辣椒素抑制體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的實驗研究

林苗苗 王文波 康文 高振 武曉莉 唐勝建 劉偉

辣椒素抑制體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的實驗研究

林苗苗 王文波 康文 高振 武曉莉 唐勝建 劉偉

目的探討辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖能力、膠原表達及遷移能力的影響，為辣椒素治療瘢痕疙瘩提供依據(jù)。方法取人瘢痕疙瘩9例，膠原酶消化獲取瘢痕疙瘩成纖維細胞，用含有0.5 μg/L和5 μg/L辣椒素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，常規(guī)DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)檢測周期變化，QPCR檢測膠原和炎癥因子等的表達水平，并以劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。結(jié)果辣椒素能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖，阻滯細胞于G0/G1期，并抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白的表達。此外，辣椒素還能降低瘢痕疙瘩細胞炎性因子白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達。但是，辣椒素對細胞的遷移能力沒有影響。結(jié)論辣椒素能抑制體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖能力，并抑制其膠原和炎性因子等的表達。

瘢痕疙瘩成纖維細胞辣椒素增殖

瘢痕疙瘩（Keloid）是病理性瘢痕，是由于以成纖維細胞為主的細胞過度增殖，并分泌大量的細胞外基質(zhì)而引起的[1]。此外，瘢痕疙瘩病灶內(nèi)存在大量炎癥因子和生長因子的分泌、聚集，如TGF-β1、IL-6、IL-8及TNF-α等[2]，可以進一步促進細胞增殖和細胞外基質(zhì)的合成、沉積，導(dǎo)致組織纖維化和瘢痕疙瘩形成。因此，減少瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，降低炎癥因子的表達，可能是治療瘢痕疙瘩的重要方向。辣椒素藥理作用廣泛，具有抗炎、止癢、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等作用[3-5]，并能抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖和膠原合成[6]，但其對瘢痕疙瘩成纖維細胞的作用尚不明確。本實驗主要就辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、膠原與炎癥因子等的表達以及細胞遷移的影響開展研究，為辣椒素治療瘢痕疙瘩提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集

9例瘢痕疙瘩標(biāo)本來源于上海第九人民醫(yī)院整復(fù)外科瘢痕疙瘩手術(shù)患者，獲患者知情同意?；颊吣挲g21～64歲；其中女性6名，男性3名；前胸部4例，肩部3例，耳垂部2例。具體取材標(biāo)準(zhǔn)：處于增生活躍期、高出皮膚、質(zhì)地較硬、局部充血，并有明顯的毛細血管擴張，伴有明顯瘙癢或疼痛癥狀；瘢痕疙瘩無破損和感染，未接受過任何相關(guān)治療。

1.2 主要試劑及儀器

辣椒素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胎牛血清FBS（ScienCell，美國）；膠原酶NB4（上海史瑞克生物科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)液（HyClone，美國）；青霉素、鏈霉素、兩性霉素B（Gibco，美國）；CCK-8（Dojindo，日本）；胰蛋白酶（Gibco，美國）；二甲亞砜（上海滬試化工有限公司）；Trizol（Ambion，美國）；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，美國）。

酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo，美國）；流式細胞儀（BD，美國）；PCR儀（Biometra，德國）。

1.3 瘢痕疙瘩成纖維細胞的分離和培養(yǎng)

獲取瘢痕疙瘩成纖維細胞[7]，以1×104cells/cm2的密度接種至100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每2天換液一次。待細胞融合至80%時進行傳代。為避免個體差異，將3位患者的細胞混合后作為一個混合細胞樣本，共建立3個細胞樣本。取體外培養(yǎng)的第2代細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 實驗分組

瘢痕疙瘩成纖維細胞分別以含0.5 μg/L和5 μg/L辣椒素培養(yǎng)液進行干預(yù)（實驗組），觀察細胞的增殖、膠原及周期變化；以不含辣椒素的常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)為對照組。各組至少重復(fù)3次。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響

[7]的方法，將瘢痕疙瘩成纖維細胞以0.5×104cells/mL的密度接種到96孔培養(yǎng)板，依照分組進行相應(yīng)干預(yù)，培養(yǎng)1、3、5、7 d。根據(jù)CCK-8試劑盒的操作說明，每孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8試劑，孵育2.5 h，酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm波長處測定其光吸收值。

1.5.2 細胞周期實驗

以上述濃度的細胞懸液接種到100 mm的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)5 d后收集細胞，70%乙醇固定，4℃過夜，PBS洗滌1次，加入20 μL RNase，避光加PI染液，冰浴30 min，染色后過濾。流式細胞儀檢測分析，記錄細胞樣品的G0/G1期、G2/M期、S期細胞百分比。

1.5.3 定量RT-PCR檢測膠原和炎癥因子的表達

上述濃度的細胞懸液接種到100 mm的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)48 h后，Trizol提取細胞RNA，紫外分光計核算純度，A260/A280比值為1.8～2.0。每個標(biāo)本以1.5 μg總RNA為模板，按AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制20 μL反應(yīng)體系：5×Buffer 4 μL，10 mM dNTP 2 μL，200 ng/μL Oligo dT-Adaptor Primer 1 μL，40 U/μL RNase抑制劑0.5 μL，5 U/μL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，反應(yīng)體系加水配平至20 μL。反應(yīng)條件：30℃10 min，42℃60 min，99℃5 min，5℃5 min。

cDNA在qPCR儀中擴增，反應(yīng)體系：ddH2O 7 μL，MIX 10 μL，cDNA 1 μL，前引物1 μL，后引物1 μL。反應(yīng)條件：95℃5 min、95℃30 sec、58℃30 sec、72℃45 sec、72℃10 min為一個循環(huán)，共40個循環(huán)。管家基因GAPDH為內(nèi)參照（表1）。

1.5.4 細胞劃痕實驗

取處于對數(shù)生長期的瘢痕疙瘩成纖維細胞，以1×105cells/mL的密度接種到六孔培養(yǎng)板中，每孔接種3 mL，待細胞長滿，在每孔中央作劃痕，PBS洗滌2次后，倒置顯微鏡下拍照記錄細胞劃痕兩側(cè)的面積。培養(yǎng)48 h后，拍照記錄干預(yù)后細胞劃痕兩側(cè)的面積。根據(jù)公式計算細胞遷移率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，以SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，兩兩比較采用Post-hoc法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響

辣椒素干預(yù)的第5和第7天，實驗組瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖受到抑制，與對照組差異明顯（P＜0.05）；辣椒素濃度越高抑制作用越明顯，兩個實驗組之間也存在顯著差異（P＜0.05）（圖1A）。

2.2 辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞周期的影響

實驗組G0/G1期瘢痕疙瘩成纖維細胞明顯增加，0.5 μg/L組和5 μg/L組分別為（87.78%±1.85%）和（88.15%±0.76%），對照組為（83.66%±1.28%）。兩實驗組與對照組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），兩實驗組間未見明顯差異（P＞0.05）（圖1B）。

2.3 辣椒素抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的膠原相關(guān)mRNA的表達

實驗組瘢痕疙瘩成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原和Fibronectin的表達量均有不同程度的降低。兩實驗組之間，以及與對照組之間，Ⅰ型膠原的表達量均存在顯著差異（P＜0.05）；Ⅲ型膠原和Fibronectin的表達量，實驗組與對照組相比差異顯著（P＜0.05），但兩實驗組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；而α-SMA的表達

量沒有顯著變化，組間無差異（P＞0.05）（圖2）。

2.4 辣椒素抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的炎性因子mRNA的表達

實驗組瘢痕疙瘩成纖維細胞的IL-6、IL-8及TNF-α的表達量均降低，與對照組存在顯著性差異（P＜0.05），兩實驗組間無顯著差異（P＞0.05）；TGF-β1的表達無顯著變化，組間無差異（P＞0.05）（圖3）。

2.5辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移的影響

0.5μg/L和5 μg/L組的細胞遷移率分別為（90.585%±7.279%）和（88.464%±3.714%），兩實驗組之間無明顯差異，與對照組（91.164%±3.704%）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

表1 PCR引物序列Table 1Primers for PCR

圖1 辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和周期的作用Fig.1Effect of capsaicin on proliferation and cell cycle of keloid fibroblasts

圖2 辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原相關(guān)mRNA表達的作用Fig.2Effectofcapsaicinon collagen-associated mRNA expression in keloid fibroblasts

圖3 辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞炎性因子mRNA表達的作用Fig.3Effect of capsaicin on mRNA expressionofinflammatory cytokines in keloid fibroblasts

圖4 辣椒素影響瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移的形態(tài)學(xué)觀察及遷移率半定量分析Fig.4Morphological observation of migration of keloid fibroblasts interfered by capsaicin and semi-quantitative analysis of mobility

3 討論

瘢痕疙瘩，以超過原始皮損邊緣向正常組織擴展和過度膠原沉積為特征，無自愈傾向，被認為是皮膚的“良性腫瘤”[8-9]。成纖維細胞的過度增殖，分泌過多的膠原與細胞外基質(zhì)，是瘢痕疙瘩形成的病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。瘢痕疙瘩病灶內(nèi)大量炎癥因子的異常表達和聚集，也是導(dǎo)致病情持續(xù)發(fā)展的重要原因[2]。因此，抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、膠原等基質(zhì)的合成，以及降低炎癥因子的分泌，是治療瘢痕疙瘩研究的重要策略之一。目前，臨床上主要采用局部注射抗腫瘤藥物和糖皮質(zhì)激素等，但長期使用會產(chǎn)生一定的副作用[10]。

研究表明，辣椒素能抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖和膠原合成[6]。瘢痕疙瘩與增生性瘢痕同屬于病理性瘢痕，發(fā)病機制和治療方案相似，因此辣椒素可能同樣可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖。我們用高低兩種濃度的辣椒素干預(yù)瘢痕疙瘩成纖維細胞的體外培養(yǎng)過程，發(fā)現(xiàn)辣椒素能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖，并使其細胞周期也受到抑制，能阻滯細胞于G0/G1期，表明辣椒素能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖。

實驗中，我們發(fā)現(xiàn)辣椒素可以抑制與纖維化相關(guān)的膠原分子的表達。辣椒素可以抑制多種組織纖維化，包括肝纖維化[11]及增生性瘢痕[6]，提示辣椒素還可能通過抑制纖維化來治療瘢痕疙瘩。

瘢痕疙瘩的發(fā)病過程中，炎癥因子具有重要的促進作用，可以調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成，促進細胞的增殖，并調(diào)節(jié)細胞的凋亡[12]。已有大量文獻表明辣椒素具有抗炎作用。Kim等[13]證實辣椒素可以通過抑制巨噬細胞內(nèi)部IkB-a的降解，從而降低炎癥反應(yīng)。Colpaert等[14]采用皮下注射辣椒素，24 h后觀察到其對接種分枝桿菌丁酸菌引起的大鼠膝關(guān)節(jié)炎癥有明顯的抗炎作用。Zhukova等[15]在健康成年大鼠的皮下注射辣椒素，2周后取出胸腺，對其結(jié)構(gòu)和囊下區(qū)的細胞組成進行相關(guān)檢測，發(fā)現(xiàn)辣椒素能調(diào)節(jié)神經(jīng)肽的水平，參與自身免疫的調(diào)控，從而達到抗炎作用。本實驗證實，辣椒素可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達，提示辣椒素對瘢痕疙瘩的潛在治療作用可能還包括對炎癥因子的調(diào)控。

本實驗結(jié)果顯示，辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞的遷移沒有抑制作用。成纖維細胞的遷移與TGF-β1密切相關(guān)，TGF-β1不僅是促進傷口愈合的關(guān)鍵因素，也是促進細胞遷移的重要生長因子[16]。有研究報道，TGF-β1可以促進各種體外培養(yǎng)的腫瘤細胞的遷移，包括肺癌細胞[17]、乳腺癌細胞[18]及食管癌細胞[19]等，而且對成纖維細胞的遷移也發(fā)揮了重要的作用。Wu等[20]在研究FK506抑制TGF-β1對瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原表達和TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)的增強作用中已經(jīng)證實，TGF-β1能顯著增強瘢痕疙瘩成纖維細胞的遷移。而本實驗結(jié)果顯示，辣椒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞TGF-β1的表達沒有作用，這可能也是辣椒素不影響瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移的原因之一。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示，辣椒素對細胞增殖、細胞外基質(zhì)表達均有抑制作用，同時還可以通過抑制相關(guān)炎性因子的表達，起到抗炎的作用。這些結(jié)果提示，辣椒素可能是潛在的瘢痕疙瘩治療藥物，值得對相關(guān)內(nèi)容進行更為深入地研究。

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Inhibitory Effect of Capsaicin on the Proliferation of Keloid Fibroblasts Cultured in Vitro

ObjectiveTo explore the effect of capsaicin on inhibiting collagen expression,proliferation and migration ability of keloid fibroblasts in vitro and thus to provide scientific basis for clinical application of capsaicin in treatment of keloid.MethodsThe keloid tissues were harvested from 9 patients and digested with 0.3%collagenase to extract keloid fibroblasts.These cells were treated with different concentrations of capsaicin(0.5 μg/L and 5 μg/L)as the experiment group or without capsaicin treatment as the control group.CCK-8 assay was used to evaluate cell proliferation.Flow cytometry was also employed to evaluate cell cycle.Q-PCR assay was used to examine the gene expression levels of collagen and other extracellular matrices.In vitro wound scratch was also used to investigate cell migration ability.ResultsCapsaicin inhibited the proliferation of keloid fibroblasts,resulting in relative blockade of cell cycle in G0/G1 phase.It also inhibited the gene expression of collagensⅠandⅢand fibronectin.In addition,Capsaicin also inhibited the gene expression of IL-6,IL-8 and TNF-α,but had no effect on cell migration.ConclusionCapsaicin could inhibit the proliferation and gene expression of collagen and inflammatory cytokines of cultured fibroblasts in vitro.

Keloid;Fibroblasts;Capsaicin;Proliferation

R619+.6

A

1673－0364（2017）01－0005－05

LIN Miaomiao1,WANG Wenbo2,3,KANG Wen2,GAO Zhen2,WU Xiaoli2,TANG Shengjian1,LIU Wei2,3．
1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College,Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 Shanghai Key laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LIU Wei(E-mail:liuwei_md@126.com).

2016年10月11日；

2016年12月27日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.002

261042山東省濰坊市濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科研究所（林苗苗，唐勝建）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（王文波，康文，高振，武曉莉，劉偉）；上海組織工程研究重點實驗室（王文波，劉偉）。

劉偉（E-mail：liuwei_md@126.com）。