歐文氏弧菌毒力蛋白PirAB的原核表達與純化

張萌萌 ， 潘迎捷,2， 王永杰,2*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306;2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海 201306)

對蝦急性肝胰腺壞死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND)，又稱早期死亡綜合征(EMS)，于2009年首次在中國海南爆發(fā)[1]。隨后，越南、馬來西亞和泰國相繼爆發(fā)了該疾病，之后又蔓延到菲律賓和墨西哥沿海地區(qū)[2-4]。2016年南美部分國家和地區(qū)爆發(fā)了AHPND[5-8]。報道稱該疾病能迅速導(dǎo)致養(yǎng)殖塘中70%的對蝦幼蝦死亡，造成對蝦養(yǎng)殖行業(yè)減產(chǎn)約23%[5]。研究發(fā)現(xiàn)AHPND的主要致病菌為一種副溶血弧菌，主要感染斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦以及中國對蝦的幼蝦。進一步研究表明，該致病性副溶血性弧菌(Vibroparahaemolyticus)攜帶的特殊大質(zhì)粒上的pirAB基因能夠引發(fā)AHPND[9]，而普通的V.parahaemolyticus不能引起該疾病。Lee等[9]將pirAB基因敲除后發(fā)現(xiàn)其毒力急劇下降且并未引起AHPND癥狀[10]。研究證實毒力基因pirAB為AHPND的關(guān)鍵致病因子。本課題組從上海地區(qū)凡納濱對蝦中分離出并通過活體實驗證明為1株AHPND致病弧菌，并鑒定為Vibrioowensii[11-14]。為了進一步探索該菌株的致病性與毒力蛋白的相關(guān)性，本研究通過PCR擴增獲得該歐文氏弧菌的毒力基因pirA和pirB，分別克隆并連接到合適的原核表達載體上，經(jīng)大腸埃希菌原核表達和親和層析純化獲得大量PirAV.o和PirBV.o毒力蛋白，并對其進行冷凍干燥保存，為進一步蛋白功能研究和抗體合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 AHPND致病性VbrioowensiiSH-14、表達質(zhì)粒pET-21和pGEX-4t-1本實驗室保存；克隆菌株EscherichiacoliTop10、表達菌株EscherichiacoliBL21感受態(tài)細胞購自天根生化(北京)科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑及儀器 DNA分子標尺、上樣緩沖液、2×TaqPCR MasterMix、細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根生化(北京)科技有限公司；超濾管、Whatman硝酸纖維膜、密理博0.22、0.45 μm濾膜、濾器購自上海麥約爾生物公司；非預(yù)染蛋白質(zhì)分子標尺、兔源GST一抗、堿性磷酸酶標記的抗兔二抗、鼠源His一抗和堿性磷酸酶標記的抗鼠二抗購自上海英基生物科技有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子標尺、限制性內(nèi)切酶BamH I、Sal I和Xhol I、T4連接酶購自Takara公司。過硫酸銨、TEMED、甘油、Tween-20、30%聚丙烯酰胺、苯甲基磺酰(PMSF)、BCIP/NBT顯色液、氯化鈉、氯化鉀、十二烷基硫酸鈉、脫脂奶粉購自生工生物工程(上海)股份有限公司；咪唑、還原性谷胱甘肽、甲醇、冰乙酸、甘氨酸購自上海國藥集團；考馬斯亮藍R-250購自賽默飛公司。親和層析柱GSTrap FF 5 mL和His Trap 5 mL柱子、蛋白電泳槽(SE250)、濕轉(zhuǎn)儀(EPS2A201)、AKTA pure 蛋白純化儀均購自美國通用電器公司(GE)；恒溫培養(yǎng)箱(H-200B,上海世平)；小型高速冷凍離心機、高速冷凍離心機、PCR儀、移液槍均購自德國艾本德公司(Eppendorf)；81-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 取-80 ℃甘油保存的VbrioowensiiSH-14菌種在TSA(1.5% NaCl)培養(yǎng)基上涂布過夜培養(yǎng)。挑取陽性菌落，接種到TSB(1.5% NaCl)液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，6 000 g離心菌體待用。

1.2.2 基因克隆 首先將VbrioowennciiSH-14 菌體沉淀重懸并用基因組提取試劑盒獲取其DNA。根據(jù)已發(fā)表質(zhì)粒pVHvo序列設(shè)計擴增毒力基因pirAV.o和pirBV.o全長序列的引物(表2)并進行聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)。擴增pirAV.o的引物為PirAV.o-F/PirAV.o-R，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后進行終延伸72 ℃ 10 min。擴增pirBV.o的引物為PirBV.o-F/PirBV.o-R，PCR反應(yīng)程序與擴增pirAV.o相同。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，目的片段pirAV.o和pirBV.o分別于16 ℃過夜連接到T克隆載體上，并將連接后載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Top10，涂板通過藍白斑篩選和PCR驗證，獲取陽性克隆。挑取陽性克隆液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進行測序，經(jīng)序列比對后確定為pirAV.o和pirBV.o。

1.2.3 表達質(zhì)粒構(gòu)建 對于PirAV.o，針對對應(yīng)序列設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶位點的引物PirAV.o-1F-Ndel I:和PirAV.o-333R-Xhol I，經(jīng)PCR反應(yīng)獲取兩端攜帶酶切位點的基因片段。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物純化回收后，再用Ndel I 和Xhol I 限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，獲得與pET-21b相同黏性末端的片段，然后兩者于16 ℃過夜連接，得到連接成功的表達質(zhì)粒pET-21b-PirAV.o。PirBV.o質(zhì)粒的構(gòu)建除了引物為PirBV.o-1F-BamHI和PirBV.o-1317R-XholI外，其余步驟與PirAV.o質(zhì)粒相同，得到連接成功的表達質(zhì)粒pGEX-4T-PirBV.o。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達菌株大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，LB固體培養(yǎng)基平板上37 ℃涂布培養(yǎng)16 h，根據(jù)菌落PCR篩選確定陽性菌落。挑取陽性菌落置于LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后，部分重組表達菌株用已滅菌的80%甘油于-80 ℃冰箱中保存待用。其余培養(yǎng)菌液進行重組質(zhì)粒的提取，并再次對所構(gòu)建重組質(zhì)粒的插入片段進行測序和序列比對分析，確保構(gòu)建過程中序列無點突變，準確無誤。采用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測毒力蛋白PirAV.o和PirBV.o的理論分子量大小，作為表達驗證的參考依據(jù)。

1.2.4 融合蛋白表達與電泳分析 取出-80 ℃保藏的含有重組質(zhì)粒的BL21表達菌株，按照1∶100的比例接種至LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3～4 h后，測定OD600值至0.5～0.7之間，加入0.1 mol/L IPTG，22 ℃、200 r/min，誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。4 ℃條件下8 000 r/min高速離心10 min，并收集表達菌體待用。將收集到的菌體重懸于含5%甘油的PBS(pH 7.3)，加入蛋白酶抑制劑PMSF，置于-20 ℃冰箱中冷凍1.5 h后取出，室溫融化，加入溶菌酶于37 ℃、200 r/min的搖床中孵育30 min。取出后進行超聲破碎細胞。冰上超聲，超4 s停6 s，100次。4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，收集上清，去除沉淀，將上清置于4 ℃儲存待用。配置10% SDS-PAGE電泳凝膠對表達蛋白量和蛋白大小進行分析。然后分別通過His標簽融合蛋白和GST標簽融合蛋白特異性抗體免疫印跡法定性驗證蛋白His-tag-PirAV.o和GST-tag-PirBV.o融合蛋白表達。

表1 10% SDS-PAGE凝膠組分

注：“-”代表此項不適用

1.2.5 融合蛋白純化 大量獲取表達蛋白細胞破碎上清，經(jīng)親和層析柱特異性優(yōu)勢結(jié)合標簽蛋白，獲取目的蛋白。所有緩沖溶液均需0.45 μm濾膜過濾，并超聲30 min進行脫氣處理，避免對層析柱和純化儀器泵體造成損害。對于His-tag-PirAV.o蛋白純化：清洗AKTA-start純化系統(tǒng)，裝上Histrap層析柱，用20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液平衡柱子將細胞破碎上清樣品泵入純化系統(tǒng)中。選取20～500 mmol/L咪唑梯度洗脫，收集洗脫產(chǎn)物。對于GST-tag-PirBV.o融合蛋白純化：清洗純化系統(tǒng)，裝上GSTtrap層析柱后用PBS緩沖溶液平衡，將樣品泵入，選取還原性谷胱甘肽洗脫，收集洗脫蛋白，利用SDS-PAGE電泳驗證純化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達菌株的構(gòu)建

表2列出擴增pirAV.o和pirBV.o引物，pirAV.o目的片段長度為333 bp,pirBV.o目的片段長度為1 317 bp。圖1(a、d)所示，pirAV.o和pirBV.o在PCR擴增片段，在瓊脂糖凝膠上分別獲得對應(yīng)大小的單一條帶?？蛰d質(zhì)粒提取后同樣用1%瓊脂凝膠確定質(zhì)粒大小，pET-21b(b)和pGEX-4T-1(e)空載全長分別為5 369 bp和4 969 bp,如圖1(b)所示。將雙酶切后的目的片段和質(zhì)粒載體用連接試劑盒連接后，獲取重組質(zhì)粒pET-21b-PirAV.o和pGEX-4T-1-PirBV.o,如圖1(c、f)所示，條帶大小與預(yù)測一致,經(jīng)測序結(jié)果分析，重組質(zhì)粒上成功插入的pirAV.o和pirBV.o序列沒有發(fā)生突變。

圖1 重組表達質(zhì)粒pET-21b-PirAV.o和pGEX-4T-1-PirBV.o的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombination expression plasmid of pET-21b-PirAV.o and pGEX-4T-1-PirBV.o

引物名稱引物序列PirAV.o-F5′-ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT GAA AC-3′PirAV.o-R5′-ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT GAA AC-3′PirBV.o-F5′-ATG ACT AAC GAA TAC GTT GTA AC-3′PirBV.o-R5′-ATG ACT AAC GAA TAC GTT GTA AC-3′PirAV.o-1F-Ndel I5′-GCG CAT ATG AGT AAC AAT ATA AAA CATG-3′PirAV.o-333R-Xhol I5′-GCG CTC GAG GTG GTA ATA GAT TGT ACAG-3′PirBV.o-1F-Bam HI5′-ACG GCG AGG GAT CC A TGA CTA ACG AAT ACG TTG TAAC-3′PirBV.o-1317R-Xho I5′-ACG GCG AGC TCG AG C TAC TTT TCT GTA CCA AAT TCA TCG-3′

注：下劃線表示未酶切位點

2.2 蛋白在大腸埃希菌中表達分析和免疫印跡法驗證

SDS-PAGE電泳分析細菌裂解液(圖2)證實，蛋白PirAV.o和PirBV.o在大腸埃希菌BL21(DE3)細胞中成功表達。圖2(a、c)顯示，IPTG處理6 h后誘導(dǎo)組表達蛋白量比未誘導(dǎo)組要高很多；細菌裂解液的上清液和沉淀物蛋白中都能觀察到具有預(yù)期分子量大小的蛋白條帶。目的條帶粗細表明，50%左右蛋白為可溶性表達，說明22 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下可以成功表達目的蛋白。

通過His標簽融合蛋白和GST標簽融合蛋白特異性抗體免疫印跡法，PirAV.o免疫印跡結(jié)果顯示(圖2b)，未誘導(dǎo)組在17 kDa附近沒有條帶而誘導(dǎo)組存在明顯條帶，并且與預(yù)測蛋白大小一致。說明該條帶即為PirAV.o融合蛋白。PirBV.o免疫印跡結(jié)果顯示(圖2d)，誘導(dǎo)組在70 kDa附近顯色，與預(yù)測蛋白大小一致，說明該條帶對應(yīng)蛋白為PirBV.o融合蛋白。所以免疫印跡法進一步確定了這兩種標簽蛋白在22 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下均成功表達。

圖2 PirAV.o和PirBV.o融合蛋白誘導(dǎo)表達SDS-PAGE和免疫印跡分析Fig.2 SDS-PAGE and Western Blot for PirAV.oand PirBV.o fusion protein expression(a)和(c)中,M：蛋白分子標尺；1：總菌體裂解液(未誘導(dǎo))；2：總菌體裂解液(1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 6 h、22 ℃)；3：IPTG誘導(dǎo)的大腸埃希菌的上清液；4：IPTG 誘導(dǎo)的大腸埃希菌的沉淀物。(b)和(d)中，M：蛋白分子標尺；1：未誘導(dǎo)的大腸埃希菌裂解液；2：誘導(dǎo)的大腸埃希菌裂解液(22 ℃，0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)6 h)(a)and (c)：M：protein Marker;1: total cell lysis (non-induced); 2:total cell lysis (1 mmol/L IPTG induced, 6 h, 22 ℃); 3: supernatants of IPTG induced cell lysis; 4: precipitates of IPTG induced cell lysis. (b)and (d): M：protein Marker;1: total cell lysis (non-induced); 2: total cell lysis (1 mmol/L IPTG induced for 6 hours at 22 ℃)

2.3 融合蛋白純化

對平衡緩沖液優(yōu)化后選用20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液能夠在樣品掛柱過程中，有效地減少雜蛋白結(jié)合,并選取20～500 mmol/L咪唑梯度洗脫，對比純化前后的SDS-PAGE可以看出(圖3a)，蛋白純化效果佳。在純化PirBV.o蛋白時，選取其PBS(pH 7.3)緩沖溶液平衡柱子，30 mmol/L還原性谷胱甘肽洗脫，得到高質(zhì)量的洗脫峰，對比純化前后的SDS-PAGE可以看出(圖3b)，純度已滿足多克隆抗體制備的要求。

圖3 PirAV.o和PirBV.o蛋白過柱純化后電泳分析Fig.3 Purification of PirAV.o and PirBV.o fusion proteinM：蛋白分子標尺；1：純化前樣品蛋白；2：純化后收集的蛋白M: protein Marker; 1: proteins before purification; 2: fusion proteins after purification

3 討 論

AHPND自爆發(fā)以來已導(dǎo)致對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量驟減，目前對其致病機理的研究還不夠深入，尚未找到有效的防控措施。在工作中，我們試圖從致病因子的角度進一步認識AHPND。AHPND主要致病因子為毒力蛋白PirAB，大量獲取該蛋白的方式主要有兩種：硫酸銨沉淀法[10]和異源表達。硫酸銨沉淀法從致病菌沉淀蛋白，但是由于在菌體中表達量少，雜蛋白多，后期純化復(fù)雜等因素，此方法不利于進行后期的攻毒實驗。相比之下，借助原核表達系統(tǒng)，可以目標明確地獲得大量的融合蛋白，再通過親和層析純化，可有效降低雜蛋白含量，集中洗脫高濃度蛋白。

本研究成功構(gòu)建了pirAB的原核表達體系。在摸索誘導(dǎo)大腸埃希菌表達融合蛋白的最佳條件時，優(yōu)化了不同IPTG誘導(dǎo)濃度(0.1、0.5、1.0 mmol/L)和不同溫度(16、22、30 ℃)等因素對蛋白誘導(dǎo)表達量的影響。通過SDS-PAGE凝膠分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度IPTG對蛋白表達量影響不大，高溫條件使大量蛋白以包涵體形式存在于沉淀中。為了便于后期純化，使超聲后的蛋白以分泌形式存在于細胞破碎液，在表達后期選用在22 ℃、0.1 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)，在上清中獲得了大量可溶性表達蛋白。

蛋白純化過程中，不同緩沖溶液有很大差異。本研究通過嘗試不同的緩沖溶液來優(yōu)化純化體系。研究中還發(fā)現(xiàn)存放于4 ℃冰箱的純化蛋白一周后出現(xiàn)降解。蛋白的降解，會對后期的研究工作造成很大的影響，使前期的工作功虧一簣。為避免蛋白在4 ℃降解，首先嘗試在超聲破碎時添加絲氨酸酶抑制劑(PMSF)。但是由于PMSF有效時間短，仍無法避免蛋白在存放過程中的降解，所以在后期的嘗試中采用先濃縮再真空冷凍干燥相結(jié)合的方法有效避免了蛋白降解的問題，保存了大量冷凍干燥的蛋白樣品，為下一步的多克隆抗體制備提供充足的合格的抗原，也為后期凡納濱對蝦活體蛋白攻毒實驗做準備。