基于ApoE-/-小鼠TLR4、MCP-1、ICAM-1表達(dá)探討首參顆粒干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng)機(jī)制*

申定珠邢三麗 陳 川吳蓓玲 遲惠英 陳久林

（上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海 200031）

·研究報(bào)告·

基于ApoE-/-小鼠TLR4、MCP-1、ICAM-1表達(dá)探討首參顆粒干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng)機(jī)制*

申定珠△邢三麗 陳 川△吳蓓玲 遲惠英 陳久林

（上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海 200031）

目的 觀察首參顆粒對(duì)ApoE-/-小鼠Toll樣受體4（TLR4）、單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的影響。方法 采用高脂飲食喂飼ApoE-/-小鼠復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化（AS）模型，并給予首參顆粒、阿托伐他汀干預(yù)15周，采用Western blotting法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)，ELISA法檢測(cè)血清MCP-1、ICAM-1表達(dá)，結(jié)合血脂及組織病理學(xué)檢測(cè)。結(jié)果 與正常組比較，高脂飲食喂飼ApoE-/-小鼠可致明顯的AS病變，TLR4、MCP-1、ICAM-1表達(dá)上調(diào)及TC、LDL-C含量升高；經(jīng)首參顆粒干預(yù)，AS斑塊面積顯著減小，TLR4、MCP-1、ICAM-1表達(dá)下調(diào)，TC、LDL-C含量降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 首參顆?？赏ㄟ^下調(diào)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)與血清MCP-1、ICAM-1水平進(jìn)而有效干預(yù)治療AS。

動(dòng)脈粥樣硬化 TLR4 MCP-1 ICAM-1 首參顆粒

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）主要發(fā)生于中老年人，與增齡、衰老進(jìn)程密切相關(guān)［1］。隨著人口老齡化的加劇，AS導(dǎo)致的心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［2］。我們前期研究提示，補(bǔ)腎中藥復(fù)方首參顆?？捎行Ц深A(yù)治療AS［3-5］。國內(nèi)外研究表明，Toll樣受體（TLRs）尤其是Toll樣受體4（TLR4）與AS關(guān)系緊密，在AS進(jìn)程中起重要作用［6］。本研究以ApoE-/-小鼠模型為研究對(duì)象，應(yīng)用Western blotting法分析小鼠主動(dòng)脈Toll樣受體4（TLR4）的蛋白表達(dá)，ELISA法檢測(cè)小鼠血清單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達(dá)，結(jié)合主動(dòng)脈組織病理學(xué)觀測(cè)及血脂檢測(cè)，以期進(jìn)一步揭示首參顆粒干預(yù)治療AS的作用機(jī)制，為從補(bǔ)腎治療AS相關(guān)疾病提供更加客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性12周齡ApoE-/-小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（20±5）g，購自上海南方模式生物研究中心，許可證號(hào)為SCXK（滬）2009-0023；同品系、同周齡雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量（20±5）g，SPF級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXX（京）2012-0001。于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房單籠喂飼、造模及觀察。

1.2 藥物與試劑 首參顆粒由制首烏15 g，枸杞子15 g，生山楂10 g，參三七3 g組成，為顆粒劑型（6.2 g/袋，江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；阿托伐他汀片（10 mg/片，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)）。主要試劑：小鼠抗TLR4單克隆抗體購自Acris公司；小鼠抗GAPDH購自上?？党缮锕こ坦?；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒 （MCP-1、ICAM-1）為Abcam公司產(chǎn)品。總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 造模與分組 12周齡雄性ApoE-/-小鼠36只，予普通小鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：ApoE-/-小鼠＋高脂飲食模型對(duì)照組 （模型組，n=12）、ApoE-/-小鼠＋高脂飲食＋中藥組（中藥組，n=12）、ApoE-/-小鼠＋高脂飲食＋西藥組（西藥組，n=12）；同周齡、同品系C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組 （正常組，n=12）。高脂飲食配方為21%脂肪+0.5%膽固醇+小鼠常規(guī)基礎(chǔ)飼料。中藥組、西藥組分別予首參顆粒、阿托伐他汀灌胃（60 kg成人體質(zhì)量的等效劑量），正常組灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液，每日1次，用藥至15周末。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) HE染色觀測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織病理形態(tài)。于10%甲醛固定的主動(dòng)脈，切取距主動(dòng)脈根部0.5 cm處的主動(dòng)脈弓，常規(guī)脫水，石蠟包埋，從主動(dòng)脈根部起始連續(xù)切片（5 μm），行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理形態(tài)。血脂檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C，按照試劑盒說明書操作。ELISA法檢測(cè)小鼠血清MCP-1、ICAM-1表達(dá)。小鼠摘眼球取血，靜置4～6 h，3000 r/min離心30 min，小心吸取上層血清。按ELISA試劑盒方法操作，即刻測(cè)量標(biāo)本OD450值，根據(jù)說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查找對(duì)應(yīng)的濃度范圍。Western blotting法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)。主動(dòng)脈總蛋白提取，BCA法蛋白定量→12.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離→PVDF轉(zhuǎn)膜→牛血清白蛋白封閉→加入一抗工作液 （TLR4 1∶1000）→4℃孵育過夜→洗膜→加入辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記二抗→化學(xué)發(fā)光法顯影，拍照分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠主動(dòng)脈組織病理形態(tài)學(xué)觀察 見圖1。結(jié)果顯示，高脂飲食喂飼ApoE-/-小鼠15周后，主動(dòng)脈根部觀察到大面積AS斑塊；較之模型組，中藥組、西藥組AS斑塊面積顯著減?。≒＜0.05）；中藥組、西藥組AS斑塊面積組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈HE染色結(jié)果

2.2 各組小鼠血脂檢測(cè)結(jié)果 見表1。結(jié)果顯示，高脂飲食喂飼ApoE-/-小鼠15周后，血清TC、LDL-C含量明顯升高（P＜0.01）；較之模型組，中藥組、西藥組TC、LDL-C含量明顯降低（P＜0.05）；中藥組、西藥組TC、LDL-C組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組血脂檢測(cè)結(jié)果比較（mmol/L，±s）

表1 兩組血脂檢測(cè)結(jié)果比較（mmol/L，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

?

2.3 ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清MCP-1、ICAM-1表達(dá) 見表2和圖2。結(jié)果顯示，高脂飲食喂飼ApoE-/-小鼠15周后，血清MCP-1、ICAM-1表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；較之模型組，中藥組、西藥組MCP-1、ICAM-1表達(dá)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），中藥組、西藥組MCP-1、ICAM-1組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá) 見圖3。結(jié)果顯示，高脂飲食喂飼ApoE-/-小鼠15周后，主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)增高；較之模型組，中藥組、西藥組小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)降低。

表2 兩組ELISA法檢測(cè)MCP-1、ICAM-1表達(dá)比較（ng/mL，±s）

表2 兩組ELISA法檢測(cè)MCP-1、ICAM-1表達(dá)比較（ng/mL，±s）

組別 n MCP-1 ICAM-1正常組 6模型組 6中藥組 6 18.95±6.23 7.53±1.62 40.06±7.25△△16.35±3.49△△26.69±7.02*10.32±2.91*西藥組 624.37±10.56**11.66±2.65*

圖2 ELISA法檢測(cè)MCP-1、ICAM-1表達(dá)柱狀圖

圖3 Western blotting法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)

3 討 論

ApoE基因敲除小鼠是應(yīng)用胚胎干細(xì)胞基因敲除技術(shù)培育而成［7］。因其具有自然發(fā)生、漸進(jìn)發(fā)展、病理形態(tài)典型的特點(diǎn)，發(fā)病過程最接近自然狀態(tài)下人體AS發(fā)病情況，被公認(rèn)是目前研究AS病理過程及藥物干預(yù)的理想模型。即使在普通飲食喂養(yǎng)條件下該模型仍可自發(fā)形成高膽固醇血癥和AS［8］，但由于其周期較長(zhǎng)往往不便于實(shí)驗(yàn)，而高脂飲食會(huì)加速小鼠AS形成。因此，本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂飼雄性ApoE-/-小鼠15周的方式建立AS動(dòng)物模型，主動(dòng)脈病理提示形成典型的AS斑塊，血脂檢測(cè)提示血清TC、LDL-C含量明顯升高。

AS是心、腦血管事件發(fā)生的共同病理基礎(chǔ)，伴有免疫反應(yīng)的炎癥過程貫穿于AS始終［9］。TLRs作為介導(dǎo)天然免疫與炎癥反應(yīng)的主要模式識(shí)別受體，在AS中所發(fā)揮的作用愈發(fā)受到重視［10］。目前已知人類TLRs家族成員12名，其中以TLR4與AS關(guān)系最為緊密。TLR4表達(dá)于AS血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、外膜成纖維細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞，尤其在血管內(nèi)皮細(xì)胞與AS斑塊中高表達(dá)［11］。既往研究表明，ApoE-/-小鼠TLR4通路相關(guān)基因表達(dá)及AS的發(fā)生率、發(fā)生程度明顯高于同品系C57BL/6J小鼠［12］。TLR4活化在免疫、炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色，它可通過MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，啟動(dòng)AS血管平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞、斑塊中MCP-1、ICAM-1等多種炎性因子的轉(zhuǎn)錄和合成［13］；TLR4活化還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的分化［14］，阻斷巨噬細(xì)胞和動(dòng)脈組織中肝X受體途徑而抑制巨噬細(xì)胞中膽固醇的外流，促進(jìn)AS斑塊發(fā)生［15］。筆者采用Western blotting法檢測(cè)了小鼠主動(dòng)脈TLR4的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高脂飲食可誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLR4的蛋白表達(dá)。

MCP-1又稱“前炎性因子”，由單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌，并對(duì)單核巨噬細(xì)胞有趨化、激活作用，可使各種炎性細(xì)胞特別是單核細(xì)胞向病變部位聚集，并對(duì)炎癥因子的刺激做出應(yīng)答。同時(shí)，它還能活化白細(xì)胞并介導(dǎo)其產(chǎn)生炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)斑塊處內(nèi)皮細(xì)胞移行、平滑肌細(xì)胞分裂、增生及血栓斑塊形成［16］。ICAM-1為免疫球蛋白超家族一員，是黏附分子家族的重要成員，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及白細(xì)胞。ICAM-1在活性內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)是循環(huán)白細(xì)胞聚集浸潤(rùn)引起一定部位組織損傷和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵，抑制ICAM-1的表達(dá)可減少AS形成過程中炎癥細(xì)胞的聚集及其炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，延緩AS的進(jìn)程［17］。筆者采用ELISA法檢測(cè)了血清MCP-1、ICAM-1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高脂飲食可誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠血清MCP-1、ICAM-1的表達(dá)顯著升高。

基于AS本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)特點(diǎn)，課題組自上世紀(jì)80年代以來，將AS與衰老及衰老相關(guān)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展有機(jī)聯(lián)系，通過對(duì)補(bǔ)腎中藥治療AS的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎中藥復(fù)方在明顯改善衰老癥狀、功能的同時(shí)還具有顯著的抗AS作用［18］。為此，我們從補(bǔ)腎立論，創(chuàng)立了補(bǔ)腎中藥復(fù)方首參顆粒，該方由制首烏、枸杞子、生山楂、參三七組成，諸藥合用，共奏補(bǔ)腎益精、活血通絡(luò)之功。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，首參顆粒對(duì)AS模型大鼠整體狀況、主動(dòng)脈組織學(xué)均有顯著的干預(yù)治療作用，可降低血脂對(duì)內(nèi)皮的損傷、減少炎癥因子攻擊、抗氧化應(yīng)激損傷，延緩血管老化，從而抑制AS的發(fā)生和發(fā)展［19］。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步臨床試驗(yàn)提示首參顆?？山档皖i動(dòng)脈粥樣硬化（CAS）患者TC、LDL-C含量，降低白細(xì)胞介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）表達(dá)［3-4］，降低臂踝脈搏波傳導(dǎo)速度（baPWV）及頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（CIMT），增強(qiáng)頸動(dòng)脈血管彈性［5］。

本文研究結(jié)果表明，高脂飲食可成功誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈AS形成及高脂血癥。首參顆?？擅黠@減輕高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS病變，降低TC、LDL-C含量，下調(diào)TLR4、MCP-1、ICAM-1表達(dá)。由此提示，首參顆?？捎行б种芓LR4的蛋白表達(dá)，降低炎癥因子MCP-1、ICAM-1表達(dá)，降低血脂含量，調(diào)控免疫及炎癥反應(yīng)，減少內(nèi)皮損傷和泡沫細(xì)胞形成，這可能是其抗AS的關(guān)鍵作用機(jī)制之一。后續(xù)研究重點(diǎn)會(huì)關(guān)注首參顆粒對(duì)TLR4相關(guān)通路的深入研究，以進(jìn)一步明確其作用靶點(diǎn)。

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Int ervention Effect Mechanism of Shoushen Granule on Atherosclerosis Based on the Expression ofTLR4，MCP-1 and ICAM-1 in ApoE-/-mice

SHEN Dingzhu，XING Sanli，CHEN Chuan，et al.Shanghai Geriatric Institute of Chinese Medicine，Shanghai 200031，China.

Objective：To investigate the effect of Shoushen Granule on the Toll like receptor 4（TLR4），serum monocyte chemokine-1（MCP-1）and intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）of ApoE-/-mice.Methods：Animal model of atherosclerosis was made with ApoE-/-mice fed with high fat diet，and intervented with Shoushen Granule and atorvastatin for 15 weeks respectively.Expression of TLR4 protein in mice aorta was detected with Western blotting method，and expression of serum MCP-1and ICAM-1 was detected with ELISA method in combination with serum lipid and tissue pathology.Results：Compared with the normal group，high fat diet fed ApoE-/-mice could induce significant AS lesions and the expression of TLR4，MCP-1，ICAM-1，TC and LDL-C increased significantly.After intervention of Shoushen Granule，AS patch area decreased significantly，and the expression of TLR4，MCP-1，ICAM-1，LDL-C and TC decreased evidently（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Shoushen Granule can down regulate the expression of TLR4 protein，in mice aorta and serum MCP-1 and ICAM-1，and then can effectively intervene the treatment of AS.

Atherosclerosis；TLR4；MCP-1；ICAM-1；Shoushen Granule

R285.5

A

1004-745X（2017）02-0192-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.002

2016-11-03）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202731，81373706）；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（16ZR1433900）；上海市衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目（201640217）

△通信作者（電子郵箱：13818279131@163.com，ch9453@126.com）