 不同無機鹽及濃度下的抑菌率 圖4 不同培養(yǎng)時間及初始pH下的抑菌率

2.4 培養(yǎng)時間和初始pH對抑菌率的影響

在36～60h范圍內(nèi)，抑菌率呈上升趨勢，而在60～72h范圍內(nèi)抑菌率呈下降趨勢(圖4)，即適宜的培養(yǎng)時間為60h。此外，pH為7.0時抑菌率最大值為54.7%，較pH為6.5(48.5%)和7.5(45.7%)時的最大值分別高6.2%和9%，即適宜的pH為7.0。

2.5 Box-Behnken試驗

選擇轉(zhuǎn)速、接種量和溫度按表1進行Box-Behnken試驗，結(jié)果見表1，利用Design-expert 10.0對試驗數(shù)據(jù)進行分析如表2所示。對抑菌率的影響程度接種量>培養(yǎng)溫度>轉(zhuǎn)速，且接種量和培養(yǎng)溫度對抑菌率有顯著(P<0.05)影響?；貧w方程為：Y=56.94+0.37A+0.91B+2.41C-0.85AB-1.04AC-0.23BC+2.87A2-2.76B2-0.83C2。

表1 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果

對模型回歸系數(shù)和試驗結(jié)果進行方差分析(表2)，Pmodel=0.0006，回歸方程顯著；失擬項概率Plose=0.9552﹥0.05，無失擬因素存在；R2=0.9554和R2Adj=0.8981，表明方程能較好的反應所選參數(shù)與抑菌率之間對應。變異系數(shù)(CV)=1.63%表明方程具有良好的重現(xiàn)性[13]，根據(jù)方程任選3因素中的兩個因素為變量，另一因素位于中心點作圖5。由圖可知，方程存在極大值點(抑菌率約為62.1%)，此時接種量、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速分別為9.95%、36℃和120 r/min。在該條件下進行驗證，抑菌率為62.0%與方程預測值吻合。

表2 二次多項式模型回歸系數(shù)估計和試驗結(jié)果方差分析

圖5 轉(zhuǎn)速、溫度和接種量的交互作用響應面

3 結(jié)論與討論

目前，常用的微生物發(fā)酵優(yōu)化方法包括單因素試驗、正交設計、Plackett-Burman設計、最陡爬坡設計和響應面設計等。單因素試驗較為繁瑣，正交設計無法找出整個區(qū)域上的所有因素最佳組合，Plackett-Burman設計受微生物的適應范圍影響，最陡爬坡設計只能確定最優(yōu)發(fā)酵條件的大概范圍，而響應面法試驗能較全面反映多因素水平的效果[14-16]。

枯草芽胞桿菌是生物防治中應用較為廣泛的拮抗細菌，但不同枯草芽胞桿菌在發(fā)酵過程中受營養(yǎng)和環(huán)境條件影響很大[17]。本研究利用單因素和Box-Behnken試驗對西瓜枯萎病菌拮抗枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得最適碳源為葡萄糖20 g/L，氮源為蛋白胨10 g/L。添加濃度為5 g/L磷酸二氫鉀的可提高抑菌率，最適的培養(yǎng)時間為60 h，pH為7.0，接種量、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速分別為9.95%、36℃和120 r/min。而相關研究[18-19]表明有些枯草芽孢桿菌菌株的最優(yōu)碳源為葡萄糖、最優(yōu)氮源為大豆餅粉和硫酸銨；鞠瑞成[20]等研究發(fā)現(xiàn)尖鐮孢菌拮抗枯草芽孢桿菌發(fā)酵的的最優(yōu)接種量為4%，與本研究不同。有研究發(fā)現(xiàn)篩選芽孢桿菌對番茄枯萎病菌具有較好抑制效果的初始pH為7.0[21]，與本研究結(jié)果一致。本研究在優(yōu)化條件下，枯草芽孢桿菌對西瓜枯萎病菌的抑制率達62.12%，可作為尖孢鐮刀菌生物防治的潛在微生物制劑選項。

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(編輯：嚴佩峰)

Optimization of Fermentation Conditions for Antagonistic Bacteria BTF Against Fusarium oxysporum f.sp. niveum

LI Ping1，LIU Dong1，2，DAI Yu-li3，GAO Zhi-mou2*
(1. Department of Horticulture and Landscape, Anqing Vocational and Technical College, Anqing 246003, China;2. College of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;3. Institute of Plant Protection, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China)

Single factor experiments and response surface design were used to optimize the medium components and fermentation conditions of Bacillus subtilis strain BTF to increase its antagonistic effect against Fusarium oxysporum f.sp. niveum. The result showed that the optimize medium was glucose 20 g/L, peptone 10 g/L, KH2PO4 10g/L. The optimize fermentation conditions were fermentation time 60 h, initial pH 7.0, inoculation rate 9.95%, incubation temperature 36.00 ℃ and rotate speed 120 r/min. Inhibitory effect of strain BTF is up to 68.0% under the optimize fermentation conditions, which could be used as a potential biological control agent against watermelon Fusarium wilt.

Fusarium oxysporum f.sp. niveum; antagonistic bacteria; response surface; fermentation condition optimization

2016-11-16

安徽高校省級自然科學研究項目(KJ2015A368、KJ2013B133、KJ2014A148)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016516).

李 萍(1985—)，女，安徽安慶人，副教授，博士，主要從事植物真菌病害研究.

*通訊作者：高智謀(1957—)，男，安徽桐城人，教授，博士，主要從事植物真菌病害研究.

S436.42

A

2095-8978(2017)01-0099-05