林芝青稞酒曲酵母菌的分離鑒定及性能測(cè)定

馬斌，隋超，馬長(zhǎng)中*

(西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000）

林芝青稞酒曲酵母菌的分離鑒定及性能測(cè)定

馬斌，隋超，馬長(zhǎng)中*

(西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000）

以西藏林芝八一鎮(zhèn)采購(gòu)青稞酒曲為樣品，對(duì)酒曲中的產(chǎn)酸、產(chǎn)酒精酵母菌進(jìn)行分離、鑒定及性能測(cè)定。結(jié)果表明，菌株Y1、Y7為脲酶陰性菌，使MRS培養(yǎng)基變黃，能利用多種氮源和碳源；菌株Y8、Y10為脲酶陽(yáng)性菌，能發(fā)酵多種糖類。根據(jù)個(gè)體形態(tài)、菌落特征、生理生化特征，初步鑒定菌株Y1、Y7為產(chǎn)酸酵母菌，菌株Y8、Y10為產(chǎn)酒精酵母。進(jìn)行了不同條件對(duì)酵母菌產(chǎn)酸和產(chǎn)酒精能力的影響實(shí)驗(yàn)及耐受性實(shí)驗(yàn)，并分析產(chǎn)酸酵母菌和產(chǎn)酒精酵母菌的發(fā)酵性能。其中，菌株Y1、Y7的產(chǎn)酸量分別為145.06 μg/mL、128.59 μg/mL，菌株Y8、Y10酒精度分別為2.84%vol、2.31%vol。

青稞酒曲；酵母菌；分離；鑒定；性能測(cè)定

青稞自古以來(lái)是西藏地區(qū)的重要主食也是開(kāi)發(fā)功能性食品的最佳原料[1]。青稞中含有多類酚類化合物[2]，酚類物質(zhì)具有預(yù)防心血管疾病和抗氧化作用[3]。此外，青稞中β-葡聚糖的含量達(dá)8.62%，具有降糖、降脂、降血壓等多種生理功能[4]，淀粉、蛋白均有較高的含量，同時(shí)含有人體所需的8種必需氨基酸、高于玉米兩倍的煙酸和多種對(duì)人體有益的礦物質(zhì)[5-7]。青稞用來(lái)釀酒已經(jīng)有悠久的歷史，早已成為西藏特色的飲品[8]。目前，青稞酒的種類很多，備受藏區(qū)人民的青睞，但還存在很多問(wèn)題，如口感不好、渾濁、沉淀等[9]。釀酒酵母是影響酒的重要影響因素之一，它的選擇會(huì)直接影響酒的感官和品質(zhì)[10-11]。

該實(shí)驗(yàn)從青稞酒曲中篩選產(chǎn)酸及產(chǎn)酒精能力強(qiáng)并且耐酸能力和耐酒精力強(qiáng)的菌株，無(wú)論采用單一發(fā)酵還是混合發(fā)酵，對(duì)縮短青稞酒的發(fā)酵時(shí)間和風(fēng)味的改善具有較大影響，對(duì)青稞酒的工業(yè)化純種發(fā)酵改善奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞酒曲：西藏林芝八一鎮(zhèn)農(nóng)家自制；無(wú)水乙醇、肌酸、已胺、硝酸鉀、亞硝酸鹽等所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；液化酶（2 000 U/g）：北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司；糖化酶（50 000 U/g）：湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、磷酸氫二鉀2 g、醋酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05g、碳酸鈣20g、瓊脂20g、吐溫-801.0g、蒸餾水1000mL。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母膏10 g、蛋白胨18 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。

豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽12g、蒸餾水100mL，煮沸20min，過(guò)濾取汁。

McClary培養(yǎng)基：葡萄糖10g、次氯酸鉀18g、醋酸鈉8g、酵母膏2.5 g、瓊脂20 g。

玉米瓊脂培養(yǎng)基：玉米粉6g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。

青稞培養(yǎng)基：青稞粉20 g、蒸餾水400 mL、氯化鈣0.022 g、液化酶0.02 g，糖化酶0.075 g，調(diào)pH6.2～6.4。

以上培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PR-CJT-4超凈工作臺(tái)：上海普瑞斯儀器有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：浙江托普儀器有限公司；MS-105電子天平、Easy Plus pH計(jì)：瑞士梅特勒公司；2102PCS紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海尤尼柯公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

取粉碎好的青稞酒曲1 g，放入裝有20 mL無(wú)菌水的小燒杯中，充分搖勻后，用移液槍準(zhǔn)確吸取0.5 mL，加入裝有4.5 mL無(wú)菌水試管中制成菌懸液后逐級(jí)稀釋，稀釋至10-1～10-9。分別取9個(gè)梯度的菌懸液100 μL，滴加到MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，進(jìn)一步劃線分離純化，觀察酵母菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)，對(duì)分離得到的酵母進(jìn)行初步鑒定，并進(jìn)行保藏[13-15]。

1.3.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化的菌株活化后以6%的接種量接入YEPD培養(yǎng)基[16]，25～28℃條件下培養(yǎng)3 d后觀察菌落形態(tài)[17]。根據(jù)酵母菌的有性生殖主要形成子囊孢子，可將其劃分為生孢子酵母和無(wú)孢子酵母，待鑒定菌株用YEPD培養(yǎng)基移接2～3代，再以生長(zhǎng)旺盛的培養(yǎng)物移種于產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，涂片觀察子囊飽子的形狀和表面紋飾。同時(shí)采用劃線法接種于薄層玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上，用顯微鏡觀察記錄蓋片下劃線兩旁是否形成假菌絲。

1.3.3 生理生化鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》和《The yeast，a taxonomy study》進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 酵母菌的性能測(cè)定

選取經(jīng)過(guò)分離鑒定的菌株進(jìn)行試驗(yàn)，菌種活化后的菌以2%的比例接種到青稞粉培養(yǎng)基上，測(cè)定產(chǎn)酸及產(chǎn)酒精酵母菌最適生長(zhǎng)條件，溫度和pH對(duì)酵母菌產(chǎn)酸和產(chǎn)酒精能力的影響，酵母菌的耐受性，產(chǎn)酸酵母菌的產(chǎn)酸量和產(chǎn)酒精酵母菌的產(chǎn)酒精量。

1.3.5 測(cè)定方法

生物量（OD660nm值）測(cè)定采用分光光度法；酸度測(cè)定采用pH計(jì)；酒精度測(cè)定采用甲基橙褪色法[18]；乳酸測(cè)定采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，觀察細(xì)菌個(gè)體特征，其酵母的菌落形態(tài)及特征見(jiàn)表1。由表1可知，其中疑似為酵母菌的菌株分別編號(hào)為Y1～Y10。據(jù)形態(tài)特征和MRS固體培養(yǎng)基有醇香味，可初步判定菌株Y2、Y6、Y8、Y10為產(chǎn)酒精酵母菌，菌株Y1、Y4、Y7的MRS培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，可初步判定菌株Y1、Y4、Y7為產(chǎn)酸酵母菌，菌株Y3在豆芽汁培養(yǎng)基為紅色，疑似紅酵母菌。

表1 酵母菌的菌落形態(tài)特征Table 1 Colony morphology characteristics of yeast

2.2 生理生化鑒定

表2 酵母菌生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of yeast

由表2可知，碳源同化實(shí)驗(yàn)中菌株Y6、Y8、Y10不能同化乳糖，葡糖糖、麥芽糖、D-半乳糖、蔗糖、乙醇、肌醇均能被同化，氮源同化實(shí)驗(yàn)中菌株Y1、Y7不同化乙胺，硝酸鉀、亞硝酸鹽、肌酸均能被同化，菌株Y8、Y10不同化肌酸，硝酸鉀、亞硝酸鹽、乙胺均能被同化，菌株Y2、Y4、Y5不同化硝酸鉀，乙胺、亞硝酸鹽、肌酸均能被同化。菌株Y1可同化生類淀粉，菌株Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10能耐50%葡萄糖的高滲透壓，在60%葡萄糖的高滲透壓及37℃條件下10株菌都不生長(zhǎng)，菌株Y3、Y4、Y8、Y10脲酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)菌株Y9生出菌膜，菌株Y3能同化多種糖類而不能發(fā)酵酒精，初步鑒定菌株Y3為紅酵母（Rhodotorula），菌株Y2、Y4、Y5為假絲酵母（Candida），菌株Y6為卡爾斯伯酵母（Saccharomycescarlsberyensis），菌株Y9為球擬酵母（Torulopsis）。

綜合以上實(shí)驗(yàn)，菌株Y1、Y7鑒定為產(chǎn)酸酵母，菌株Y8、Y10鑒定為產(chǎn)酒精酵母，從實(shí)驗(yàn)室存有的產(chǎn)酸酵母和產(chǎn)酒酵母菌中分別挑選Y11、Y12用作對(duì)比開(kāi)展以下實(shí)驗(yàn)。

2.3 酵母菌的性能測(cè)定

2.3.1 產(chǎn)酸及產(chǎn)酒精酵母菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

6株菌株（Y1、Y7、Y8、Y10、Y11、Y12）經(jīng)活化后，在青稞培養(yǎng)基接種1%（V/V），在26℃、28℃、30℃、32℃、34℃培養(yǎng)24 h，測(cè)其OD660nm值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酵母菌最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定Fig.1 Determination of optimum growth temperature of yeast

由圖1可知，菌株Y1、Y7和Y11的OD660nm值在26～32℃范圍內(nèi)逐漸增大，在32～34℃范圍內(nèi)逐漸變?。籝10、Y12的OD660nm值在26～30℃范圍內(nèi)逐漸增大，在30～34℃范圍內(nèi)逐漸變??；Y8的OD660nm值在26～28℃范圍內(nèi)隨溫度增加而增大，在30～34℃逐漸變小。結(jié)果表明，菌株Y1、Y7和Y11的最適生長(zhǎng)溫度為32℃，菌株Y10、Y12的最適生長(zhǎng)溫度為30℃；菌株Y8的最適生長(zhǎng)溫度為28℃。

2.3.2 產(chǎn)酸及產(chǎn)酒精酵母菌最適pH的生長(zhǎng)測(cè)定

圖2 酵母菌最適生長(zhǎng)pH的測(cè)定Fig.2 Determination of optimum growth pH of yeast

6株菌株（Y1、Y7、Y8、Y10、Y11、Y12）經(jīng)活化后，在pH 4.5、4.7、4.9、5.1、5.3、5.5、5.7、5.9、6.1、6.3、6.5青稞培養(yǎng)基接種1%（V/V），在各自最適溫度培養(yǎng)24 h，測(cè)其OD660nm值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，菌株在相同pH范圍內(nèi)OD660nm值的變化幅度不盡相同，菌株在pH4.5時(shí)收到明顯的抑制，OD660nm值在pH4.5～6.5范圍內(nèi)與pH值成正比。菌株Y8、Y10和Y12的OD660nm值在pH4.5～5.5、5.7～6.5隨pH值增大而增大，在5.5～5.7內(nèi)出現(xiàn)OD660nm值降低的現(xiàn)象，但總體呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。因此，最適生長(zhǎng)pH均值為6.5。

2.3.3 溫度對(duì)酵母菌產(chǎn)酸和產(chǎn)酒精能力的影響

6株菌株（Y1、Y7、Y8、Y10、Y11、Y12）經(jīng)活化后，在pH6.5青稞培養(yǎng)基接種1%（V/V），在28℃、30℃、32℃、34℃培養(yǎng)24h，測(cè)定菌株Y1、Y7、Y11培養(yǎng)液的pH值，在26℃、28℃、30℃、32℃培養(yǎng)24h，測(cè)定菌株Y8、Y10、Y12培養(yǎng)液的酒精度，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)酵母菌產(chǎn)酸(A)及產(chǎn)酒(B)能力的影響Fig.3 Effect of temperature on acid-producing(A)and alcoholproducing(B)capacity of yeast

由圖3A可知，菌株Y1在32℃，最低pH 4.06；菌株Y7在32℃，最低pH4.12，菌株Y11在33℃，最低pH4.18。菌株Y1產(chǎn)酸最強(qiáng)，菌株Y7次之、菌株Y11最弱，菌株Y1、Y7產(chǎn)酸最適溫度為32℃，菌株Y11產(chǎn)酸最適溫度為33℃。

由圖3B可知，菌株Y8和Y10，在26～29℃，隨溫度的增加，酒精度減少，在29～32℃，隨溫度的增加，酒精度增加。菌株Y12在26～28℃隨溫度的增加，酒精度減少，在28～32℃，隨溫度的增加，酒精度增加。菌株Y8在26℃，酒精度最高為0.652%vol；菌株Y10在26℃，酒精度最高為0.622%vol；菌株Y12在32℃，酒精度最高為0.721%vol。菌株Y8和Y10產(chǎn)酒精最適溫度為26℃，菌株Y12產(chǎn)酒精最適溫度為32℃。

2.3.4 pH對(duì)酵母菌產(chǎn)酸和產(chǎn)酒精能力的影響

6株菌株（Y1、Y7、Y8、Y10、Y11、Y12）經(jīng)活化后，在pH 6.2、6.4、6.6、6.8、7.0青稞培養(yǎng)基接種1%（V/V），在各自產(chǎn)酸、產(chǎn)酒精的最適溫度培養(yǎng)24h，測(cè)定pH值、酒精度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)酵母菌產(chǎn)酸(A)及產(chǎn)酒(B)能力的影響Fig.4 Effect of pH on acid-producing(A)and alcohol-producing(B) capacity of yeast

由圖4A可知，菌株Y1、Y7、Y11在pH6.2～7.0時(shí)，pH值減小，其有效酸度在逐漸增大，3株菌的最適產(chǎn)酸pH值為7.0。由圖4B可知，菌株Y8在pH6.2～6.6時(shí)，酒精度隨pH值的增加呈下降趨勢(shì)，pH6.6～7.0時(shí)，酒精度比較穩(wěn)定，其酒精發(fā)酵最適pH值為6.2；菌株Y10在pH6.2～6.4時(shí)，酒精度隨pH值的增加呈下降趨勢(shì)，在pH6.4～7.0時(shí)，酒精度隨pH值的增加而增加，其酒精度較穩(wěn)定，其酒精發(fā)酵最適pH值為6.2；菌株Y12在pH6.2～6.4時(shí)，酒精度隨pH值的增加呈下降趨勢(shì)，再pH6.4～7.0時(shí)，酒精度比較穩(wěn)定，其酒精發(fā)酵最適pH值為6.4。

2.3.5 產(chǎn)酸及產(chǎn)酒酵母的耐受性

6株菌株（Y1、Y7、Y8、Y10、Y11、Y12）經(jīng)活化后，青稞培養(yǎng)基接種1%（V/V），在各自產(chǎn)酸、產(chǎn)酒精的最適溫度及pH值培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD660nm值，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5A可知，菌株pH值與OD660nm成正比，說(shuō)明在酸度較強(qiáng)的環(huán)境下，酵母菌的的生長(zhǎng)都受到了抑制。由圖5B可知，隨酒精度的增加菌株生長(zhǎng)受到抑制，雖然菌株的耐受力各有不同，但都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)酒精度為9%vol時(shí)菌株的代謝活動(dòng)受到明顯的抑制，產(chǎn)酒酵母相對(duì)酒精的耐受力更強(qiáng)。

圖5 pH(A)及酒精度(B)對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of pH(A)and alcohol content(B)on yeast growth

2.3.6 酵母菌的產(chǎn)酸、產(chǎn)酒能力測(cè)定

6株菌株（Y1、Y7、Y8、Y10、Y11、Y12）經(jīng)活化后，青稞培養(yǎng)基接種1%（V/V），在各自產(chǎn)酸、產(chǎn)酒精的最適溫度及pH值培養(yǎng)96 h，分別測(cè)定其乳酸含量及酒精度，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 酵母菌產(chǎn)酸、產(chǎn)酒能力比較Fig.6 Comparison of acid-producing and alcohol-producing capacity of yeast

由圖6可知，菌株Y1產(chǎn)酸能力最強(qiáng)（145 μg/mL），菌株Y7產(chǎn)酸能力次之（129 μg/mL），菌株Y11產(chǎn)酸能力最弱（83 μg/mL）。菌株Y10、Y78、Y12的產(chǎn)酒精度分別為2.84%vol、2.31%vol、2.25%vol，菌株Y10產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，菌株Y8產(chǎn)酸能力次之，菌株Y12產(chǎn)酸能力最弱。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從青稞中分離出產(chǎn)酸酵母Y1、Y7，其中菌株Y1產(chǎn)酸量為145 μg/mL，菌株Y7產(chǎn)酸量為129 μg/mL；分離得到產(chǎn)酒酵母Y8、Y10，其中菌株Y8酒精度為2.31%vol，菌株Y10酒精度為2.84%vol。菌株Y1、Y7、Y8、Y10具有純種液態(tài)發(fā)酵青稞酒的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)雖然沒(méi)有對(duì)菌種進(jìn)行分子水平上的鑒定，但篩選的菌種具有發(fā)酵青稞就得優(yōu)良性質(zhì)，目前市場(chǎng)上銷售青稞酒的酒精度＞1%vol和＞3%vol兩種類型，酸度并沒(méi)有標(biāo)注，菌株Y1、Y7、Y8、Y10對(duì)單一發(fā)酵或者是混合發(fā)酵都是較大的進(jìn)步，為下一步發(fā)酵優(yōu)質(zhì)青稞酒奠定基礎(chǔ)。

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Separation,identification and performance determination of yeast from barley wine starters in Linzhi

MA Bin,SUI Chao,MA Changzhong*
(College of Food Science,Tibet Agricultural and Animal Husbandry College,Linzhi 860000,China)

Using the barley wine starters from Bayi town,Linzhi,Tibet as simple,the acid-producing and alcohol-producing yeasts in barley wine starters were separated and identified,and their performances were determined.The results showed that the strains Y1and Y7were urease-negative bacteria,could make the MRS medium turn yellow and take advantage of a variety of carbon and nitrogen sources.The strains Y8and Y10were urease-positive bacteria,could ferment a variety of sugars.According to the individual morphology,colony characteristics,physiological and biochemical characteristics,the strains Y1and Y7were preliminarily identified as acid-producing yeast,strains Y8and Y10were preliminarily identified as alcohol-producing yeasts.The effects of different conditions on the acid-producing and alcohol-producing capacity of yeasts and their tolerance were researched,the fermentation performance of the acid-producing and alcohol-producing yeasts were analyzed.The acid productions of strains Y1and Y7were 145.06 μg/ml and 128.59 μg/ml,respectively.The alcohol contents of strains Y8and Y10were 2.84%vol and 2.31%vol,respectively.

barley wine starters;yeast;separation;identification;performance determination

TS261.11

0254-5071（2017）02-0080-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.017

2016-11-08

西藏野生特色生物資源開(kāi)發(fā)平臺(tái)資助項(xiàng)目（Kypt2014-04）；西藏自治區(qū)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)項(xiàng)目

馬斌（1993-），男，本科生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

*通訊作者：馬長(zhǎng)中（1975-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)楦咴厣r(nóng)畜產(chǎn)品加工及貯藏。