可見分光光度法在布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)結(jié)果判定中的應(yīng)用

韓永剛，蔣宏偉，趙光明

（1. 漢臺(tái)區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，陜西漢中 723000；

2. 陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西西安 710016）

可見分光光度法在布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)結(jié)果判定中的應(yīng)用

韓永剛1，蔣宏偉1，趙光明2

（1. 漢臺(tái)區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，陜西漢中 723000；

2. 陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西西安 710016）

[目的]研究可見分光光度法在布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)結(jié)果判定中應(yīng)用。[方法]對布魯氏菌病虎紅平板試驗(yàn)中篩選出的4份樣品（樣品1、2為陽性，樣品3、4為可疑），嚴(yán)格按《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/ T 18646—2002）中的試管凝集試驗(yàn)操作規(guī)程，對這4個(gè)奶牛樣品的試管凝集試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行人工判定和450 /630 nm分光光譜分析判讀。[結(jié)果]人工判定樣品1:100的結(jié)果為樣品1、2、4可疑或陽性，樣品3強(qiáng)陽性，分光光度法判讀為樣品1、2、4陽性，樣品3強(qiáng)陽性。[結(jié)論]標(biāo)準(zhǔn)比濁管靜置45 min后，各可見光譜數(shù)據(jù)均具有良好的線性關(guān)系；與人工判定結(jié)果相比，可見分光光度法判定的結(jié)果更直接、客觀，受主客觀影響因素更少。建議在標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18646—2002的試管凝集試驗(yàn)操作規(guī)程中，增加可見分光光度法的判讀標(biāo)準(zhǔn)。

可見光分光光度法；布魯氏菌??；試管凝集試驗(yàn)；結(jié)果判定

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布?。卜Q波狀熱，是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染-變態(tài)反應(yīng)性疾病，屬自然疫源性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為輕重不一的發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛等。布魯氏菌屬是一組微小的球桿菌，革蘭氏染色陰性，可侵犯人和多種動(dòng)物。該病不僅影響地區(qū)貿(mào)易及經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，更重要的是還可引發(fā)公共衛(wèi)生事件，威脅人類健康，因此我國將其列為二類動(dòng)物疫病。在國際上，布魯氏菌被列為二類生物恐怖戰(zhàn)劑。長期以來，布病的檢測診斷多采用細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)方法，目前隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展也出現(xiàn)了分子生物學(xué)方法。血清學(xué)方法雖然會(huì)出現(xiàn)一定的假陽性和假陰性，但其操作簡便、試劑穩(wěn)定性好、易保存、生物風(fēng)險(xiǎn)小，并且有統(tǒng)一的國際判定標(biāo)準(zhǔn)，因而被醫(yī)療機(jī)構(gòu)和獸醫(yī)部門廣泛采用，是目前國內(nèi)布病專業(yè)防治機(jī)構(gòu)最常用的檢測方法[1]。試管凝集試驗(yàn)（SAT）是一種穩(wěn)定的、特異性和敏感性較高的檢測方法，一直被各國用于人和動(dòng)物布病的常規(guī)血清學(xué)診斷，我國將其列為動(dòng)物布病診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。

范偉興等[2]研究認(rèn)為：SAT敏感性高、特異性低，iELISA有高的敏感性，cELISA有高的特異性并能區(qū)分自然感染和免疫感染；對未經(jīng)疫苗免疫而發(fā)生布病感染的牛群，用RBT、SAT、iELISA和eELISA檢測其血清樣品，結(jié)果顯示這4種試驗(yàn)的陰、陽性檢出率基本一致（均在85%以上），但RBT和SAT有較高的假陽性（15%以上）和假陰性（10%以上），iELISA和cELISA的特異性和敏感性均顯著高于SAT、RBT；在用RBT和SAT進(jìn)行檢疫時(shí)，要用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的CFT或cELISA進(jìn)行確診。

分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，進(jìn)行定性和定量分析的方法。用紫外光源測定無色物質(zhì)的方法，稱為紫外分光光度法；用可見光光源測定有色物質(zhì)的方法，稱為可見分光光度法。它們與比色法一樣，都以Beer-Lambert定律為基礎(chǔ)[3]。分光光度法具有應(yīng)用廣泛、靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、適用濃度范圍廣、分析成本低、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)。目前被廣泛應(yīng)用于化工、冶金、地質(zhì)、醫(yī)學(xué)、食品、制藥等行業(yè)及環(huán)境監(jiān)測。分光光度測定方法主要包括對照品比較法和吸收系數(shù)法。

標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18646—2002列出了對動(dòng)物布病凝集反應(yīng)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，但均為試驗(yàn)人員以肉眼進(jìn)行判定，這樣易受操作人員技術(shù)經(jīng)驗(yàn)、視力（辨色力）、環(huán)境條件、心理等主客觀因素影響，從而對結(jié)果的判定出現(xiàn)偏差或異議。為提高布病試管凝集試驗(yàn)結(jié)果判讀的客觀性、準(zhǔn)確性和判讀速度，降低結(jié)果的假陽性率和假陰性率，結(jié)合可見分光光度法的特點(diǎn)，進(jìn)行了可見分光光度法判讀布病試管凝集試驗(yàn)結(jié)果的初步研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Model680酶標(biāo)儀（濾光片450 nm、490 nm、630 nm）；移液器（大龍1 000～5 000 μL、大龍100～1 000 μL、艾本德20～200 μL ）；電熱恒溫培養(yǎng)箱；布病凝集試管；空白酶標(biāo)反應(yīng)板（可拆卸）。

1.2 材料

1.2.1 試劑。布病試管凝集試驗(yàn)抗原，批號20150703；布病試管凝集試驗(yàn)陽性血清，批號20150702；布病試管凝集試驗(yàn)陰性血清，批號20150903。上述試劑均為青島易邦公司產(chǎn)品。

1.2.2 被檢奶牛血清。共4份，均為日常布病監(jiān)測篩選出的奶畜血清：樣品1（虎紅平板試驗(yàn)陽性）、樣品2（虎紅平板試驗(yàn)陽性）、樣品3（虎紅平板試驗(yàn)可疑）、樣品4（虎紅平板試驗(yàn)可疑）。

1.2.3 稀釋液。0.5%石炭酸生理鹽水（稱取0.5 g石炭酸，加入100 mL生理鹽水中，121℃高壓滅菌30 min）。

1.2.4 抗原、陽性血清和陰性血清。由制標(biāo)單位提供，按說明書使用。

2 方法

嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2002）中的試管凝集試驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1 血清的采集和保存

按常規(guī)方法采血，分離血清。運(yùn)送和保存血清樣品時(shí)，防止凍結(jié)或受熱，以免影響凝集價(jià)。若3 d內(nèi)不能送到實(shí)驗(yàn)室，按每9 mL血清加1 mL 5%石炭酸生理鹽水（緩緩加入）的標(biāo)準(zhǔn)防腐，也可用冷藏方法運(yùn)送血清。

2.2 血清的稀釋

每份血清用4支凝集試管。第1管，標(biāo)記檢驗(yàn)編碼后，加1.20 mL稀釋液；第2～4管，各加入0.5 mL稀釋液。然后用20～200 μL移液器吸取被檢血清0.05 mL，加入第1管內(nèi)，混合均勻?；旌戏椒ㄊ菍⒃撛嚬苤械幕旌弦何宋軆?nèi)，再沿試管壁吹入試管中，如此重復(fù)3～4次。充分混勻后，用該移液器吸混合液0.25 mL棄去，再用100～1 000 μL移液器取0.5 mL混合液加入第2管。用該移液器如前述方法混合，再吸第2管混合液0.5 mL至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5 mL。稀釋完畢后，第1～4管的血清稀釋度分別為1:25、1:50、1:100和1:200。將0.5 mL 20倍稀釋的抗原，加入已稀釋好的各血清管中，振搖均勻，被檢血清稀釋度則依次變?yōu)?:50、1:100、1:200和1:400。置37～40 ℃ 溫箱24 h，取出檢查并記錄結(jié)果。大規(guī)模檢疫時(shí)也可只用2個(gè)稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝?dòng)?:50和1:100。每次試驗(yàn)均設(shè)陽性血清、陰性血清和抗原對照。陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原方法與受檢血清相同；陽性血清對照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與受檢血清相同；抗原對照：1:20稀釋抗原液0.5 mL，再加0.5 mL稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。

2.3 結(jié)果的判定

嚴(yán)格參照國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2002）中的試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行準(zhǔn)確判定并登記。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)結(jié)果

在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)中，樣品1、2、3、4的虎紅平板試驗(yàn)結(jié)果分別為陽性、陽性、可疑、可疑，陽性血清結(jié)果為強(qiáng)陽性；樣品1、2、3、4的試管凝集試驗(yàn)（1:100、1:50）綜合判定結(jié)果分別為陽性、可疑或陽性、強(qiáng)陽性、陽性或可疑，陽性血清結(jié)果為強(qiáng)陽性。以上試驗(yàn)所有陰性血清試驗(yàn)結(jié)果均為陰性（表1）。

表1 布病國家標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.2 標(biāo)準(zhǔn)比濁管可見分光光度法掃描結(jié)果

根據(jù)分光光度法原理，Model680酶標(biāo)儀（濾光片450 nm、490 nm、630 nm）檢測光譜在400～760 nm可見光范圍內(nèi)。參考酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作技術(shù)，將配置好的比濁管溶液、樣品試管凝集試驗(yàn)管溶液、抗原對照試驗(yàn)管溶液各200 μL，加入已標(biāo)記好的空白酶聯(lián)反應(yīng)板孔內(nèi)，送入Model680酶標(biāo)儀進(jìn)行光譜掃描讀數(shù)，并分別統(tǒng)計(jì)。為研究比濁管光譜掃描數(shù)據(jù)的線性關(guān)系以及與光譜的相關(guān)性，分別采用450/490/630 nm光譜進(jìn)行試驗(yàn)分析。為了簡化試驗(yàn)操作以及研究時(shí)間對光譜掃描數(shù)據(jù)和試驗(yàn)結(jié)果的影響，分別采用450 nm掃描2次（間隔15 min）和630 nm掃描1次的數(shù)據(jù)，進(jìn)行結(jié)果判定研究，數(shù)據(jù)見表2、表3。

表2 標(biāo)準(zhǔn)比濁管可見分光光度法掃描結(jié)果分析

表3 可見光分光光度法布病試管凝集實(shí)驗(yàn)掃描結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.3 標(biāo)準(zhǔn)比濁管光譜線性分析

對標(biāo)準(zhǔn)比濁管配液，以1:20抗原，分別按75%、50%、25%、0濃度進(jìn)行配制?！髦狄?濃度光譜值為基數(shù)，按公式“△值=（被檢光譜值-0濃度光譜值）/75%光譜值”計(jì)算得出，并分析相應(yīng)時(shí)間與溶液濃度的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)比濁管配液靜置45 min后，溶液濃度與可見光光譜450 nm、490 nm、630 nm處掃描值均具有良好的線性相關(guān)，說明可見光分光光度法完全適用于試管凝集試驗(yàn)結(jié)果的比較判定（圖1、圖2）。

圖1 配液后10 min內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)比濁管可見光分光光度分析

圖2 配液45 min后標(biāo)準(zhǔn)比濁管可見光分光光度分析

4 樣品結(jié)果分析

分析比較同等條件下，用可見分光光度法450 nm掃描2次（間隔15 min）及630 nm掃描1次，對試驗(yàn)結(jié)果判定的影響。判定標(biāo)準(zhǔn)為：50%濃度比濁管數(shù)值＜檢測數(shù)值≤75%濃度比濁管數(shù)值，判為“﹢”；25%濃度比濁管數(shù)值＜檢測數(shù)值≤50%濃度比濁管數(shù)值，判為“﹢﹢”；0濃度比濁管數(shù)值＜檢測數(shù)值≤25%濃度比濁管數(shù)值，判為“﹢﹢﹢”。

4.1 樣品1的光譜結(jié)果分析

對1:50和1:100稀釋度可見分光光度法450 nm掃描2次（間隔15 min）（圖3）及630 m掃描1次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖4），按標(biāo)準(zhǔn)均判定為“﹢﹢”，綜合判定1:50為“﹢﹢”，1:100為“﹢﹢”，布病試管凝集試驗(yàn)陽性。

4.2 樣品2的光譜結(jié)果分析

對1:50和1:100稀釋度可見分光光度法450 nm掃描2次（間隔15 min）（圖5）及630 nm掃描1次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖6），按標(biāo)準(zhǔn)判定1:50為“﹢﹢﹢”，1:100為“﹢﹢”，綜合判定1:50為“﹢﹢﹢”，1:100為“﹢﹢”，布病試管凝集試驗(yàn)陽性。

圖3 1:50和1:100稀釋度可見分光光度法450 nm掃描結(jié)果（樣品1）

圖4 1:50和1:100稀釋度可見分光光度法630 nm掃描結(jié)果（樣品1）

圖5 1:50和1:100稀釋度可見分光光度法450 nm掃描結(jié)果（樣品2）

圖6 1:50和1:100稀釋度可見分光光度法630 nm掃描結(jié)果（樣品2）

4.3 樣品3的光譜結(jié)果分析

對1:50和1:100稀釋度可見分光光度法450 nm掃描2次（間隔15 min）（圖7）及630 nm掃描1次試驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖8），按標(biāo)準(zhǔn)判定為“﹢﹢﹢”，綜合判定1:50為“﹢﹢﹢”，1:100為“﹢﹢﹢”，布病試管凝集試驗(yàn)陽性。

圖7 1:50和1:100稀釋度可見分光光度法450 nm掃描結(jié)果（樣品3）

圖8 1:50和1:100稀釋度可見分光光度法630 nm掃描結(jié)果（樣品3）

4.4 樣品4的光譜結(jié)果分析

對1:50和1:100稀釋度可見分光光度法450 nm掃描2次（間隔15 min）（圖9）及630 nm掃描1次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖10），按標(biāo)準(zhǔn)分別判定為“﹢﹢﹢”“﹢﹢”，綜合判定1:50為“﹢﹢﹢”，1:100為“﹢﹢”，布病試管凝集試驗(yàn)陽性。

圖9 1:50和1:100稀釋度可見分光光度法450 nm掃描結(jié)果（樣品4）

圖10 1:50和1:100稀釋度可見分光光度法630 nm掃描結(jié)果（樣品4）

4.5 試管凝集試驗(yàn)人工判讀與可見光光度法判讀結(jié)果對比

對比樣品2、樣品4的1:100稀釋度人工和可見分光光度法判讀結(jié)果，可以看出對部分樣品試驗(yàn)結(jié)果，由于試驗(yàn)人員自身視力條件（視力、辨色力等）或技術(shù)經(jīng)驗(yàn)等影響出現(xiàn)判定差異（表4）。在樣品無法長期保存的情況下，人工判讀對試驗(yàn)結(jié)果無法獲得客觀上的統(tǒng)一，存在分歧。而分光光度法通過光學(xué)掃描數(shù)據(jù)對比，有效消除了對試驗(yàn)結(jié)果判定的分歧，并且試驗(yàn)數(shù)據(jù)可長期保存并隨時(shí)可查閱比對。

表4 布病試管凝集試驗(yàn)人工與光度法判讀結(jié)果統(tǒng)計(jì)對比

5 結(jié)論與建議

通過對標(biāo)準(zhǔn)比濁管分光光度法掃描結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，只有標(biāo)準(zhǔn)比濁管配置完成后靜置45 min以上，標(biāo)準(zhǔn)比濁管可見光分光光度值才能體現(xiàn)較好的線性關(guān)系，此后才能作為試管凝集試驗(yàn)的評判標(biāo)準(zhǔn)。

由布病試管凝集試驗(yàn)結(jié)果可見，與人工判讀結(jié)果相比，可見光分光光度法得出的結(jié)論更加客觀、直接、準(zhǔn)確，不易受試驗(yàn)人員主客觀因素影響和干擾，且可見光譜范圍內(nèi)各光譜得出的檢測結(jié)果相一致，說明試驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果不受時(shí)間影響。

建議對布病試管凝集試驗(yàn)（SAT）結(jié)果可見分光光度法判定方法進(jìn)行深入研究，并在國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病的診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2002）中增加試管凝集試驗(yàn)操作規(guī)程可見分光光度法判讀標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 劉志國，任清華，王妙，等. 布病特異性血清學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用概述[J]. 中國人畜共患病學(xué)報(bào)，2013，29（10）：1026-1031.

[2] 范偉興，鐘旗，何倩倪，等. 幾種布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法的比較研究[J]. 中國動(dòng)物檢疫，2006，23（6）：31-32.

[3] 嚴(yán)拯宇. 分析化學(xué)：紫外-可見分光光度法[M]. 南京：東南大學(xué)出版社，2005.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Application of Visible Spectrophotometry in Result Determination of Tube Agglutination Test for Brucellosis

Han Yonggang1，Jiang Hongwei1，Zhao Guangming2
（1. Hantai District Animal Husbandry and Veterinary Technology Promotion Center，Hanzhong，Shaanxi 723000；2. Shaanxi Animal Disease Prevention and Control Center，Xi'an，Shaanxi 710016）

[Objective] In order to study the application of visible spectrophotometry in determining the results of tube agglutination test for brucellosis. [Methods] 4 samples consisting of 2 positive（sample 1，2）and 2 suspicious（sample 3，4）were selected by rose bengal plate test（RBPT）of brucellosis，then tube agglutination test was conducted towards the samples in strict accordance with the operating procedures from Diagnostic Techniques for Brucellosis of Animal（GB/T 18646—2002）. At last，results were determined by both manual judgment and 450/630 nm spectroscopic analysis. [Results] For manual judgment（dilution ratio of 1:100），sample 1，2 and 4 were suspicious or positive，sample 3 was strongly positive. For spectroscopic analysis，results showed sample 1，2 and 4 were positive and sample 4 was strongly positive. [Conclusion] After 45 minutes' standing of the standard turbidimetric tube，visible spectrum data exhibited a good linear relationship. Hence，compared with manual judgment，results determined by visible spectrophotometry were more visualized and objective，affecting less influence of subjective and objective factors. It was recommended that assessment criteria should be added to the operation procedures according to the national standard of GB/T 18646—2002.

visible spectrophotometry；brucellosis；tube agglutination test；result determination

S851.34

B

1005-944X（2017）03-0082-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.022