響應(yīng)面法優(yōu)化錦燈籠總黃酮的提取工藝*

閆 平，鄭 蕾，趙 寧，鐘曉瑞

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

錦燈籠是茄科植物酸漿干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用，是常用的清熱解毒藥，外治天皰瘡、濕疹[1]，歷代本草多有記載。有報(bào)道表明，錦燈籠含有黃酮類化合物[2]。在天然植物中，黃酮類化合物安全、無毒[3]，具有良好的的生物活性[4-5]，如抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎等[6-7]，錦燈籠提取物具有良好的抗腫瘤、抑菌活性等[8]。

關(guān)于黃酮類化合物提取、分離及純化方法的研究報(bào)道很多，一般采用溶劑浸提法、微波法、超聲波法、超臨界流體萃取法、酶提法、超濾法等[9-13]。作者在前人的研究基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化錦燈籠總黃酮的提取工藝[14]，為進(jìn)一步開發(fā)錦燈籠藥用資源提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

錦燈籠：購于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，由西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室馮永輝教授鑒定，經(jīng)鑒定為PhysalisalkekengiL.Var.franchetii(Mast.) Makino 的干燥宿萼；蘆丁對照品：批號為MUST-12040302，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、純化水、無水乙醇、甲醇：均為分析純，市售。

紫外-可見分光光度計(jì)：UV-160A，上海精密儀器廠；電子天平：SQP，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；架盤藥物天平：IYT-10，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-2，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：WZ-100，上海申生科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50.00 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加適量甲醇，置水浴上微熱使其溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取10.0 mL，置100 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇至6.0 mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加NaOH試液10.0 mL，再加甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，用紫外分光光度法在500 nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。回歸方程式：Y=11.368X+0.057 5，相關(guān)系數(shù)R=0.999 5，說明標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度在0.008～0.048 mg/mL與吸光度A具有良好的線性關(guān)系。

ρ/(mg·mL-1)圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品曲線

1.2.3 測定樣品中w(總黃酮)

取錦燈籠宿萼干燥粉末10.0 g，精密稱定，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇回流提取，將提取液濃縮為浸膏，低溫50 ℃干燥，取濃縮后的提取物總質(zhì)量的50%，精密稱定，甲醇溶解并定容到100 mL容量瓶中。取錦燈籠提取液1.0 mL，按“1.2.2”項(xiàng)下方法測定吸光度，代入回歸方程中，即可得到錦燈籠中w(總黃酮)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 料液比的選擇

取10.0 g錦燈籠宿萼5份，精密稱量，按照m(錦燈籠宿萼)∶V(乙醇)(g/mL，以下簡稱料液比)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液回流提取1 h，提取2次，按照“1.2”項(xiàng)下方法測定w(總黃酮)并計(jì)算錦燈籠總黃酮的提取率，結(jié)果見圖2。

料液比/(g·mL-1)圖2 料液比對錦燈籠總黃酮提取率的影響

由圖2可見，在φ(乙醇)、提取時(shí)間、提取次數(shù)一定的條件下，料液比1∶10～1∶30時(shí)提取率呈先增后減的趨勢，在1∶20時(shí)達(dá)到最大值，故料液比以1∶20為宜。料液比增大而黃酮含量減小的原因可能是由于其它成分的浸出而影響了總黃酮的提取。

2.1.2 φ(乙醇)的選擇

取10.0 g錦燈籠宿萼5份，精密稱定，按照料液比1∶20，分別用φ(乙醇)=50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液回流提取1 h，提取2次，按照“1.2”項(xiàng)下方法測定w(總黃酮)并計(jì)算錦燈籠總黃酮的提取率，結(jié)果見圖3。

φ((乙醇)/%圖3 φ(乙醇)對錦燈籠總黃酮提取率的影響

由圖3可見，在料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)一定的條件下，隨著φ(乙醇)的增加，總黃酮的提取率先增后減，當(dāng)φ(乙醇)=80%時(shí)，黃酮提取率最大，故最佳φ(乙醇)=80%。

2.1.3 提取時(shí)間的選擇

精密稱取錦燈籠宿萼5份，每份10.0 g，固定料液比1∶20，φ(乙醇)=80%，提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間分別為30、45、60、75、90 min進(jìn)行乙醇回流提取，按照“1.2”項(xiàng)下方法測定w(總黃酮)并計(jì)算提取率，結(jié)果見圖4。

t/min圖4 提取時(shí)間對錦燈籠總黃酮提取率的影響

由圖4可見，在固定料液比、φ(乙醇)及提取次數(shù)的條件下，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮的提取率先增后減，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，黃酮提取率最大，故最佳提取時(shí)間為60 min。

2.1.4 提取次數(shù)的選擇

精密稱取錦燈籠宿萼5份，每份10.0 g，固定料液比1∶20，φ(乙醇)=80%，提取時(shí)間60 min，乙醇回流分別提取1次、2次、3次，按照“1.2”項(xiàng)下方法測定w(總黃酮)并計(jì)算提取率，結(jié)果見圖5。

提取次數(shù)圖5 提取次數(shù)對錦燈籠總黃酮提取率的影響

由圖5可見，在固定料液比、φ(乙醇)及提取時(shí)間的條件下，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮的提取率成上升趨勢，當(dāng)提取2次時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高值，故最佳提取次數(shù)為2次。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 模型建立及顯著性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素的基礎(chǔ)上篩選出最優(yōu)水平，以φ(乙醇)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)四個(gè)因素為自變量，以w(總黃酮)為響應(yīng)值Y，采用四因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面因素和水平取值見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

按照Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)方案進(jìn)行了四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，24個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)對總黃酮的乙醇回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

同時(shí)對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，其結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

1) ***表示差異極顯著(P<0.001)，**表示差異高度顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

在其它因素均為零的水平上，分析對總黃酮提取率的影響，選擇φ(乙醇)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)四個(gè)變量中的任兩個(gè)交互因素進(jìn)行分析，回歸優(yōu)化響應(yīng)面分別見圖6～圖11。

由圖6～圖11可知，此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投寄苓_(dá)到極值點(diǎn)。其中響應(yīng)面圖坡度越陡對黃酮提取率影響越大，坡度越緩對黃酮提取率影響越小，由以上6個(gè)圖綜合可得，四個(gè)因素對黃酮提取率影響的順序由大到小為：料液比、φ(乙醇)、提取次數(shù)、提取時(shí)間。為確定最佳響應(yīng)值的因素水平組合，利用Design-Expert 8.0.6.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，得出優(yōu)化條件為：φ(乙醇)=80.24%，料液比1∶20，提取時(shí)間1.05 h，提取次數(shù)2.06次。考慮實(shí)際操作性，將工藝參數(shù)更改為φ(乙醇)=80%，料液比1∶20，提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)為2次。

圖6 φ(乙醇)與料液比交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

圖7 φ(乙醇)與提取時(shí)間交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

圖8 φ(乙醇)與提取次數(shù)交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

圖9 料液比與提取時(shí)間交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

圖10 料液比與提取次數(shù)交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

圖11 提取時(shí)間與提取次數(shù)交互作用影響錦燈籠總黃酮提取率的響應(yīng)面圖

2.2.3 模型驗(yàn)證

采用修正后優(yōu)化工藝參數(shù)條件按“1.2.3”項(xiàng)下方法，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，平均w(總黃酮)=2.016 mg/g，此條件下w(總黃酮)的理論預(yù)測值為2.109 8 mg/g，兩者相比，相對誤差為2.39%，說明響應(yīng)面優(yōu)化法結(jié)果可靠，穩(wěn)定可行。

3 結(jié) 論

本研究在單因素的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法考察了料液比、φ(乙醇)、提取時(shí)間、提取次數(shù)對錦燈籠總黃酮的影響，建立了錦燈籠總黃酮的多元回歸模型，模型擬合度良好。確定了黃酮的最佳提取工藝：料液比1∶20，φ(乙醇)=80%，提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)為2次，w(黃酮)可達(dá)到2.016 mg/g。單因素影響順序?yàn)椋毫弦罕?φ(乙醇)>提取次數(shù)>提取時(shí)間。黃酮提取的實(shí)際值與預(yù)測值相近，各因素與w(總黃酮)呈顯著的二次拋物關(guān)系，表明各交互因素在響應(yīng)值Y處存在最大值。響應(yīng)面法優(yōu)化錦燈籠總黃酮的提取工藝，方法可行，預(yù)測性好，得到的工藝條件穩(wěn)定，為進(jìn)一步研究錦燈籠提供了可靠的理論依據(jù)。

[1] 郭穎，劉靜，等.錦燈籠的研究進(jìn)展[J].中藥材，2012，35(12)：2039-2043.

[2] 楊異卉，張明宇，等.錦燈籠宿萼中總黃酮的提取、富集及含量測定[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，46(6)：553-555.

[3] 董宇.黃酮類化合物的提取方法研究及展望[J].人參研究，2009(4):33-35.

[4] 國家藥典委員會.中國藥典：Ⅰ部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:333.

[5] TAVARINI S，DEGL＇INNOCENTI E，REMORINI D，et al．Antioxidant capacity，ascoribic acid，total phenols and carotenoids changes during harvest and after storage ofHaywardkiwifruit[J].Food Chemistry，2008，107(1)：282-288．

[6] 王趙改，楊慧．香椿產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2013(7)：8-10．

[7] 王慧．黃酮類化合物生物活性的研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2012，12(9)：347-350．

[8] 王戰(zhàn)勇，蘇婷婷，等.錦燈籠宿萼提取物的提取及其抑菌作用研究[J].食品科技，2009，44(8)：142-145．

[9] 姜紅波．黃酮類物質(zhì)的提取和含量測定方法研究進(jìn)展[J].化工時(shí)刊，2010，24(11)：45-49.

[10] 吳聰華，程華，等．藥用植物黃酮類化合物的提取方法[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(9)：33-38．

[11] 黃麗蕓，鄧鼎森，等．黃酮類化合物常用提取方法研究[J].藥物研究，2014，10(9)：57-58.

[12] 趙子龍，薛培鳳，等．天然藥物中總黃酮的提取工藝研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，34(6)：512-516．

[13] 邸娜，鄭喜清，等．植物天然成分黃酮類化合物的提取方法[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(33)：11888-11889．

[14] 劉艷杰，項(xiàng)榮武.響應(yīng)面法在藥學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24(6)：455-457．

[15] 楊文鴿，謝果凰，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化海鰻的濕腌工藝[J].中國食品科學(xué)報(bào)，2010，101(1)：133-139．