土家族藥三百棒提取物對大鼠肢體缺血再灌注損傷血清SOD與MDA水平的影響*

盧衛(wèi)忠 周 杰 姜仁建 劉正敏胡志芬 曹洪輝 劉金坤 王 琴

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

·研究報告·

土家族藥三百棒提取物對大鼠肢體缺血再灌注損傷血清SOD與MDA水平的影響*

盧衛(wèi)忠 周 杰 姜仁建 劉正敏△胡志芬 曹洪輝 劉金坤 王 琴

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

目的 觀察血清超氧化物歧化酶（SOD）與丙二醛（MDA）變化，探尋三百棒提取物對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機制。方法 66只SD大鼠隨機分為對照組、缺血再灌注組和三百棒提取物干預(yù)組。對照組動物不給藥物，缺血-再灌注組于缺血前12 h、缺血時和再灌注時各給予0.9%氯化鈉注射液1 mL灌胃；三百棒提取物干預(yù)組于缺血前12 h、缺血時和再灌注時各給予三百棒提取物1 mL灌胃，分別于相應(yīng)時間點在麻醉下抽取各組動物下腔靜脈血，測量血清中SOD和MDA的含量。結(jié)果 與缺血-再灌注組相比，三百棒提取物干預(yù)組各時間點大鼠血清SOD水平明顯上升，而MDA水平明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論 三百棒提取物能增加SOD信號通路表達(dá)，減少MDA通路啟動，對大鼠肢體缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

提取物 三百棒 缺血再灌注損傷 肢體 SOD MDA

肢體缺血再灌注損傷（IR）［1］指缺血肢體在恢復(fù)血液供給后，微觀細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭破壞，組織器官損傷加重的現(xiàn)象廣泛存在于組織損傷恢復(fù)過程中。IR的發(fā)病機理尚不完全明確，目前有研究認(rèn)為其損傷嚴(yán)重程度與三磷酸腺苷（ATP）減少、自由基增多、細(xì)胞器破壞相關(guān)；而超氧化物歧化酶（SOD）為內(nèi)源性抗氧化因子，來源于線粒體及過氧化物酶體，廣泛存在于細(xì)胞漿中，具有消耗自由基的作用，減少細(xì)胞損害，能有效保護(hù)再灌注損傷之組織；丙二醛（MDA）通過影響線粒體呼吸鏈的正常工作，從而加重IR嚴(yán)重程度［2］。因此，SOD及MDA水平是預(yù)測IR嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［3］。土家族藥三百棒，又名飛龍掌血，為蕓香科植物飛龍掌血的根，具有散瘀、止血等功效，既往研究證實其具有改善循環(huán)［4］、抗炎鎮(zhèn)痛［5］作用，能有效改善肢體缺血再灌注損傷，其作用機制可能與SOD及MDA表達(dá)相關(guān)。本研究通過建立IR大鼠模型，觀察三百棒提取物對其IR大鼠血清SOD和MDA的影響，探討三百棒提取物對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 66只SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，批號SYXK（渝）2016-0001，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。按照隨機數(shù)字法分為對照組、缺血再灌注組（IR組）和三百棒提取物干預(yù)組（TIR組）。其中對照組6只；IR組30只，分為再灌注后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h組，每組各6只；T-JR組30只，分為再灌注后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h組，每組各6只。

1.2 三百棒提取物制備 三百棒提取物由重慶市中醫(yī)院制劑室制備，具體方法為［6］：將10 kg三百棒原藥加入適量蒸餾水［料液比1∶20（g/mL）］，煎煮20 min后去渣，取3000 mL煎煮液在70℃下濃縮，得粉末狀提取物0.5 kg，裝瓶備用，使用時采用1∶1與蒸餾水混合。

1.3 試驗材料 SOD測定試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司），MDA測定試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司），10%水合氯醛 （購自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院制藥廠），無水乙醇（購自湖南師范大學(xué)化學(xué)試劑廠，分析純），蒸餾水、旋渦混勻器、低溫冰箱、離心沉淀器、微量式移液器（200 μL，1 mL）、普通手術(shù)器械均由重慶市中醫(yī)院動物實驗室提供。

1.4 動物模型建立 對照組大鼠用橡皮筋松弛環(huán)繞右后肢，不阻斷血流；IR組和T-IR組按姜仁建［7］報道的方法復(fù)制SD大鼠后肢缺血-再灌注模型：用橡皮筋環(huán)繞在一直徑2～3 cm的硬塑料管上備用，將纏繞了橡皮筋的塑料管套入麻醉后的大鼠右后肢并盡量推向大腿根部，然后將橡皮筋從管上退下。由于橡皮筋的回縮力，便可緊緊地結(jié)扎于后肢根部，壓迫股動脈而阻斷后肢的血流（此時大鼠足趾蒼白表現(xiàn)為缺血狀，而非青紫瘀血）。當(dāng)大鼠后肢缺血4 h后，用手術(shù)刀片割斷橡皮筋，并輕揉結(jié)扎處以利血液流通，此時大鼠足趾漸漸轉(zhuǎn)為紅潤。

1.5 給藥方法 對照組動物不給藥物；IR組于缺血前12 h、缺血時和再灌注時各給予1 mL 0.9%氯化鈉注射液灌胃；T-IR組于缺血前12 h、缺血時和再灌注開始時各給予1 mL三百棒提取物灌胃。

1.6 標(biāo)本采集 各組動物于相應(yīng)時間點行水合氯醛（5 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后仰臥位固定于自制鼠手術(shù)臺。剪去相應(yīng)腹部區(qū)域毛發(fā)，絡(luò)合碘消毒，然后沿腹部中線切開，行下腔靜脈穿刺，抽出靜脈血，分離血清放低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 血清SOD及MDA水平測量 具體操作方法嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說明書執(zhí)行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，用t檢驗進(jìn)行組間比較；重復(fù)測量計量資料采用重復(fù)測量資料的方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中SOD水平比較 見表1。與對照組比較，IR組和T-IR組在再灌注后4 h、8 h、16 h大鼠血清SOD水平明顯下降 （P＜0.05）。與IR組比較，T-IR組在再灌注后4 h、8 h、16 h大鼠血清SOD水平明顯上升（P＜0.05）。

表1 各大鼠血清中SOD水平比較（ng/mL，±s）

表1 各大鼠血清中SOD水平比較（ng/mL，±s）

與IR組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05。下同。

2.2 各大鼠血清中MDA水平比較 見表2。與對照組比較，IR組和T-IR組在再灌注后4 h、8 h、16 h大鼠血清MDA水平明顯升高（P＜0.05）。與IR組比較，T-IR組在再灌注后4 h、8 h、16 h大鼠血清MDA水平明顯下降（P＜0.05）。

表2 各大鼠血清中MDA水平比較（ng/mL，s）

表2 各大鼠血清中MDA水平比較（ng/mL，s）

組別 n 0 h 2 h 4 h 8 h 16 h對照組 6 IR組 6 41.22±0.50 41.22±0.50 41.22±0.50 41.19±0.60 42.87±0.63 61.28±0.81△41.22±0.50 41.22±0.50 68.52±0.56△66.24±0.62△T-IR組 641.81±0.58 42.66±0.50 54.92±0.24*△56.36±0.56*△53.80±0.50*△

3 討 論

長時間缺血和缺血后再灌注可造成細(xì)胞和組織的損傷，缺血再灌注時氧衍生的自由基主要通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起細(xì)胞損傷。在生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)同時存在以SOD介導(dǎo)的氧自由基反應(yīng)和MDA介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對機體新陳代謝起著重要作用。正常情況下兩者處于協(xié)調(diào)與動態(tài)平衡狀態(tài)，維持著體內(nèi)許多生理生化反應(yīng)和免疫反應(yīng)［8］。SOD是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，能催化氧自由基轉(zhuǎn)變成過氧化氫與氧氣，清除再灌注過程中產(chǎn)生的氧自由基，保護(hù)肢體，因此SOD是重要的氧自由基清除劑，其活性強弱反映自由基的清除水平［9］。MDA是自由基引起的脂質(zhì)過氧化終末代謝產(chǎn)物，如果自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)便可產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的MDA，MDA的濃度可反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度，并間接反映自由基的多少，還可間接了解肢體缺血再灌注損傷程度，作為評價防治措施效果的重要指標(biāo)［10-11］。MDA在體內(nèi)通過影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，從而影響ATP的生成。當(dāng)肢體發(fā)生缺血再灌注損傷時，機體通過黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)、中性粒細(xì)胞氧化酶系統(tǒng)、線粒體電子傳遞系統(tǒng)，產(chǎn)生大量化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷难踝杂苫?，若這些氧自由基得不到SOD的及時中和，便產(chǎn)生大量MDA，會導(dǎo)致組織細(xì)胞功能、結(jié)構(gòu)受損，且這種反應(yīng)為持續(xù)性鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，容易形成惡性循環(huán)［12］。因此，通過增強SOD信號通路的表達(dá)或減少MDA信號通路啟動的藥物可弱化缺血再灌注損傷細(xì)胞的自我消滅，有利于度過再灌注過程中能量瓶頸，從而對缺血再灌注損傷細(xì)胞和組織起到保護(hù)作用。

土家族藥三百棒，作為土家族治療軟組織損傷、骨折的傳統(tǒng)藥物，其療效顯著、歷史悠久?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)三百棒富含香豆素類、生物堿、甾醇、樹脂及揮發(fā)油等物質(zhì)［13］，具有抗凝、擴(kuò)血管、改善毛細(xì)血管通透性等作用［14-16］，可改善機體氣血瘀滯狀態(tài)，有利于機體抵抗缺血再灌注損傷。

本研究將三百棒提取物用于防治大鼠肢體缺血再灌注損傷，觀察三百棒提取物對大鼠肢體缺血再灌注損傷后血清MDA和SOD水平的影響。結(jié)果表明，在給予三百棒提取物作用后，大鼠肢體缺血再灌注損傷后血清MDA水平明顯下降，而SOD水平升高。本研究提示三百棒提取物可增加SOD信號通路的表達(dá)，減少MDA通路的啟動，有利于細(xì)胞線粒體適應(yīng)缺氧狀態(tài)，提高能量轉(zhuǎn)化與供應(yīng)，減少組織破壞，促進(jìn)損傷后組織功能恢復(fù)，對大鼠肢體缺血再灌注損傷起到明顯的保護(hù)作用。

［1］ Zhang jia qiang，Wang Qiang，et al.Ischemic preconditioning produces more powerful anti-inflammatory and cardioprotective effects than limb remote ischemic postconditioning in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury［J］.Chinese Medical Journal，2013，126（20）：3949-3955.

［2］ Dmitry Shvartsman，Hannah Storrie-White，et al.Sustained delivery of vegf maintains innervation and promotes reperfusion in ischemic skeletal muscles via ngfgdnf signaling［J］. The American Society of Gene and Cell Therapy，2014，22（7）：1243-1253.

［3］ 朱付平，周鈺龍，等.桃紅四物液對肢體缺血再灌注損傷大鼠血清SOD與MDA的影響［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2015，3（21）：19-21.

［4］ 任先達(dá).飛龍掌血水提物的擴(kuò)血管作用及原理初探討［J］.暨南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，1990，11（2）：30-33.

［5］ 郝小燕，彭琳.飛龍掌血生物總堿抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2004，2（6）：450-452.

［6］ 田春蓮，吳文滔，等.飛龍掌血多糖提取工藝研究［J］.中藥材，2010，33（3）：462-464.

［7］ 朱付平，姜仁建，等.復(fù)灌Ⅰ號注射液對大鼠肢體缺血-再灌注損傷骨骼肌鈣調(diào)蛋白表達(dá)的影響［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2012，2（6）：8-10.

［8］ 許朝龍，苗志釗，等.小檗堿對梗阻性黃疸大鼠肝細(xì)胞線粒體能量代謝的保護(hù)作用［J］.武漢大學(xué)學(xué)報，2016，37（2）：183-186.

［9］ Smith JK，Grisham MB，Granger DN，et al.Free radical defense mechanisms and neutrophil infiltration in postischemic skeletal muscle［J］.Am J Physiol，1989，256（4）：H789.

［10］Novelli GP，Adembri C，Gandini E，et al.Vitamin E protects human skeletal muscle from damage during surgical ischemia reperfusion［J］.Am J Surg，1997，173（3）：206-209.

［11］Feng F.Biochemical metabolism and oxygen free radical changes following ischemic and reperfused injured limbs：an experimental study［J］.Chung Hua Wai Ko Tsa Chih，1990，28（11）：693-704.

［12］張勁均，羅文穎，等.黃芪注射液對大鼠缺血再灌注損傷小腸黏膜氧化損傷的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2008，29（6）：716-719.

［13］房士明，徐堯，等.飛龍掌血化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.國際藥學(xué)研究雜志，2016，43（2）：239-248.

［14］劉志剛，王翔宇，等.飛龍掌血的止血活性及其機制的研究［J］.華西醫(yī)學(xué)雜志，2016，31（2）：157-159.

［15］司書毅，生田安喜良，等.蕓香科植物飛龍掌血愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物生物堿成分的研究［J］.中草藥，2000，31（8）：573-574.

［16］Heyuan Qiu，Xiaohua Xiao，et al.Separation and purification of furanocoumarins from Toddalia asiatica （L.）Lam.using microwave-assisted extraction coupled with high-speed counter-current chromatography［J］.Journal of separation science，2012，35（7）：901-906.

The Influence of Toddalia Asiatic Extract in Tujia Medicine on the Level of Serum SOD and MDA inRats with Limb Ischemia Reperfusion Injury

LU Weizhong，ZHOU Jie，JIANG Renjian，et al. Traditional Chinese Medical Hospital of Chongqing，Chongqing 400021，China.

Objective：To investigate the protection of Toddalia asiatic extract in Tujia medicine in rats with limb ischemia reperfusion injury by observing the changes of serum SOD and MDA.Methods：66 SD rats were randomly divided into the control group，ischemia-reperfusion group and Toddalia asiatic extract intervention group.The control group were not given drug，and ischemia-reperfusion group were gavaged with 1 mL 0.9%NS，in the first 12 h prior to ischemia and ischemia and reperfusion；the Toddalia asiatic extract intervention group in the first 12 h，ischemia and reperfusion were given 1 mL of Toddalia asiatic extracts.Inferior vena venous blood was extracted respectively in the corresponding time points in anesthesia to measure the contents of serum SOD and MDA.Results：Compared with ischemia-reperfusion group，serum SOD level in Toddalia asiatic extract intervention group increased at each time point，while the MDA level significantly decreased（P＜0.05）.Conclusions：Tujia medicine Toddalia asiatic extract can increase signal path expression of SOD，reduce pathways start of MDA with a protective effect on limb ischemia reperfusion injury in rats.

Toddalia asiatica extract；Ischemic-Reperfusion Injury；SOD；MDA

R285.5

A

1004-745X（2017）02-0226-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.012

2016-11-14）

重慶市科委科研院所基本科研業(yè)務(wù)費計劃項目（cstc2015jbky330025007）

△通信作者（電子郵箱：luweizhong1967@163.com）