牡丹籽油納米乳凝膠的制備及體外透皮特性研究*

王小寧，曹 斌，張存勞，白佳怡

(1．西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021；2．陜西醫(yī)藥控股集團山海丹藥業(yè)有限責任公司，陜西 西安 710075)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為毛茛科芍藥屬木本植物，是我國特有的木本名貴花卉。牡丹籽油來源于牡丹的種籽，具有很豐富的藥用及食用價值[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，牡丹籽油在200～420 nm有強吸收，恰好能夠有效吸收紫外線中波長為320～420 nm的UVA，因此具有顯著的防曬美白功效[3-4]。據(jù)研究，牡丹籽油中發(fā)揮防曬功效的成分為不飽和脂肪酸亞油酸，其質量分數(shù)可達19.09%～34.9%[5]。然而，牡丹籽油水溶解度低，直接使用易引起皮膚干燥、刺激等問題，因此開發(fā)牡丹籽油的新型經(jīng)皮給藥制劑具有重要意義。納米乳凝膠(nanoemulsion-based gels，NBGs) 是將藥物與納米乳液加入凝膠基質中形成的透明、穩(wěn)定的網(wǎng)狀結構膠體。納米乳能夠顯著改善藥物的刺激性，并具有良好的透皮性和穩(wěn)定性[6-7]，凝膠則能提高乳劑的黏度，增強其黏附性和涂布性，延長藥物滯留時間[8-9]。因此，作者制備了牡丹籽油納米乳凝膠，對其質量進行評價，并考察其體外透皮特性，為進一步研究與開發(fā)牡丹籽油新劑型并促進其在化妝品領域的應用提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牡丹籽油：壓榨提取，由陜西興森源生物科技有限公司提供；卡波姆-980、聚氧乙烯氫化蓖麻油、PEG400：藥用級，甲醇、乙腈：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；吐溫-80、異丙醇、三乙醇胺：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；亞油酸對照品：批號B21241，純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司。

萬分之一電子分析天平：ALC-210.4，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；實驗室高剪切均質乳化機：ESR-500，上海易勒機電設備有限公司；超聲波清洗器：KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司；低速大容量離心機：TD5M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；馬爾文激光粒度儀：ZEN3600，英國馬爾文儀器有限公司；藥物透皮擴散試驗儀：RYJ-6B，上海黃海藥檢儀器有限公司；高效液相色譜儀：Agilent Tech-1260，安捷倫科技有限公司；數(shù)顯黏度計：SNB，上海方瑞儀器有限公司；差示掃描量熱儀：DSC1，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 牡丹籽油納米乳的處方篩選

以粒徑及多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)為指標，按表1處方，取牡丹籽油、乳化劑、助乳化劑混勻，加入50 mL蒸餾水(純化水)，經(jīng)高剪切均質乳化機乳化3 min，制得牡丹籽油納米乳。

表1 牡丹籽油納米乳處方

1.3 凝膠基質的處方篩選

稱取卡波姆-980適量，加適量甘油潤濕后，加蒸餾水至100 g，攪拌均勻，靜置24 h使其充分溶脹，用體積分數(shù)為20%三乙醇胺溶液調節(jié)pH至一定值，3 000 r/min離心10 min即得凝膠基質[10]。以凝膠基質的外觀性狀、成型性、黏稠度、涂布性為評價指標，考察卡波姆-980的用量(0.3、0.5、0.8、1.0、1.5 g)、甘油用量(5、8、10、12、15 g)、pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對凝膠基質的影響，篩選最優(yōu)凝膠基質處方。其中，外觀包括凝膠的澄清透明度、有無光澤、有無沉淀等，涂展性分為快速鋪展、慢速鋪展與難以鋪展[11]。

1.4 牡丹籽油納米乳凝膠的制備

按“1.2”方法制備牡丹油納米乳，按“1.3”方法制備凝膠基質，將牡丹油納米乳緩慢加入到已經(jīng)溶脹好的卡波姆-980凝膠基質中，攪拌均勻，加蒸餾水至50 g，3 000 r/min離心10 min除氣泡，得牡丹油納米乳凝膠[12]。

1.5 牡丹籽油納米乳凝膠的質量評價

觀察納米乳凝膠的外觀形態(tài)，采用黏度計測定凝膠黏度，采用馬爾文激光粒度儀測定粒徑及Zeta電位，采用高速離心法考察其物理穩(wěn)定性，通過涂布實驗考察其皮膚涂布性。

1.6 牡丹籽油的含量測定方法學考察

色譜條件：Diamond C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-φ(磷酸)=0.1%溶液(體積比為90∶10)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為203 nm，進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃[13]。

方法學考察：精密稱取亞油酸對照品7 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成0.7 mg/mL的溶液，再量取1 mL至另一容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，制得母液適量。分別量取母液0、2、4、6和8 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶，得質量濃度分別為0.014、0.028、0.042、0.056和0.070 mg/mL的對照品溶液。按色譜條件依次進樣。以峰面積(A)為縱坐標，質量濃度(ρ)為橫坐標，進行線性回歸。同時，進行精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收率考察。

1.7 體外透皮特性研究

離體皮膚的制備：斷頸法處死小白鼠，剝離小鼠皮膚后，取小鼠腹部皮膚，剪去多余皮毛，除去其皮下組織，仔細用棉簽擦去皮下脂肪，直到皮膚白皙為止，以少量生理鹽水濕潤后，4 ℃冰箱保存，24 h內使用。

體外透皮實驗：采用Franz擴散池進行體外透皮實驗[14]。用手術剪將已處理好的小鼠皮剪成適量大小，固定于供給室和接受池之間(注意使皮膚表層面向供給室，皮膚內側面向接受室)，分別量取牡丹籽油、牡丹籽油納米乳，牡丹籽油納米乳凝膠適量作為待測樣，保證其中含有的牡丹籽油質量均為0.06g，在37 ℃、600 r/min的條件下進行實驗，分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取2 mL接收液(同時補充同溫等量生理鹽水)，按照“1.6”的色譜條件測其藥物濃度，并計算累積滲透量(Q，mg/cm2)，計算公式見式(1)。

(1)

式中，ρn為不同時間點時接收液質量濃度，mg/mL；ρi為不同時間點時取樣液質量濃度，mg/mL；V為接受池體積，mL；Vi為取樣體積，mL；A為擴散面積，cm2。

差示掃描量熱(DSC)掃描：12 h后，將空白及凝膠組實驗后皮膚置于流水下沖洗 60 s，取樣，用差示掃描量熱儀進行差式掃描分析。DSC條件：40 μL 鋁坩堝，溫度在-20～200 ℃，升溫速率為20 ℃/min。

2 結果與討論

2.1 牡丹籽油納米乳的處方篩選

按表1中三個處方所制得納米乳的粒徑分別為161.7、274.4、779.7nm，PDI分別為0.180、0.973、1.000。經(jīng)比較，處方一所制得的納米乳粒徑較小且分布均勻，因此選定處方一作為納米乳處方。

2.2 凝膠基質的處方篩選

卡波姆-980用量的篩選結果見表2。

表2 卡波姆-980 用量的篩選結果

由表2可見，當卡波姆-980用量為1.5 g時，涂布性較差，難以鋪展，而在0.8 g時，形成的凝膠基質透明、均勻細膩、黏稠度適中、易涂布，且成型性較好，因此，選擇卡波姆-980 用量為0.8 g。

甘油用量的篩選結果見表3。

表3 甘油用量的篩選結果

由表3可見，隨著甘油用量的增大，凝膠黏度隨之增大，黏稠度、油膩感也顯著增強，外觀結團現(xiàn)象明顯，導致凝膠基質難以涂展，在甘油用量為15 g時，基質結團現(xiàn)象明顯，黏度大，難以涂展，而在用量為10 g時，黏稠度適中，均勻細膩，易涂展，因此，選擇甘油用量為10 g。

pH值的篩選結果見表4。

表4 pH值的篩選結果

由表4可見，當pH=4.0～5.0時，黏度低、流動性強，皮膚黏附性差；當pH=6.0時，黏稠度適中，皮膚黏附性好；當pH=7.0～8.0時，有明顯的結團現(xiàn)象，較為黏稠，影響皮膚涂展性。因此，選擇調節(jié) pH=6.0。

綜上，確定牡丹籽油納米乳凝膠的處方為牡丹籽油0.3 g、聚氧乙烯氫化蓖麻油0.6 g、PEG400 0.1 g，卡波姆-980 0.8 g，甘油10 g，最終調節(jié)pH值至6.0。

2.3 牡丹籽油納米乳凝膠的質量評價

2.3.1 制劑的外觀、黏度

本實驗所得樣品外觀為無沉淀、具有一定黏稠度的乳白色凝膠，膏體細膩均勻，黏稠度適中，經(jīng)測定，黏度為37 010 Pa·s。

2.3.2 粒徑及電位

粒徑與Zeta電位結果分別見圖1、圖2。

粒徑/nm圖1 牡丹籽油納米乳凝膠的粒徑分布圖

由圖1、圖2可知，牡丹籽油納米乳的平均粒徑約為160.0 nm，PDI為0.173，Zeta電位為-20.1 mV，說明納米乳粒徑分布均勻，物理穩(wěn)定性強。

2.3.3 物理穩(wěn)定性實驗

分別取牡丹油納米乳、納米乳凝膠各三份，分別放置24 h、48 h、72 h后，3 000 r/min離心10 min，觀察納米乳及納米乳凝膠是否出現(xiàn)分層、沉淀或渾濁。結果表明，納米乳及納米乳凝膠在離心期間未發(fā)生分層和沉淀現(xiàn)象，具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.4 涂布性實驗

取所制得牡丹籽油及牡丹籽油納米乳凝膠適量，分別涂布于雙硅紙(具有類似于皮膚的疏水性)上進行觀察[15]。結果表明，涂布牡丹籽油之后，油滴很快出現(xiàn)聚集，不易涂布均勻，而牡丹籽油納米乳凝膠涂布后，無油滴聚集現(xiàn)象，說明將牡丹籽油納米乳凝膠劑涂布性好，減少了刺激性和油膩感。

2.4 含量測定方法學考察

按1.6的色譜條件進樣，得到對照品溶液、樣品溶液、不含亞油酸的陰性溶液的色譜圖見圖3。

t/mina 亞油酸標準品

t/minb 樣品溶液

t/minc 陰性溶液圖3 各溶液色譜圖

由圖3可知，指標成分亞油酸的亞油酸標準品的保留時間為5.79 min(圖3a)，樣品溶液在5.65 min處出現(xiàn)了亞油酸的色譜峰(圖3b)，不含亞油酸的陰性溶液在相應位置無色譜峰的出現(xiàn)(圖3c)，表明輔料對亞油酸的測定無干擾，本方法專屬性好。

按標準曲線繪制方法，得標準曲線方程為A=4 439.3ρ+5.25，R=0.999 7，表明在質量濃度為0.01～0.07 mg/mL線性關系良好。經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復性考察，計算得RSD值分別為0.53%、0.49%、1.22%，加樣回收率在90%～110%，表明精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率均良好。

2.5 體外透皮特性考察

按照1.7的實驗方法進行體外透皮特性考察，計算各組的皮膚累積滲透量，結果見圖4。

t/h圖4 體外透皮實驗結果

由圖4可知，三個實驗組中，亞油酸的累積滲透量均隨著時間的增加而增加，12 h時累積滲透量由高到低依次為納米乳凝膠>納米乳>牡丹籽油，并且納米乳凝膠與牡丹籽油相比，累積滲透量具有顯著性差異(p<0.05)，而納米乳與牡丹籽油相比不具有顯著性差異(p>0.05)，說明納米乳凝膠具有更好的透皮性能，12 h時亞油酸的累積滲透量為0.05 mg/cm2。

將空白及凝膠組實驗后皮膚置于流水下沖洗 60 s，取樣，用差示掃描量熱儀進行差式掃描分析，結果見圖5。

t/℃圖5 DSC曲線

由圖5可知，空白皮膚的熔融峰出現(xiàn)在約140 ℃，而涂抹有納米乳凝膠的皮膚與空白皮膚相比，吸收熱量速率更快，在126 ℃處出現(xiàn)熔融峰，說明凝膠乳對皮膚的結構有影響，這可能與皮膚角質層的致密結構被打開有關，證實了納米乳凝膠增強牡丹籽油透皮吸收的性能。

3 結 論

(1) 用聚氧乙烯氫化蓖麻油作為乳化劑，經(jīng)高速剪切乳勻法制備牡丹籽油納米乳，制得的納米乳細微、均勻，以卡波姆作凝膠基質，制得的凝膠細膩、均勻，穩(wěn)定性好，質地清爽，易于涂抹；

(2) 用Franz擴散池進行透皮吸收實驗，能夠較好地模擬透皮制劑的藥物釋放過程。由透皮結果可以看出，牡丹籽油納米乳凝膠透皮速率顯著大于牡丹籽油及其納米乳，說明凝膠基質的加入可能影響了皮膚的結構，使角質層細胞間隙增大，增強了牡丹籽油的透皮吸收。

[1] 李凱，周寧，李赫宇.牡丹花、牡丹籽成分與功能研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2012，33(3):228-230.

[2] 朱獻標，翟文婷，董秀勛，等.牡丹籽油化學成分及功能研究進展[J].中國油脂，2014，39(1):88-91.

[3] 高婷婷，王亞蕓，任建武.GC-MS法分析牡丹籽油的成分及其防曬效果的評定[J].食品科技，2013，38(6):296-299.

[4] 程安瑋，孫金月，王維婷，等.牡丹籽油的研究進展[J].食品科學技術學報，2016，34(3):79-84.

[5] 周暢.牡丹籽油作為化妝品基礎油的開發(fā)研究[D].上海：上海交通大學，2015.

[6] 李艷萍，張志榮.納米乳的研究進展及其應用[J].華西藥學雜志，2010，25(4):485-488.

[7] 蔡霞，呂竹芬.納米乳在透皮給藥系統(tǒng)中的應用概況[J].廣東藥學院學報，2009，25(4):429-432.

[8] 謝明華，葛敏，高建青.微乳凝膠經(jīng)皮給藥制劑的研究與應用進展[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2015，32(6):764-768.

[9] 祝雨薇，蔣曙光，周建平.伊曲康唑溫敏微乳凝膠的研制[J].中國新藥雜志，2013，22(16)：1942-1947.

[10] 盧秀霞，潘婷婷，洪于琦，等.茶樹油微乳凝膠的制備及其質量評價[J].中草藥，2015，46(13):1892-1900.

[11] 劉繼勇，韓盈，楊明，等.丹皮酚微乳凝膠劑的制備及體外透皮特性研究[J].中國中藥雜志，2009，34(21):2730-2733.

[12] 王利勝，張升，劉麗萍，等.青藤堿微乳凝膠的制備及體外透皮特性研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22(1):21-24.

[13] 楊會芳，李德坤，周大錚，等.HPLC法測定紅參提取物中的α-亞麻酸、亞油酸[J].藥物評價研究，2016，24(2):110-112.

[14] 白發(fā)麗，曹芬，蔡林.丹皮酚脂質體凝膠的制備及其透皮作用[J].華南國防醫(yī)學雜志，2015，29(2):89-92.

[15] 趙寧，程玉釧，李偉澤，等.以白芨多糖為骨架材料的沙棘油凝膠乳的制備及性質研究[J].中國油脂，2016，41(6):79-82.