斑馬魚胚胎經(jīng)丙草胺暴露后對(duì)其仔魚致畸效應(yīng)的研究

劉迎，姜蕾，潘波，林勇

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?571101）

斑馬魚胚胎經(jīng)丙草胺暴露后對(duì)其仔魚致畸效應(yīng)的研究

劉迎，姜蕾，潘波，林勇

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海口 571101）

為探討斑馬魚胚胎暴露于丙草胺后對(duì)斑馬魚仔魚的致畸效應(yīng)和致畸機(jī)理，研究了斑馬魚胚胎暴露于0.50、1.00、1.50 mg·L-1丙草胺染毒液120 h后仔魚的畸形表型及比率，并通過檢測與畸形器官發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)探討致畸機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙草胺暴露后誘導(dǎo)斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包囊腫、軀干彎曲、游囊關(guān)閉等畸形表型，隨著暴露濃度的增加，各畸形癥狀比例增大。1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚心包囊腫率分別為15.56%（P＜0.05）、25.56%（P＜0.01），脊柱彎曲率分別為27.78%（P＜0.01）、35.56%（P＜0.01）；0.50、1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚游囊關(guān)閉率分別為20%（P＜0.05）、37.78%（P＜0.01）和60%（P＜0.01）。丙草胺顯著降低了心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbx2[1.00 mg·L-1（P＜0.01）、1.50 mg·L-1（P＜0.05）]，骨骼發(fā)育相關(guān)基因BMP-2[1.50 mg·L-1（P＜0.05）]、BMP-4[1.00 mg·L-1（P＜0.01）、1.50 mg·L-1（P＜0.01）]，游囊發(fā)育相關(guān)基因shha[1.50 mg·L-1（P＜0.05）]、ihha[1.00 mg·L-1（P＜0.05）、1.50 mg·L-1（P＜0.05）]的表達(dá)水平。研究表明，丙草胺通過影響心臟、骨骼和游囊相關(guān)基因的表達(dá)引起斑馬魚仔魚的以上器官發(fā)育異常。

丙草胺；斑馬魚；致畸效應(yīng)；Tbx2；BMP-2；BMP-4；shha；ihha

酰胺類除草劑是20世紀(jì)60年代開發(fā)的一類高效、高選擇性的除草劑，在全球農(nóng)藥品種市場中列第9位，在各類除草劑中列第4位，僅排在氨基酸類、磺酰脲類和其他結(jié)構(gòu)類之后[1]。隨著酰胺類除草劑的大量使用而引起的環(huán)境問題日益受到關(guān)注：甲草胺被美國環(huán)境保護(hù)局歸為B-2類致癌物[2]，同時(shí)也是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[3]；乙草胺[4]和丙草胺[5]暴露可引起斑馬魚胚胎內(nèi)分泌紊亂、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和免疫毒性；丁草胺可影響斑馬魚繁殖、擾亂甲狀腺激素、性激素等內(nèi)分泌物質(zhì)代謝[6]，同時(shí)丁草胺暴露引起斑馬魚胚胎內(nèi)分泌紊亂和免疫毒性[7]；異丙甲草胺暴露可影響斑馬魚胚胎孵化，對(duì)胚胎產(chǎn)生致畸效應(yīng)[8-9]。由于丙草胺為我國水稻田常用除草劑，研究其對(duì)斑馬魚胚胎毒性具有重要意義。

在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，關(guān)鍵基因的變化會(huì)導(dǎo)致心臟、骨骼等器官的發(fā)育異常。鞠黎等[10]研究推斷多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)斑馬魚幼魚脊柱彎曲可能與通過抑制骨形態(tài)蛋白家族相關(guān)基因（BMP-2和BMP-4）的表達(dá)而影響骨骼細(xì)胞的正常分化有關(guān)，岳東等[11]研究發(fā)現(xiàn)久效磷通過干擾心臟發(fā)育相關(guān)基因（Tbx2）和肌肉發(fā)育相關(guān)基因（Mef2）的表達(dá)引起胚胎心率下降和幼魚出現(xiàn)包囊腫率和脊柱彎曲等畸形，Winata等[12]發(fā)現(xiàn)敲除對(duì)魚鰾組織分化與形成有決定作用的shha和ihha基因后，能夠引起魚鰾發(fā)育缺陷。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎暴露于丙草胺可降低斑馬魚胚胎孵化率，誘導(dǎo)斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包囊腫、游囊關(guān)閉、軀干彎曲等畸形表型[9]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上研究丙草胺不同濃度暴露下各畸形表型的百分比，同時(shí)通過產(chǎn)生畸形的相關(guān)器官——心臟、脊椎和游囊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)變化來研究丙草胺在分子水平上對(duì)斑馬魚胚胎（仔魚）相關(guān)器官發(fā)育的影響，探討致畸機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑和實(shí)驗(yàn)儀器

94%丙草胺原藥（山東濱農(nóng)科技有限公司）、丙酮（廣州化學(xué)試劑廠）、吐溫-80（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。SMZ1000體視顯微鏡（日本Nikon公司）、PYX-250Q-C人工培養(yǎng)箱（廣東韶關(guān)科技試驗(yàn)儀器有限公司）、斑馬魚水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)（Z-A-S4，上海海圣工貿(mào)有限公司）、AUY220萬分之一電子天平（日本島津公司）。

1.2 斑馬魚胚胎采集

實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚購于?？谑兴沙厮屦^，體長為2～3 cm，在實(shí)驗(yàn)室斑馬魚水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)2周后，將雌雄魚分開馴養(yǎng)2周用于胚胎采集。成魚每日喂食2次人工飼料，光照/黑暗周期為14 h∶10 h。試驗(yàn)前一天晚上關(guān)燈前將雌雄魚按1∶2配對(duì)放入產(chǎn)卵缸中，第二天早上8：00開燈，半個(gè)小時(shí)后收集胚胎，經(jīng)2次清洗、去掉糞便和凝結(jié)的卵后轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)用水中（曝氣自來水，硬度82 mg·L-1，pH 7.52），于（26±1）℃人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.3 斑馬魚胚胎染毒

0.5g（折百后）丙草胺原藥加1.0 mL丙酮充分溶解后加0.8 mL吐溫-80助溶，用去離子水定容至100 mL容量瓶配制成5000 mg·L-1母液，置于4℃冰箱中備用。根據(jù)前期研究[9]斑馬魚胚胎半數(shù)致畸質(zhì)量濃度（120 h）EC50=1.36 mg·L-1，將母液依次稀釋成含丙草胺0.50、1.00、1.50 mg·L-1進(jìn)行染毒，所有染毒液中丙酮的濃度≤0.01%。將30 mL染毒液轉(zhuǎn)移到直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，每皿中移入受精后6 h的受精卵50顆，每處理重復(fù)3次，設(shè)置溶劑對(duì)照和空白對(duì)照（CK），將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱（26±1℃）培養(yǎng)，光/暗周期為14 h∶10 h。整個(gè)染毒周期為6～120 hpf（Hour post fertilization）。上述操作重復(fù)2組，一組用來調(diào)查畸形表型和比例，另一組用作基因表達(dá)分析。

1.4 魚胚胎染毒觀察指標(biāo)

120hpf染毒結(jié)束后，在體式顯微鏡下觀察斑馬魚仔魚的畸形表型及采集圖像，計(jì)算各種畸形表型的比例。

1.5 基因表達(dá)分析

隨機(jī)取不同組斑馬魚胚胎（48、72 hpf）或幼魚（120 hpf）各30枚（條），用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒（AXYGEN）進(jìn)行總RNA抽提，提取所得總RNA用NanoDrop ND-2000C紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher）測定RNA質(zhì)量和濃度。等量的總RNA（2 μg）通過PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus，TaKaRa）試劑盒說明書進(jìn)行目的基因的熒光檢測，目的基因和內(nèi)參基因引物序列參考見表1。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI-7500）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，采用兩步法進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，其程序設(shè)置為：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。QPCR的數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次RNA提取重復(fù)和3次QPCR平行管重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將所有的數(shù)據(jù)求出平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SE），使用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVO）中的LSD（Least significant difference）對(duì)處理組和對(duì)照之間差異顯著性進(jìn)行比較。使用Origin 8.0軟件作圖。

表1 熒光定量斑馬魚相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primers used for the quantification of the mRNA expression by QPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎期丙草胺暴露對(duì)斑馬魚仔魚的致畸效應(yīng)

丙草胺暴露后誘導(dǎo)斑馬魚仔魚（120 hpf）產(chǎn)生的畸形表型見圖1。斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包囊腫、游囊關(guān)閉、軀干彎曲等現(xiàn)象，且同一條仔魚可出現(xiàn)2～3種癥狀。試驗(yàn)中溶劑對(duì)照組斑馬魚仔魚沒有出現(xiàn)致畸現(xiàn)象。

圖2顯示丙草胺暴露斑馬魚胚胎至120 hpf，不同濃度暴露組仔魚產(chǎn)生畸形表型的百分比。隨著暴露濃度的增加，心包囊腫、脊柱彎曲、游囊關(guān)閉癥狀的嚴(yán)重程度增加。其中，0.50、1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚心包囊腫率分別為5.56%、15.56%和25.56%，與對(duì)照組相比，1.00 mg·L-1暴露組顯著升高（P＜0.05），1.50 mg·L-1暴露組極顯著升高（P＜0.01）；0.50、1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚脊柱彎曲率分別為6.67%、27.78%和35.56%，與對(duì)照組相比，1.00、1.50 mg·L-1暴露組均極顯著升高；0.50、1.00、1.50 mg·L-1暴露組仔魚游囊關(guān)閉率分別為20.00%、37.78%和60.00%，與對(duì)照組相比，0.50 mg·L-1暴露組顯著升高，1.00、1.50 mg·L-1暴露組均極顯著升高。

圖2 丙草胺暴露120 h斑馬魚仔魚的畸形率Figure 2 The malformation rate of larvae after zebrafish embryos exposed to pretilachlor for 120 h

圖1 丙草胺暴露120 h斑馬魚仔魚的畸形表型Figure 1 The malformation phenotype of zebrafish larvae after exposure to pretilachlor for 120 h

2.2 丙草胺暴露對(duì)斑馬魚心臟、脊椎和游囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

胚胎期丙草胺暴露后斑馬魚仔魚產(chǎn)生心包囊腫、脊柱彎曲、游囊關(guān)閉癥狀，因此選取了心臟、脊椎和游囊發(fā)育相關(guān)基因來研究丙草胺在分子水平上對(duì)斑馬魚胚胎（仔魚）相關(guān)器官發(fā)育的影響（圖3）。結(jié)果表明，丙草胺暴露斑馬魚胚胎至48 hpf，1.00 mg·L-1暴露組Tbx2基因的表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），1.50 mg·L-1暴露組表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；丙草胺暴露斑馬魚胚胎至仔魚（120 hpf），1.50 mg·L-1暴露組BMP-2基因的表達(dá)水平顯著降低，1.00、1.50 mg·L-1暴露組BMP-4基因的表達(dá)水平極顯著降低；丙草胺暴露斑馬魚胚胎至72 hpf，1.50 mg·L-1暴露組shha基因的表達(dá)水平顯著降低，1.00、1.50 mg·L-1暴露組ihha基因的表達(dá)水平顯著降低。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)丙草胺暴露斑馬魚胚胎至120 hpf，斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包囊腫、脊柱彎曲、游囊關(guān)閉等癥狀，且隨著暴露濃度的增加，畸形表型的嚴(yán)重程度增加，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。心包囊腫、脊柱彎曲、游囊關(guān)閉等癥狀是許多環(huán)境化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)斑馬魚胚胎/仔魚產(chǎn)生的畸形表型[11，13-14]，心包囊腫具有不可逆性，一旦形成就難以自然消失[15]，將造成仔魚心臟的結(jié)構(gòu)異常和功能缺失，甚至威脅到斑馬魚的生存[11]。本試驗(yàn)中出現(xiàn)心包囊腫的仔魚2 d內(nèi)便會(huì)死亡。脊椎彎曲會(huì)導(dǎo)致仔魚游動(dòng)能力減弱，停留在培養(yǎng)皿底部，最終因缺氧和影響取食而死。斑馬魚游囊由前后兩個(gè)組成，后游囊在受精后4.5 d開始充氣，游囊通過充氣和放氣來調(diào)節(jié)魚體的比重，以控制魚體內(nèi)外的水壓平衡和身體沉浮，對(duì)于仔魚的呼吸和取食具有重要意義[16]。研究發(fā)現(xiàn)[17]游囊可以作為化學(xué)物質(zhì)暴露的特定靶標(biāo)器官，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)游囊關(guān)閉是丙草胺誘導(dǎo)斑馬魚仔魚出現(xiàn)的最敏感指標(biāo)，畸形比率高于其他兩種畸形表型，游囊關(guān)閉的仔魚游動(dòng)能力減弱而停留在培養(yǎng)皿底部，最終因缺氧和影響取食而死亡。

T-box基因家族在脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育中起重要作用，主要作用于脊椎動(dòng)物的早期心臟譜系決定、心室特化、房室分隔和胚胎傳導(dǎo)系統(tǒng)分化等[18]。其中，Tbx2基因在房室特異性分化和房室管形成方面發(fā)揮了重要的作用[19]。本研究中丙草胺暴露斑馬魚胚胎至48 hpf，1.00 mg·L-1暴露組Tbx2基因的表達(dá)水平極顯著降低，1.50 mg·L-1暴露組表達(dá)水平顯著降低，表明丙草胺可能通過抑制心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbx2的表達(dá)來影響心臟的發(fā)育，導(dǎo)致斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包囊腫現(xiàn)象。有關(guān)化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致斑馬魚心臟發(fā)育毒性的機(jī)理研究很多，心臟發(fā)育過程中Nkx2.5在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)、心房形成等方面起著重要作用[20]，章強(qiáng)等[14]報(bào)道低濃度銅通過下調(diào)Nkx2.5的上游基因Gata5來調(diào)控Nkx2.5的表達(dá)，從而影響斑馬魚胚胎的心臟發(fā)育。Tbx5轉(zhuǎn)錄因子在早期心臟發(fā)育，尤其是心房和左心室的發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用，Hong等[21]研究發(fā)現(xiàn)軟骨藻酸（DA）暴露后斑馬魚心臟發(fā)育異常，推斷DA是通過調(diào)控Tbx5影響鈣循環(huán)相關(guān)基因的表達(dá)而引起心臟發(fā)育毒性。丙草胺是否通過上述機(jī)理來誘導(dǎo)斑馬魚心包囊腫尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）是唯一能夠單獨(dú)誘導(dǎo)骨組織形成的局部生長因子，是骨組織形成過程中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。在骨形成早期，BMP-2不僅可使未分化間質(zhì)細(xì)胞向骨形成中心募集，并分化為骨系細(xì)胞，而且可使成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞及骨髓的基細(xì)胞逆轉(zhuǎn)分化為骨系細(xì)胞[22]；BMP-4可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化和發(fā)育[23]。本研究發(fā)現(xiàn)丙草胺暴露斑馬魚胚胎至仔魚（120 hpf），1.50 mg·L-1暴露組BMP-2基因的表達(dá)水平顯著降低，1.00、1.50 mg·L-1暴露組BMP-4基因的表達(dá)水平極顯著降低。這表明丙草胺可能通過抑制BMP-2和BMP-4的表達(dá)而影響骨骼細(xì)胞的正常分化，造成斑馬魚仔魚脊椎彎曲。研究發(fā)現(xiàn)Mef2在骨骼肌、心肌和平滑肌發(fā)育過程中的介導(dǎo)細(xì)胞分化中起主要作用，最突出的作用是控制肌細(xì)胞分化過程中的基因轉(zhuǎn)錄[24]，岳東等[11]研究發(fā)現(xiàn)，久效磷暴露斑馬魚胚胎可能通過促進(jìn)Mef2基因的表達(dá)而導(dǎo)致斑馬魚仔魚脊柱彎曲。研究表明MyoD、Myf5可調(diào)節(jié)骨骼肌的規(guī)范和分化[25]，丙草胺是否通過影響上述基因表達(dá)來誘導(dǎo)斑馬魚仔魚脊椎彎曲需進(jìn)一步通過試驗(yàn)驗(yàn)證。shha和ihha基因?qū)︳~鰾上皮層、中胚層和外層組織的分化和形成具有決定作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)丙草胺暴露斑馬魚胚胎至72 hpf，1.50 mg·L-1暴露組shha基因的表達(dá)水平顯著降低，1.00、1.50 mg·L-1暴露組ihha基因的表達(dá)水平顯著降低，表明丙草胺可能通過抑制shha和ihha基因的表達(dá)而影響游囊的正常分化和發(fā)育，造成斑馬魚仔魚游囊發(fā)育畸形。

4 結(jié)論

丙草胺暴露斑馬魚胚胎后干擾了心臟、骨骼和游囊相關(guān)基因的表達(dá)，引起斑馬魚仔魚相關(guān)器官的發(fā)育異常，進(jìn)而導(dǎo)致斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包囊腫、游囊關(guān)閉、軀干彎曲等畸形現(xiàn)象。

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Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish

LIU Ying,JIANG Lei,PAN Bo,LIN Yong
（Institute of Environment and Plant Protection,Academy of Tropical Agriculture Sciences of China,Haikou 571101,China）

To investigate the teratogenic effect and mechanism of abnormality of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish,the malformation phenotype and abnormality rate of the larvae were studied after embryos were esposed to 0.50,1.00 and 1.50 mg· L-1pretilachlor from 6 h post fertilization（hpf）to 120 hpf,and also the abnormality mechanism was investigated by testing the gene expression related organ development.The results showed that pretilachlor could induce malformations of larvae,including pericardial cyst,spinal curvature and uninflated swim bladder,and the percentage of three kinds of abnormalities increased with the increase of exposure dose.The pericardial cyst rate were 15.56%（P＜0.05）,25.56%（P＜0.01）and spinal curvature rate were 27.78%（P＜0.01）,35.56%（P＜0.01）respectively after embryo exposed to 1.00,1.50 mg·L-1pretilachlor.The uninflated swim bladder rate were 20%（P＜0.05）,37.78%（P＜0.01）,60%（P＜0.01）respectively after embryo exposed to 0.50,1.00,1.50 mg·L-1pretilachlor.mRNA expressions of heart development related gene Tbx2[1.00 mg·L-1（P＜0.01）,1.50 mg·L-1（P＜0.05）],skeleton development related genes BMP-2[1.50 mg·L-1（P＜0.05）],BMP-4[1.00 mg· L-1（P＜0.01）,1.50 mg·L-1（P＜0.01）]and swim bladder development related genes shha[1.50 mg·L-1（P＜0.05）],ihha[1.00 mg·L-1（P＜0.05）, 1.50 mg·L-1（P＜0.05）]were reduced significantly after embryos were esposed to pretilachlor.The results deduced that pretilachlor could induce heart,skeleton and swim bladder developmental anomaly by supressing the mRNA expressions of above-mentioned oragan development related gene.

pretilachlor；zebrafish；teratogenic effect；Tbx2；BMP-2；BMP-4；shha；ihha

X171.5

A

1672-2043（2017）03-0481-06

10.11654/jaes.2016-1418

劉迎，姜蕾，潘波，等.斑馬魚胚胎經(jīng)丙草胺暴露后對(duì)其仔魚致畸效應(yīng)的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（3）：481-486.

LIU Ying,JIANG Lei,PAN Bo,et al.Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（3）：481-486.

2016-11-08

劉迎（1981—），男，山東泰安人，助理研究員，主要從事農(nóng)藥安全性評(píng)價(jià)與應(yīng)用研究。E-mail：yingliu_zju@163.com

*通信作者：林勇E-mail：linyongty@163.com

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20153125）；海南省社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)（2015SF35）

Project supported：The Natural Science Foundation of Hainan Province，China（20153125）；Social Development of Science and Technology Projects of Hainan Province，China（2015SF35）