益氣活血通絡(luò)方對(duì)博萊霉素致肺纖維化大鼠TGF-β1/Smads信號(hào)通路的作用機(jī)制研究*

周 薇 涂 艷

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，湖北 武漢 430000）

·研究報(bào)告·

益氣活血通絡(luò)方對(duì)博萊霉素致肺纖維化大鼠TGF-β1/Smads信號(hào)通路的作用機(jī)制研究*

周 薇 涂 艷△

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，湖北 武漢 430000）

目的 觀察益氣活血通絡(luò)方對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化影響及作用機(jī)制。方法 將60只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、激素組、中藥組。除空白組外，其余各組采用博來(lái)霉素5 mg/kg行氣管注射復(fù)制肺纖維化模型。造模后，激素組和中藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，空白組和模型組以0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次。28 d后處死大鼠，Masson染色觀察肺組織病理學(xué)，稱量肺質(zhì)量并計(jì)算肺系數(shù)，Jamall法測(cè)定肺組織中羥脯氨酸（HYP）的含量，Western blot法檢測(cè)大鼠肺組織TGF-β1，Smad2、Smad7蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，激素組肺系數(shù)、HYP下降（P＜0.05），中藥組肺系數(shù)、HYP顯著下降（P＜0.01）；與空白組大鼠比較，模型組大鼠的肺組織中TGF-β1和Smad2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01），Smad7蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）；與模型組大鼠比較，激素組、中藥藥能顯著下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01），激素組能夠下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中Smad2蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05）、上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05），中藥組能夠顯著下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中Smad2蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01）、上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01）。結(jié)論 益氣活血通絡(luò)方可以逆轉(zhuǎn)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織纖維化情況，調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)。

益氣活血通絡(luò)方 肺纖維化 博萊霉素 TGF-β1/Smads信號(hào)通路

肺（間質(zhì)）纖維化（PF）是以多種原因?qū)е碌囊浴皬浡苑闻菅装Y、成纖維細(xì)胞形成以及細(xì)胞外基質(zhì)的修復(fù)與過(guò)度沉積”為主要病理特征的呼吸系統(tǒng)疾?。?］。其臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的呼吸困難，患者疾病后期肺功能嚴(yán)重受損，發(fā)生呼吸衰竭而死亡［2］。目前該病的發(fā)病機(jī)制未明，尚缺乏有效防治措施［3］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）作為公認(rèn)的最重要的致纖維化因子，可依賴于Smads蛋白家族介導(dǎo)信號(hào)通路，直接或間接調(diào)控上述機(jī)制，減輕肺組織ECM的生成和沉積［4］。我院以氣絡(luò)失和為其中醫(yī)病機(jī)，采用益氣活血、化痰通絡(luò)之法，創(chuàng)立益氣活血通絡(luò)方治療PF，臨床獲得較好療效。本實(shí)驗(yàn)以博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型，觀察益氣活血通絡(luò)方對(duì)肺組織病理學(xué)及TGF-β1/Smads信號(hào)通路中關(guān)鍵因子表達(dá)的影響，來(lái)探究本方對(duì)大鼠PF的作用及相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，3月齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（鄂）2008-0005］，在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度21～26℃，相對(duì)濕度50%～70%，人工12 h晝夜循環(huán)照明的環(huán)境中，分籠飼養(yǎng)。每日定時(shí)清洗籠舍，大鼠自由攝食及飲水。

1.2 藥物 酸博萊霉素 （日本化藥株式會(huì)社；批號(hào)130621，規(guī)格15 mg/支）；地塞米松片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司；批號(hào)H44024469；規(guī)格0.75 mg×100片）；益氣活血通絡(luò)方湯，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院中藥藥房提供，組方：黃芪30 g，太子參20 g，麥冬20 g，五味子15 g，丹參10 g，地龍10 g，水蛭10 g，川貝母6 g，靈芝3 g，甘草6 g。以上藥物由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑室制備并濃縮。具體方法：制備前將藥材浸泡2 h，武火煮沸后用微火煎煮40 min，過(guò)濾、收集藥液，原藥渣加水武火煮沸、微火煎煮20 min后得第2煎，將2煎液混合，于恒溫器濃縮至每毫升含生藥2 g，高壓滅菌后，-20℃保存，灌胃使用前1∶1超純水稀釋，置于37℃水浴預(yù)溫。

1.3 試劑與儀器 Masson染色試劑盒；HYP試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒（上海碧云天公司）；一抗為TGF-β1、Smad2、Smad7單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；小鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗 （上海碧云天公司）；光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；超低溫冰箱（德國(guó)Jouan公司）；高速離心機(jī) （德國(guó)Sigma公司）；YY-Ⅲ28A型電泳儀、DYY-Ⅲ40B電泳槽 （北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

1.4 分組與造模 將60只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、激素組、中藥組，每組15只，3.5%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，取仰臥位，進(jìn)行常規(guī)頸部消毒，切開(kāi)皮膚，鈍性分離組織，充分暴露氣管，于氣管環(huán)狀軟骨間隙穿刺，灌注博萊霉素（5 mg/kg），注射完畢后變換大鼠體位，使博萊霉素均勻分布于肺部組織，最后逐層縫合。空白組氣管注入同等劑量無(wú)菌0.9%氯化鈉注射液。空白組大鼠皮毛光澤，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)自如，飲食及大便正常。共造模45只大鼠，均出現(xiàn)不同程度的精神倦怠，消瘦食少，模型組死亡4只，激素組死亡2只，中藥組死亡1只。

1.5 給藥方法 于造模次日，各組開(kāi)始藥物干預(yù)，激素組地塞米松灌胃（地塞米松片溶于蒸餾水，每日劑量3 mg/kg體質(zhì)量，給藥體積10 mL/kg），中藥組益氣活血通絡(luò)方灌胃（每日劑量12 g/kg，給藥體積10 mL/kg），空白組和模型予等量組0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.6 標(biāo)本處理 連續(xù)給藥28 d后，禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛麻醉后解剖分離肺組織，冰生理鹽水沖洗，濾紙濾干后稱質(zhì)量。然后右肺置于4%多聚甲醛固定后制備4 μm石蠟切片供病理學(xué)檢查。

1.7 指標(biāo)檢測(cè) 1）肺組織Masson染色。切片行常規(guī)Masson染色后，光鏡下觀察肺組織病理變化。2）肺系數(shù)。按公式“肺系數(shù)=肺濕重/體質(zhì)量”計(jì)算肺系數(shù)。3）組織HYP含量測(cè)定。參照J(rèn)amall氏法［5］，測(cè)定肺組織中HYP的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本HYP質(zhì)量分?jǐn)?shù)，用肺組織濕重校正，HYP質(zhì)量分?jǐn)?shù)以μg/mg表示。4）Western blot法檢測(cè)各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2及Smad7蛋白表達(dá)水平，取各組大鼠相同部位肺組織，用組織裂解液提取大鼠肺組織中的總蛋白，BCA法測(cè)定其濃度，調(diào)整上樣量，與緩沖液混勻備用。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，一抗和二抗孵育，ECL顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描并計(jì)算其灰度值，根據(jù)目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參βactin的灰度值，得出目的蛋白相對(duì)含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。各組計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s）表示，采用單因素方差分析法考查顯著性，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織病理改變 見(jiàn)圖1。Masson染色結(jié)果顯示，空白組肺間質(zhì)可見(jiàn)少許正常藍(lán)染膠原纖維沉積；模型組可見(jiàn)大量藍(lán)染膠原纖維沉積于肺泡腔，肺泡結(jié)構(gòu)改變；激素組的膠原纖維多見(jiàn)于肺血管壁與支氣管壁肌層下，肺泡間隔較模型組顯著減少；中藥組肺組織藍(lán)染膠原纖維表較模型組、激素組顯著減少。

圖1 各組大鼠肺組織膠原沉積（Masson染色，100倍）

2.2 肺系數(shù)及肺組織中HYP的測(cè)定 見(jiàn)表1。與空白組比較，模型組肺系數(shù)、HYP顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，激素組肺系數(shù)、Hyp下降（P＜0.05），中藥組肺系數(shù)、Hyp顯著下降（P＜0.01）。

表1 各組大鼠肺系數(shù)和Hyp比較（±s）

表1 各組大鼠肺系數(shù)和Hyp比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 肺系數(shù)（mg/g） HYP（μg/mg）空白組 15 5.82±0.43 0.66±0.06模型組 11 11.26±1.52**1.82±0.45**激素組 13 8.12±0.94△1.47±0.33△中藥組 14 6.95±0.61△△0.91±0.18△△

2.3 TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白水平的比較 見(jiàn)表2、圖2。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠的肺組織中TGF-β1及Smad2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），Smad7蛋白表達(dá)水平則明顯降低（P＜0.01）；與模型組大鼠比較，激素組、中藥藥能顯著下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01），激素組能夠下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中Smad2蛋白的表達(dá)水平 （P＜0.05）、上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05），中藥組能夠顯著下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中Smad2蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01）、上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01）。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別 n TGF-β1Smad2 Smad7空白組 15 0.23±0.02模型組 11 1.16±0.03**激素組 13 0.47±0.02△△0.11±0.01 0.35±0.08 0.19±0.01**0.12±0.06**0.14±0.01△0.16±0.07△中藥組 14 0.15±0.01△△0.06±0.01△△0.24±0.04△△

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

PF是一組進(jìn)行性、不可逆性的致命性異質(zhì)性肺疾病的統(tǒng)稱，其病理特點(diǎn)為彌漫性的肺泡炎、肺實(shí)質(zhì)炎癥和同質(zhì)纖維化［6］。FB發(fā)病機(jī)制主要是大量細(xì)胞外基質(zhì)成分（如膠原蛋白、彈性蛋白等）過(guò)度沉積，使原來(lái)正常有序的生理結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞，引起肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生。而HYP是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一，約占其氨基酸總量的13%，因此，HYP含有量是衡量肺間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［1］。在PF發(fā)生進(jìn)程中，TGF-β1/Smads信號(hào)通路通過(guò)肺成纖維細(xì)胞（FB）等細(xì)胞的作用、對(duì)多種炎癥因子生成的調(diào)控以及促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子活化等機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)纖維化發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用已引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，阻斷TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或抑制TGF-β1表達(dá)有可能防止PF的形成。TGF-β1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、改變結(jié)構(gòu)性細(xì)胞 （支氣管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等）的功能［7］，亦可促進(jìn)FB過(guò)度增殖、分化，繼而促進(jìn)包括膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在組織內(nèi)過(guò)度聚集，導(dǎo)致PF的發(fā)生與發(fā)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，激活的TGF-β1在小鼠肺間質(zhì)中過(guò)度表達(dá)，大量膠原沉積，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、纖維結(jié)合素、彈力蛋白聚集，最終導(dǎo)致間質(zhì)及胸膜纖維化［8］。TGF-β1結(jié)合受體，可致Smad2和Smad3蛋白磷酸化，從而結(jié)合Smad4蛋白形成三聚體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［9］。Smad7是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的抑制性調(diào)控蛋白，競(jìng)爭(zhēng)TGF-β1受體以阻止Smad2等蛋白磷酸化，從而終止TGF-β1的信號(hào)傳導(dǎo)，影響FB的形成與發(fā)展［10］。

肺移植是目前療效最為確切的治療PF方法，但因配型難度大，費(fèi)用高等原因無(wú)法推廣應(yīng)用，各國(guó)臨床治療仍以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，這些藥物抑制免疫反應(yīng)，減輕肺泡炎癥，延緩PF的進(jìn)程。但長(zhǎng)期大劑量服用副作用較大，且禁忌證較多，甚至對(duì)部分群體毫無(wú)作用［11］。PF屬于中醫(yī)理論中“肺痿”“肺痹”等范疇。本病多由外邪入侵，留滯損肺，致脾肺氣虛、肺腎陰虛、痰濁瘀血阻絡(luò)。結(jié)合吳以齡教授提出的 “氣絡(luò)-NEI”理論，即氣絡(luò)與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)存在統(tǒng)一性，多種神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子是氣絡(luò)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，氣絡(luò)失和導(dǎo)致PF與TGF-β1/Smads信號(hào)通路激活所致的PF高度相似［12］。我院以氣絡(luò)失和為其中醫(yī)病機(jī)，采用益氣活血，化痰通絡(luò)之法，創(chuàng)立益氣活血通絡(luò)方治療。方中黃芪益氣補(bǔ)肺為君，實(shí)驗(yàn)證明高劑量黃芪甲苷能明顯抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)，延緩PF進(jìn)程［13］。太子參補(bǔ)肺氣，固肌表，麥冬養(yǎng)陰潤(rùn)肺、五味子益氣斂肺為臣，《本草綱目》載“五味子，入補(bǔ)藥熟用，入嗽藥生用。五味子酸咸入肝而補(bǔ)腎，辛苦入心而補(bǔ)肺，甘入中宮益脾胃”。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)五味子素具有興奮小鼠呼吸作用，減少小鼠氣管腺中中性粘多糖和酸性粘多糖，并增強(qiáng)支氣管上皮細(xì)胞功能，麥冬煎劑能顯著增加肺纖維化模型大鼠肺組織中SOD的活性［14-15］。丹參活血化瘀、地龍活血通絡(luò)、水蛭破血逐瘀、川貝潤(rùn)肺化痰、靈芝止咳益肺為佐藥，實(shí)驗(yàn)表明丹參酮ⅡA通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路，緩解FB纖維化進(jìn)程，從而起到防治PF作用［16］。甘草平肺止咳，調(diào)和諸藥為使藥。全方補(bǔ)肺斂肺，益氣養(yǎng)陰，活血化痰，使得氣旺血行，肺泡組織得以恢復(fù)及重建。

造模后除空白組外，均出現(xiàn)不同程度的精神倦怠，消瘦食少；Masson染色結(jié)果顯示模型組可見(jiàn)大量藍(lán)染膠原纖維沉積于肺泡腔，肺泡結(jié)構(gòu)改變，激素組的膠原纖維多見(jiàn)于肺血管壁與支氣管壁肌層下，肺泡間隔較模型組顯著減少，中藥組肺組織藍(lán)染膠原纖維表較模型組、激素組顯著減少；與模型組比較，中藥組治療后肺系數(shù)、Hyp顯著下降，而且中藥組能顯著下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中TGF-β1、Smad2蛋白的表達(dá)水平上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)水平。

綜上所述，益氣活血通絡(luò)方可以通過(guò)TGF-β1/ Smads信號(hào)通路抑制博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化過(guò)程，為用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段詮釋中藥方劑的治療機(jī)制提供新的思路，值得臨床應(yīng)用及進(jìn)一步探討。

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The Mechanism of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on TGF-β1/Smads Signaling Pathway in Rats withPulmonary Fibrosis by Bleomycin

ZHOU Wei，TU Yan.Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430000，China.

Objective：To investigate the mechanism of Yiqi Huoxue Tongluo decoction on pulmonary fibrosis rats induced by bleomycin.Methods：60 rats were randomly divided into the blank group，the model group，hormone group and TCM group.Except the blank group，the other three groups were established into the pulmonary fibrosis model induced by injecting with 5 mg/kg bleomycin.After modeling，the hormone group and TCM group were given corresponding drugs by gavage；the blank group and the model group were treated with 0.9%Nacl solution orally，once a day.28 days later，the rats were killed and Masson staining was used to observe the pathological changes of lung tissue，weigh lung weight and calculate the lung coefficient and determination of hydroxyproline in lung tissue by Jamall and to detect the expression level of TGF-β1，Smad2 and Smad7 in rats with pulmonary fibrosis by Western blot.Results：Compared with the model group，the lung coefficient and HYP decreased in the hormone group（P＜0.05）.Lung coefficient and HYP decreased significantly in TCM group（P＜0.01）.Compared with the blank group，the expression of TGF-β1 and Smad2 in the lung tissue of the model group increased（P＜0.01）and the expression of Smad7 protein decreased（P＜0.01）.Compared with the model group，the hormone group and TCM group could significantly reduce the expression of TGF-β1 protein（P＜0.01）；the hormone group could decrease the expression of Smad2 protein（P＜0.05），and increased the expression of Smad7 protein（P＜0.05）.TCM group could significantly reduce the expression of Smad2 protein（P＜0.01），and TCM group could significantly up-regulated expression of Smad7 protein（P＜0.01）.Conclusion：Yiqi Huoxue Tongluo decoction can obviously reverse pulmonary fibrosis induced by bleomycin in rats.

Yiqi Huoxue Tongluo decoction；Pulmonary fibrosis；Bleomycin；TGF-β1/Smads signaling pathway

R285.5

A

1004-745X（2017）02-0208-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.007

2016-10-15）

湖北省衛(wèi)生廳項(xiàng)目（WJ2015MB079）

△通信作者（電子郵箱：37849209@qq.com）