樺褐孔菌多糖的研究進展

常 晨 包怡紅

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

樺褐孔菌多糖的研究進展

常 晨 包怡紅

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌的主要活性成分，在抗氧化、抗腫瘤等方面起到重要作用，是一種潛在的保健成分。文章闡述了樺褐孔菌多糖的提取、分離純化、生物活性以及結(jié)構(gòu)等方面的研究進展，并展望樺褐孔菌多糖進一步研究以及活性開發(fā)應(yīng)用的趨勢。

樺褐孔菌；多糖；研究進展

樺褐孔菌[Inonotusobliquus(Fr.)Pilat]屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、銹革孔菌科、褐臥孔菌屬真菌[1]，又被稱為白樺茸、褐多孔菌、斜管纖孔菌、樺癌褐孔菌[2]。樺褐孔菌多分布于北緯45°和50°之間的地理位置，中國主要生長樺褐孔菌的省份有黑龍江和吉林省，國外包括俄羅斯的西伯利亞和遠東地區(qū)、北美北部以及芬蘭等地[3]。16世紀，俄羅斯和北歐在沒有進行任何毒理學(xué)試驗下，已將樺褐孔菌作為一種民間藥物使用，用于治療多種疾病，如糖尿病等[4]。樺褐孔菌中含有豐富的多糖物質(zhì)，是其主要的活性成分[5]。有研究[6]表明，樺褐孔菌多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖和血脂以及調(diào)節(jié)免疫等生物活性。文章綜述樺褐孔菌多糖的提取分離、純化方法、生物活性、結(jié)構(gòu)以及開發(fā)前景等方面的研究進展，旨在為樺褐孔菌多糖的深入研究提供參考。

1 樺褐孔菌多糖的提取、分離純化

1.1 樺褐孔菌多糖的提取

常用的多糖提取方法見表1。

表1 常見的多糖提取方法[7]Table 1 Comparison of different extraction methods

1.1.1 熱水浸提法 熱水浸提法是一種應(yīng)用普遍的方法。郭宇等[8]采用三因素三水平的正交試驗優(yōu)化樺褐孔菌的多糖得率，結(jié)果表明水浴溫度80℃、時間3.5 h、料液比1∶15(g/mL)時，達到多糖最高提取率。在研究的溫度范圍內(nèi)，樺褐孔菌粗多糖的得率和純度與提取溫度呈正相關(guān)。李青等[9]設(shè)計了正交試驗，經(jīng)方差分析得出影響樺褐孔菌多糖提取效果因素從大到小分別是溫度、提取時間、料液比。結(jié)果顯示料液比1∶40(g/mL)、提取時間2.5 h、提取溫度90℃時，多糖達到最高提取率1.82%，多糖純度21.1%。朱曉麗等[10]采用正交試驗，研究了料液比、水浴溫度、時間對樺褐孔菌多糖提取率的影響，結(jié)果表明當料液比為1∶30(g/mL)、水浴溫度95℃、時間2.5 h，多糖達到最高得率17.53%。高愿軍等[11]通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗表明，當水浴溫度80℃、時間2.25 h、料液比1∶40(g/mL)時，樺褐孔菌多糖得率達到最高，此時多糖含量為17.39%?？梢?，熱水浸提法樺褐孔菌多糖的提取率與溫度和提取時間有著直接的關(guān)系。

1.1.2 超聲輔助提取法 胡濤等[12]以蒸餾水和異丙醇為提取劑，通過單因素試驗確定樺褐孔菌多糖的最佳提取工藝為超聲功率400 W、超聲20次、超聲10 min，多糖得率最高為11.62%。張慧麗等[13]采用超聲輔助提取法確定了樺褐孔菌多糖最佳提取條件：料液比1∶15(g/mL)、超聲時間1 h、溫度95℃、頻率20 kHz，此時多糖達到最高提取率1.822%。張麗霞等[14]采用正交試驗法，結(jié)果表明，當超聲時間20 min，料液比1∶50(g/mL)，溫度60℃時，多糖提取率最高。與熱水浸提法相比，超聲波輔助法，明顯降低了提取時間，由于原料和試驗系統(tǒng)的不同，提取率暫時不好比較。

1.1.3 微波輔助提取法 劉琳等[15]以乙醇和碳酸鉀為提取劑，微波輔助提取樺褐孔菌多糖，當碳酸鉀質(zhì)量分數(shù)25%，乙醇質(zhì)量分數(shù)24%時，達到最優(yōu)雙水相配比；當料液比為1∶50(g/mL)、微波功率為540 W、時間為120 s時，多糖達到最高提取率為(98.34±0.83)%。高愿軍等[16]在微波輔助下，響應(yīng)面分析3個因素對樺褐孔菌多糖含量的影響，影響效果從大到小分別是：微波功率、水料比、時間，最佳工藝條件為：微波功率720 W、提取時間32 min、料液比1∶80(g/mL)，多糖提取率最高，此時多糖含量為22.66%。與熱水浸提法相比，微波輔助提取法明顯降低了提取時間。

1.1.4 酶提取法 王艷波等[17]采用正交試驗優(yōu)化纖維素酶輔助提取樺褐孔菌多糖提取率，結(jié)果表明，當料液比1∶40(g/mL)、酶解時間60 min、酶解溫度50℃、加酶量0.15 g、酶解pH 5.0，多糖達到最大提取率2.57%。利用生物酶解技術(shù)破壞細胞壁進而提高活性物質(zhì)的浸出率，是近年來采用較多的提取方法，但目前關(guān)于樺褐孔菌多糖的酶法輔助提取多糖的文獻報道還較少，因為酶提取法生產(chǎn)成本相對較高，試驗中不常采用。

1.1.5 高壓脈沖電場輔助提取法 殷勇光等[18]采用高壓脈沖電場輔助提取樺褐孔菌多糖，結(jié)果表明，當料液比為1∶25(g/mL)、pH 10、電場強度30 kV/cm、脈沖數(shù)為6時，多糖達到最大提取率49.8%。與微波輔助法和超聲輔助提取作比較，高壓脈沖電場輔助法提取多糖明顯優(yōu)于微波輔助法和超聲輔助法。由于脈沖方波電源發(fā)生器造價較高，無法大規(guī)模應(yīng)用，目前關(guān)于高壓脈沖電場輔助提取法的研究較少，仍需要進一步的研究。

1.2 樺褐孔菌多糖的分離純化

樺褐孔菌中含有多種成分，對樺褐孔菌多糖進行提取時需要除去其中的蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，以獲得高純度的樺褐孔菌多糖。

1.2.1 樺褐孔菌多糖的脫蛋白 常用的多糖脫蛋白方法有Sevag法、酶法、鹽酸法、反復(fù)凍融法、三氯乙酸法(TLA)、三氟三氯乙烷法等方法[19]。張麗霞等[20]對比了Sevag法、三氯乙酸法、蛋白酶法對樺褐孔菌粗多糖脫蛋白的效果，Sevag法蛋白脫除率最高，多糖得率92.5%。韓耀玲等[21]對比了Sevag法、三氯乙酸法和酶法對樺褐孔菌粗多糖的脫蛋白效果，三氯乙酸法的蛋白脫除率最高。二者研究結(jié)果存在的差異，是由脫蛋白次數(shù)不同引起，前者重復(fù)了12次，直至蛋白除盡，而后者僅重復(fù)了6次。

1.2.2 樺褐孔菌多糖的脫色 常用的多糖脫色方法有活性炭、H2O2、樹脂、AL2O3柱層析、聚酰胺、殼聚糖等[22]。陳義勇等[23]分別對比了粉末活性炭、聚酰胺、樹脂對樺褐孔菌粗多糖的脫色效果，聚酰胺效果最好，多糖保留率最高為89.7%。玄光善等[24]比較研究了活性炭、殼聚糖、聚酰胺層析柱、過氧化氫對樺褐孔菌粗多糖的脫色率，脫色率從大到小依次是聚酰胺、活性炭、過氧化氫、殼聚糖，但殼聚糖和活性炭的多糖保留率相對較低，綜合比較，聚酰胺層析柱脫色率可達到89.3%，脫色效果較好，此時多糖保留率91.7%。以上研究對樺褐孔菌多糖脫色的效果表明，聚酰胺脫色效果最好，多糖保留率高。

1.2.3 樺褐孔菌多糖的純化 常用的多糖純化方法有色譜法，包括離子交換和凝膠色譜等[25]。范柳萍等[26]將水提醇沉得到的樺褐孔菌粗多糖，通過DEAE-SepharoseCL-6B離子交換柱，再分別采用磷酸鹽緩沖液和氯化鉀溶液進行線性梯度洗脫，通過苯酚—硫酸法測得收集液中的多糖含量，合并洗脫液，并依次經(jīng)過透析、濃縮、冷凍干燥后，得到4個組分IP1、IP2、IP3、IP4，分別占樺褐孔菌粗多糖的24.1%，33.6%，11.2%，11.3%，總回收率為80.2%。

1.2.4 樺褐孔菌多糖含量的測定 常用的測定多糖含量的方法可分為以下幾種[27]，其一化學(xué)法，包括苯酚—硫酸法、3，5-二硝基水楊酸(DNS)法、滴定法(斐林氏滴定法、間接碘量滴定法、氧化還原滴定法等)、蒽酮—硫酸法。其二色譜法，包括氣相色譜法、液相色譜法等。其三高效毛細管電泳法等。通常樺褐孔菌多糖含量采用苯酚—硫酸法測定[28]。

2 樺褐孔菌多糖的生物活性

2.1 抗腫瘤的作用

張慧麗等[29]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖對肝癌HEPG2細胞株存在抑制作用，多糖濃度1.44 μg/mL時，抑制率可達到70%。樺褐孔菌多糖還抑制小鼠S180肉瘤的生長，并可增強其免疫作用。灌胃劑量100 mg/kg時，抑制率達到35.01%。Kim等[30]研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌菌絲體多糖FⅡ-1可提高試驗組腫瘤小鼠的存活率，F(xiàn)Ⅱ-1是通過刺激機體免疫活性而產(chǎn)生抑制腫瘤作用。金光等[31]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌子實體多糖能抑制試驗小鼠的S-180肉瘤的生長，試驗組小鼠的狀態(tài)良好，肝臟指數(shù)及胸腺指數(shù)與正常對照組相近，試驗組小鼠的NOS含量、NO含量、SA濃度均比陰性對照組低，與正常組相近。樺褐孔菌大劑量組對腫瘤抑制率達到56.31%。綜上可得，樺褐孔菌多糖能夠較好抑制小鼠的S-180 肉瘤生長。Song等[32]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌菌絲體多糖可抑制肝癌SMMC7721細胞株的增殖。當多糖濃度達到150 μg/mL時，抑制率可達到60%，與陽性對照的抑制率相當。Chen等[33]研究發(fā)現(xiàn)，通過超聲微波輔助提取的樺褐孔菌子實體多糖具有顯著的體外抗腫瘤作用?？梢?，樺褐孔菌多糖有顯著的抗腫瘤作用。

2.2 抗氧化能力

吳艷玲等[34]試驗發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌多糖能夠使運動后小鼠體內(nèi)的BUN、MDA、CK、LDH的含量降低、并且使SOD活性和運動耐力增加，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度增加，樺褐孔菌多糖對DPPH·的清除率也增加，因此樺褐孔菌多糖存在較好的抗氧化能力?；鼐У萚35]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖具有清除·OH的能力，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度增加，樺褐孔菌多糖對·OH的清除率也增加，當多糖的濃度達到1.25 mg/mL時，·OH清除率為87%，達到最高水平；進一步研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖還有抑制過氧化脂質(zhì)(LPO)生成的作用，且在一定濃度內(nèi)，對脂質(zhì)過氧化抑制作用隨濃度增加而增加。綜上可得，樺褐孔菌多糖存在較好的抗氧化能力。Ma等[36]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖有較高的三價鐵還原能力、較高的抗脂質(zhì)過氧化作用和清除DPPH·能力。Xu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌液體發(fā)酵的胞外和胞內(nèi)多糖比子實體多糖具有更好的清除羥基自由基和DPPH·的能力?？梢?，樺褐孔菌多糖有顯著的抗氧化作用。

2.3 降血糖、降血脂的作用

付玲玲等[38]研究了樺褐孔菌多糖對糖尿病小鼠的降血脂作用，發(fā)現(xiàn)試驗組糖尿病小鼠的總膽固醇和總甘油三酯的含量降低，高密度脂蛋白膽固醇的含量提高，總體來說有一定的降血脂作用。崔鶴松等[39]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖對試驗組高脂血癥大鼠血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、丙二醛含量有降低作用，且高密度脂蛋白膽固醇含量及SOD活性升高。綜上所述，樺褐孔菌多糖能夠有效降低試驗大鼠的血脂。高愿軍等[40]研究了樺褐孔菌多糖口服液的降血糖效果，選用糖尿病小鼠為試驗組，發(fā)現(xiàn)試驗組小鼠血糖、血乳酸含量降低，胰島素、肝糖原含量增加，可以顯著降低糖尿病小鼠的血糖。Mizuno等[41]試驗發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌的水溶性多糖、水不溶性多糖都可以有效降低糖尿病小鼠的血糖，給小鼠注射后可抑制3～4 h。可見，樺褐孔菌多糖有顯著的降血糖、降血脂作用。

2.4 增強免疫活性

真菌多糖被稱為“免疫增強調(diào)節(jié)劑”。Kim等[30]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌多糖能夠激活巨噬細胞和B淋巴細胞有關(guān)的體液免疫。1 100 kDa的胞外多糖似乎是其有效成分，并且高分子量的β-葡聚糖比低分子量具有更好的活性。李娟[42]55-65研究了樺褐孔菌子實體多糖和發(fā)酵多糖對TNF-α、IFN-γ、1L-1β和1L-2的促生作用，結(jié)果表明子實體多糖和發(fā)酵多糖都能夠明顯促進細胞因子的分泌，促生作用與多糖濃度呈正相關(guān)性。相同的條件下，發(fā)酵多糖的效果更強。綜上可得，樺褐孔菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，且樺褐孔菌發(fā)酵多糖比子實體多糖具有更好的免疫調(diào)節(jié)作用。張澤生等[43]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌的水提多糖和堿提多糖對BALb/c小鼠的淋巴細胞有增殖作用。并能提高小鼠免疫器官指數(shù)、吞噬指數(shù)和血清溶血素含量，因此具有增強免疫活性的作用。王偉等[44]研究了樺褐孔菌子實體多糖對正常小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能，發(fā)現(xiàn)多糖可增加小鼠抗體分泌細胞的數(shù)量，提高腹腔巨噬細胞的吞噬功能，總的來說提高了小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能。武永德等[45]研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌子實體多糖FSPSⅠ和FSPSⅡ?qū)ν庵苎獑蝹€核細胞的增殖率分別達到120%，140%。增殖率越高，機體的免疫水平越高。可見，樺褐孔菌多糖有調(diào)節(jié)免疫活性的作用。

2.5 其他

張如平等[46]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌子實體多糖能夠顯著減輕哮喘小鼠肺組織的病理學(xué)改變，進而起到保護哮喘小鼠的作用。

3 樺褐孔菌的多糖分析

多糖的活性與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，包括一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)等[47]。常用的多糖結(jié)構(gòu)分析方法有兩種：① 化學(xué)法，包括酸水解法、Smith法等；② 儀器分析法，包括高效液相色譜、氣相色譜等。

許泓瑜等[48]將熱水浸提得到的粗多糖，采用氣相色譜法分析其主要單糖組成，包括半乳糖、葡萄糖、阿拉伯單糖、甘露糖，其質(zhì)量分數(shù)分別為2.44%，10.75%，0.53%，0.48%。Ma等[36]采用氣相色譜法分析樺褐孔菌粗多糖的單糖組成，結(jié)果為鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖。李娟[42]65-73利用氣相色譜法分析樺褐孔菌多糖的單糖組成，從大到小依次為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖。發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖中含量最高的是半乳糖。采用紅體積排阻與激光光散色法聯(lián)用測多糖分子量，結(jié)果表明多糖提取物EPS組分分子量在28～58 kDa，IPS的分子量在89～120 kDa，F(xiàn)SPS組分1重均分子量為32 kDa。Kim等[32]研究樺褐孔菌發(fā)酵菌絲體的胞外多糖，發(fā)現(xiàn)該多糖是α型糖苷鍵。范柳萍等[28]通過CG、HPLC及IR等方法分析樺褐孔菌多糖IP2a的組成、相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)。研究表明其單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為2.3∶4.5∶1∶2.5，它的相對分子質(zhì)量為86 053 U，主要由α型糖苷鍵構(gòu)成。

4 展望

樺褐孔菌多糖具有提高抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、增強免疫活性等功能，應(yīng)用于食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的市場具有廣大的前景。

對樺褐孔菌多糖的進一步研究，可以從以下幾個方面進行：① 加強對樺褐孔菌多糖結(jié)構(gòu)的深入研究，包括高級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和生物活性之間的構(gòu)效等方面；② 樺褐孔菌多糖有降血糖、免疫調(diào)節(jié)等功能，但目前研究多是對小鼠或大鼠的毒理學(xué)實驗，應(yīng)進一步從醫(yī)學(xué)方面研究其對人體的作用；③ 確定適合樺褐孔菌多糖提取的工業(yè)化生產(chǎn)工藝技術(shù)和生產(chǎn)中的關(guān)鍵控制點；④ 對樺褐孔菌多糖分子進行改性，以強化其生理活性。

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Research progress of inonotusobliquus polysaccharides

CHANG ChenBAOYi-hong

(CollegeofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin,Heilongjiang150040,China)

Inonotusobliquuspolysaccharide is one of the major constituents of active components inInonotusobliquus, which has important function on antioxidant, anti-tumor etc. and is one kind of potential health ingredients. Study the progresses ofInonotusobliquuspolysaccharide, including the extraction, isolation, purification, identification, bioactivity and composition, and offer the futher researchs and prospects ofInonotusobliquuspolysaccharide.

Inonotusobliquus; polysaccharide; research progress

中央高?；?編號：2572016CG02)

常晨，女，東北林業(yè)大學(xué)在讀博士研究生。

包怡紅(1970—)，女，東北林業(yè)大學(xué)教授，博導(dǎo)。 E-mail：baoyihong@163.com

2016—11—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.044