水稻稻瘟病菌單孢分離技術及常見問題分析

楊軍++薛芳++王海鳳++郭濤++金桂秀++王佳+陳峰++張士永

摘要：水稻稻瘟病是由稻瘟菌（Magnaporthe girsea）引起的一種真菌性病害，可對水稻生產造成巨大損失。稻瘟菌的頻繁變異易導致抗病品種抗性喪失，抗病育種家需每年對稻瘟菌變化情況進行監(jiān)測。如何快速有效獲得純化菌株是監(jiān)測稻瘟菌變化的前提。結合多年實踐經驗，本文詳細介紹了稻瘟菌單孢分離技術以及分離過程中遇到的一些常見問題。這些研究結果可以指導育種家快速有效地獲得純化稻瘟菌。

關鍵詞：稻瘟菌；單孢分離；常見問題分析

中圖分類號：S435.111.4+1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）02-0132-04

由稻瘟菌（Magnaporthe grisea）引起的水稻稻瘟病是水稻的首要病害[1]。該病在水稻各個生長時期均可發(fā)生[2]，其中穗頸瘟危害最為嚴重，直接影響水稻的產量和質量。由于稻瘟病菌生理小種容易發(fā)生變異，在抗病水稻品種對稻瘟病菌的選擇壓力下，會導致田間稻瘟病菌群的毒力基因組成發(fā)生變化，產生新的致病小種，從而使抗病品種在種植幾年后喪失抗病性[3，4]。這對于抗病育種而言是個很大的挑戰(zhàn)。育種家在關注水稻品種（系）其他性狀的同時，亦要對每年的稻瘟菌生理小種動態(tài)變化進行監(jiān)測分析[5，6]，避免育成的水稻品種（系）短時間內喪失抗瘟性。因此，如何快速有效獲得純化菌株是育種家抗病育種首先要面對的一個重要問題。

單孢分離是分離純化稻瘟菌的常用方法，具體就是每次只取稻瘟菌的一個分生孢子，讓它萌發(fā)成菌絲體來獲得純菌株。目前常見的單孢分離方法主要有挑針法、毛細管打孔法、眉毛挑針法等[7]，但各有利弊。雖然國內對稻瘟菌研究很多，但是對稻瘟菌單孢分離技術的詳細報道較少。本研究主要介紹利用自制簡易挑針進行稻瘟菌單孢分離的技術以及分離過程中遇到的一些問題，以期幫助育種家快速有效地獲得純化稻瘟菌。

1材料與方法

1.1分離材料

病樣采自山東臨沂、濱州等地發(fā)生穗頸瘟的稻田。

1.2培養(yǎng)基配制

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂30 g，蒸餾水1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）：去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，取濾液，加入蔗糖20 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

番茄燕麥培養(yǎng)基（TOA）：燕麥片30 g，加水煮沸約20 min，用紗布濾出燕麥汁。番茄榨汁后用紗布過濾，取汁液150 mL倒入燕麥汁液中，加入瓊脂粉20 g，定容至1 000 mL，調節(jié)pH值在7.0左右，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.3病樣處理

在超凈工作臺內將病樣切成1 cm左右小段，放在無菌水中浸泡10 min，期間用鑷子刮擦病樣表面，初步去除表面污物，之后在75%乙醇中浸泡60 s，無菌水沖洗60 s，移入有效氯含量4%的次氯酸鈉溶液中浸泡60 s， 然后無菌水沖洗3次，每次60 s。最后用無菌濾紙吸干水分，置于3% WA培養(yǎng)基平板上。28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右，直至病樣產生大量分生孢子。

1.4簡易挑針的制備

將常用的不銹鋼昆蟲針（規(guī)格40 mm×0.38 mm）插入并固定于1 mL藍色槍頭前端，然后按照使用人習慣再套入3～4個藍色槍頭，用于顯微鏡下挑取分生孢子。

1.5單孢分離

將培養(yǎng)7 d左右的病樣放在超凈工作臺內的10倍顯微鏡下觀察，找到產生的分生孢子。然后用制備的簡易挑針挑取多個分生孢子到PSA培養(yǎng)基上，每個分生孢子之間保持一定距離。28℃培養(yǎng)12 h左右，在10倍顯微鏡下將萌發(fā)的分生孢子轉移到新的PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可獲得純化的稻瘟菌。

1.6分生孢子懸浮液的制備

參考劉任等[8]的方法制備分生孢子懸浮液。將純化的稻瘟菌接種到TOA培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)4～5 d。菌落直徑約5 cm時，向培養(yǎng)皿內加入1 mL無菌水，用接種環(huán)打碎菌絲，吸取約600 μL懸浮液接種到新的TOA培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，自然晾干培養(yǎng)基平板，于28℃黑暗培養(yǎng)36～48 h。待有一層致密的氣生菌絲長出，用棉簽擦去氣生菌絲，再用自來水洗去培養(yǎng)基表面上殘留的菌絲段與分生孢子，自然晾干培養(yǎng)基，蒙上2層無菌紗布，于28℃光照培養(yǎng)36～48 h至有大量分生孢子產生。用0.025% （W/V） Tween 20水溶液洗下分生孢子，即制成分生孢子懸浮液。

1.7產孢能力觀察

取一滴分生孢子懸浮液于40倍顯微鏡下鏡檢，觀察純化菌株的產孢能力。

2結果與分析

2.1單孢分離

在超凈工作臺內的顯微鏡下觀察，可以看到培養(yǎng)7 d左右的病樣產生的分生孢子（圖1a）。分生孢子成簇排列，呈梨形，由兩橫隔分成三個細胞（圖1b）。分生孢子萌發(fā)見圖1c。PSA培養(yǎng)基上生長5 d左右的稻瘟菌菌落直徑約為4～5 cm，菌絲生長致密，菌落內側顏色呈深灰色，外側顏色為灰白色（圖1d）。

2.2純化菌株產孢能力觀察

由于獲得純化菌株最終目的是為了檢測其致病性，因此需要對其產孢能力進行觀察。40倍顯微鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)，獲得的純化菌株可以產生大量分生孢子（圖1e）。調節(jié)懸浮液濃度至40倍鏡下每個視野有50個左右分生孢子（2×105個/mL）即可用于后續(xù)稻瘟菌接種試驗。

a： 病樣產孢情況，10倍鏡；b： 分生孢子梗及分生孢子形態(tài)，40倍鏡；

c： 分生孢子萌發(fā)，箭頭所指為菌絲，40倍鏡；d： 稻瘟菌菌落形態(tài)；e： 孢子懸浮液鏡檢，40倍鏡。

2.3單孢分離過程中的常見問題

2.3.1有些孢子無法萌發(fā)或繼續(xù)生長獲得純化菌株的重要一環(huán)是挑取分生孢子。筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)并非所有挑取的分生孢子都能萌發(fā)，并且從病樣上挑取的已萌發(fā)分生孢子轉移到PSA培養(yǎng)基上，往往菌絲也不再繼續(xù)生長。為了查明原因，40倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)這些不能萌發(fā)或萌發(fā)后菌絲不再繼續(xù)生長的分生孢子的膈膜已經消失，內部的原生質體形成了顆粒狀囊泡，最后整個分生孢子降解（圖2a、b）。

筆者分析認為WA培養(yǎng)基屬于無營養(yǎng)培養(yǎng)基，雖然利于誘發(fā)產生分生孢子，但是不能提供孢子萌發(fā)或萌發(fā)后繼續(xù)生長所需營養(yǎng)，從而導致有些孢子無法萌發(fā)或繼續(xù)生長，啟動了細胞程序性凋亡。

經過摸索，筆者采用震蕩法，敲擊含有病樣的培養(yǎng)皿，可促使剛成熟的分生孢子從孢子梗上脫落下來，然后將脫落的分生孢子挑取到PSA培養(yǎng)基上進行萌發(fā)培養(yǎng)獲得純化菌落，大大提高了試驗效率。

2.3.2菌株純化后長期保存需冷凍對于分離的稻瘟菌，可在TOA培養(yǎng)基上短期保存；而長期保存需要將其冷凍于-20℃冰箱內。具體方法如下：將稻瘟菌接種于鋪滿無菌濾紙片的TOA培養(yǎng)基上，待菌絲覆蓋濾紙片后，將濾紙片放入無菌牛皮紙袋內，無菌操作臺內晾12 h左右，然后放入干燥器中1周，最后放入-20℃冰箱內保存。待需要制備菌株接種前，取出濾紙片放置到TOA培養(yǎng)基上活化即可。-20℃冰箱內長期保存稻瘟菌時，必須確保濾紙片干燥，否則菌絲會失去活力，無法活化。為保持干燥可將牛皮紙袋與變色硅膠一起放入冰箱內。

2.3.3常有污染菌混生在培養(yǎng)病樣時，發(fā)現(xiàn)常有一種污染菌會與稻瘟菌混合生長（圖2c），在顯微鏡下觀察該菌外部形態(tài)初步確定為鏈隔孢（圖2d），利用rDNA-ITS方法獲得該菌序列后通過BLAST比對后確認其為細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）（數據未公開）。細極鏈格孢可引起多種植物黑斑病[9]，但并未在水稻上有所報道。同時，該菌又是生物有益菌，對環(huán)境污染物具有較強的降解作用且能產生具有抗病增產功能的多種蛋白激發(fā)子[9]。對于該菌在病樣出現(xiàn)的原因，筆者推測其可能是稻瘟病菌的拮抗菌，后續(xù)將繼續(xù)研究。

a： 不能萌發(fā)的分生孢子，40倍鏡；b： 萌發(fā)后不能繼續(xù)生長的分生孢子，40倍鏡；

c： 污染菌，10倍鏡；d： 污染菌孢子形態(tài)，40倍鏡。

3討論

山東地區(qū)屬于溫帶季風性氣候，在水稻生長的中后期，低溫陰雨或者多霧天氣發(fā)生頻繁，易造成稻瘟病的暴發(fā)流行。最近幾年山東稻區(qū)稻瘟病大面積發(fā)生，對水稻生產造成了較大損失[10]。由于水稻新品種審定中對稻瘟病抗性差的品種實行“一票否決”，如果選育的農藝性狀優(yōu)良的品種因為稻瘟病抗性差而被淘汰，會嚴重降低育種工作效率。因此掌握快速有效的稻瘟菌單孢分離技術，對區(qū)域稻瘟菌進行監(jiān)測分析，掌握生理小種動態(tài)變化，及時調整育種材料，對抗病育種工作很有必要。

獲取純化的稻瘟菌是及時掌握其動態(tài)變化的前提，而利用簡易挑針在顯微鏡下進行單孢分離是最快捷有效的途徑，可消除多種稻瘟病菌混雜的可能。在試驗中筆者發(fā)現(xiàn)WA培養(yǎng)基適合誘導稻瘟病菌產生分生孢子，但不適合分生孢子萌發(fā)，而且并非所有萌發(fā)的分生孢子都能夠繼續(xù)生長。通過震蕩培養(yǎng)皿的方法可以提高獲得能萌發(fā)分生孢子的幾率。另外，在采集穗頸瘟病樣后，要于通風處及時陰干，避免腐生菌滋生。

通過本研究筆者意在為廣大育種工作者提供稻瘟病菌單孢分離的詳細方法，并對分離過程中存在的一些問題進行分析，避免操作者走不必要的彎路，提高工作效率。對于試驗中鑒定出的細極鏈隔孢，下一步將對其進行相關拮抗試驗，確定其是否是稻瘟病菌生物防治的潛在利用對象。

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收稿日期：2016-10-08

基金項目：中國氣象局預報員專項“渤海灣南部強對流天氣的多尺度特征研究”（CMAYBY2016-041）

作者簡介：王曉立（1982-），女，山東濰坊人，本科，工程師，主要從事人工影響天氣工作。