藤本豆豆莢總黃酮對小鼠免疫功能的影響

曹柏營 姜秀娟 戚穎欣 昌友權(quán)

(吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 長春 130052)

藤本豆豆莢總黃酮對小鼠免疫功能的影響

曹柏營 姜秀娟 戚穎欣 昌友權(quán)

(吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 長春 130052)

研究藤本豆豆莢總黃酮對正常小鼠免疫功能及體內(nèi)抗氧化活性的影響。以小鼠免疫器官系數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖活性、巨噬細(xì)胞吞噬能力、細(xì)胞因子水平、血清SOD、GSH-Px和MDA為指標(biāo)評價藤本豆豆莢總黃酮的免疫功能和體內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果表明，與陰性對照組比較，灌胃給予正常小鼠藤本豆豆莢總黃酮30 d后，小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)分別增加12.34%和8.67%，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖活性和巨噬細(xì)胞的吞噬能力分別增加114.68%和27.16%，小鼠血清IFN-γ、AKP、SOD和GSH-Px的活性分別提高8.25%，82.52%，10.47%，12.16%，血清MDA水平降低32.97%。藤本豆豆莢總黃酮具有增強(qiáng)正常小鼠免疫功能和體內(nèi)抗氧化活性的作用。

藤本豆；豆莢；黃酮；免疫功能；抗氧化活性

多年生藤本豆是野生扁豆與大油豆雜交得到的植物新品種，藤本豆蛋白、多糖、多肽和黃酮類化合物具有調(diào)節(jié)免疫[1]、降低血清膽固醇[2-3]、抗氧化的作用[4]。植物黃酮類化合物的藥理作用包括降血脂、清除自由基、抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抗骨質(zhì)疏松等，是保健食品的重要功效成分之一[5]。植物黃酮類化合物可通過特異性免疫和非特異性免疫發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[6]。藤本豆豆莢是藤本豆加工過程中的廢棄物，其豆莢中含有豐富的黃酮類化合物，由于其提取率和純度相對較低，一定程度上限制了植物黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用[7-8]。因此本研究以藤本豆豆莢為原料提取總黃酮，利用大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，提高了黃酮類化合物的提取率和純度，并對其免疫功能和體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行評價，旨在為藤本豆資源的綜合利用及保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藤本豆豆莢：采自福建省永春縣岵山鎮(zhèn)藤本豆種植示范基地，采后自然晾干，臨用時烘箱(60℃)干燥后粉碎備用；

昆明雌性小鼠：4周齡，SPF級，體重22～25 g，許可證號scXK(吉)2011-0013，長春生物制品研究所有限責(zé)任公司。

1.2 試驗試劑

伴刀豆蛋白A(ConA)：純度99%，美國Sigma公司；

二甲基亞砜：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

RPMI-1640培養(yǎng)基、Hank’s液：美國Sigma公司；

MTT：純度98%，美國Sigma公司；

胎牛血清：優(yōu)級純，生工生物工程(上海)股份有限公司；

堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、小鼠IFN-γ、IL-4 ELISA檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；

其他試劑均為分析純。

1.3 試驗儀器

可見分光光度計：WFJ2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：SPECTRA MAX 190型，美國Molecular Devices公司；

CO2培養(yǎng)箱：SHELLAB2406-2型，美國希爾頓制造股份有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：Z36HK型，德國Hermle公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 藤本豆豆莢總黃酮的提取 藤本豆豆莢粉(過60 目)，按1∶10(g/mL)加入60%乙醇水溶液，水浴(90℃)回流提取3 h，過濾，濾渣再按1∶10(g/mL)加入60%乙醇水溶液，水浴(90℃)回流提取2 h，過濾，合并濾液備用。藤本豆豆莢總黃酮得率計算：

(1)

式中：

R——藤本豆豆莢總黃酮得率，%；

a——吸光度值；

m——稱取樣品質(zhì)量，g。

1.4.2 藤本豆豆莢總黃酮的純化 選用AB-8樹脂對藤本豆豆莢總黃酮粗提物進(jìn)行純化，處理后的樹脂裝入層析柱(5 cm×60 cm)，上樣流速為2 BV/h，洗脫溶劑為60 mL/100 mL 乙醇水溶液，洗脫流速為2 BV/h。純化后凍干備用。

1.4.3 動物試驗

(1) 試驗動物分組及給藥：4周齡昆明小鼠(22～25 g)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為4組，每組30只。陰性對照組(生理鹽水200 mg/kg)、藤本豆豆莢總黃酮純化物高劑量組(400 mg/kg)、中劑量組(200 mg/kg)、低劑量組(100 mg/kg)。試驗期間小鼠自由飲水、采食，每天灌胃給藥一次。連續(xù)給藥30 d，期間每隔10 d隨機(jī)選取10只進(jìn)行免疫指標(biāo)的檢測。

(2) 小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)的測定：小鼠眼球取血后頸椎脫臼處死，解剖取其胸腺和脾臟，用濾紙吸干表面血污，稱重，按式(1)計算胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)(mg/g)。

(2)

(3) 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力測定：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力測定采用中性紅吞噬試驗測定。具體檢測方法參照劉文輝等[9]的試驗方法。吞噬能力以O(shè)D540 nm值表示，其值越大代表吞噬能力越強(qiáng)。

(4) T淋巴細(xì)胞增殖能力測定：T淋巴細(xì)胞增殖能力測定參照Chalamaiah等[10]的試驗方法。增殖能力以O(shè)D570 nm值表示，其值越大代表增殖能力越強(qiáng)。

(5) 血清生化指標(biāo)測定：小鼠眼球取血后，3 000 r/min離心取血清，嚴(yán)格按試劑盒操作說明，分別測定血清AKP、SOD、GSH-Px、MDA、IFN-γ、IL-4等指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 藤本豆豆莢總黃酮純化

藤本豆豆莢總黃酮提取得率可達(dá)到6.42%，提取率高于香薷中的總黃酮(5.36%)[11]。經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后，總黃酮純度達(dá)到35.73%，提高了4.5倍，與玉竹總黃酮的純化效果相當(dāng)[12]。

2.2 藤本豆豆莢總黃酮對小鼠胸腺和脾臟系數(shù)的影響

動物免疫器官的發(fā)育與機(jī)體的免疫能力密切相關(guān)，免疫器官是免疫細(xì)胞發(fā)育和增殖的場所，同時也是執(zhí)行免疫功能的重要機(jī)構(gòu)[13]。胸腺和脾臟是動物體內(nèi)的兩個重要的免疫器官，胸腺對T細(xì)胞分化、成熟起到重要作用[14]；脾臟內(nèi)含有大量的免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等。因此免疫器官的發(fā)育狀況成為免疫功能評價的重要指標(biāo)之一。

由圖1(a)可知，給藥第10天，與陰性對照組比較，中、高劑量組可極顯著增加小鼠胸腺系數(shù)(P<0.01)，分別增加了4.69%和5.86%；給藥第20天和第30天，中劑量組小鼠胸腺系數(shù)顯著增加(P <0.05)，分別增加了6.19%和9.71%；高劑量組小鼠胸腺系數(shù)極顯著增加(P <0.01)，分別增加了8.17%和12.34%。由圖1(b)可知，給藥第10天，中、高劑量組極小鼠脾臟系數(shù)顯著增加(P <0.01)，分別增加了4.5%和7.06%；第20天，中劑量組小鼠脾臟系數(shù)顯著增加(P <0.05)，增加了3.5%，高劑量組小鼠脾臟系數(shù)極顯著增加(P<0.01)，增加了6.64%；第30天，低、中和高劑量組小鼠脾臟系數(shù)都顯著增加，分別增加了3.83%，6.05%，8.67%。藤本豆豆莢總黃酮可促進(jìn)小鼠胸腺和脾臟的發(fā)育，增加胸腺和脾臟的相對質(zhì)量，金銀花黃酮也表現(xiàn)出相似的作用[15]。

*. 與陰性對照組比較P<0.05 **. 與陰性對照組比較P<0.01

2.3 藤本豆豆莢總黃酮對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

巨噬細(xì)胞能吞噬異物、處理抗原，是構(gòu)成機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，吞噬細(xì)胞活性的大小反映機(jī)體非特異性功能的強(qiáng)弱[16]。

由圖2可知，與陰性對照組比較，給藥10，20，30 d后，高、中和低劑量組的巨噬細(xì)胞吞噬活性都極顯著增加(P<0.01)，給藥30 d高劑量組吞噬活性增加114.68%，同時表現(xiàn)出一定的劑量反應(yīng)效應(yīng)，隨黃酮濃度的增大，巨噬細(xì)胞的吞噬活性增加，高劑量組表現(xiàn)出最高的吞噬活性。藤本豆豆莢總黃酮能通過提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性來增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫功能，蕨菜黃酮也可增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫功能[17]。

*. 與陰性對照組比較P<0.05 **. 與陰性對照組比較P<0.01

2.4 藤本豆豆莢黃酮對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

淋巴細(xì)胞受抗原物質(zhì)刺激后可分化增殖、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答或抗體，是細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞，淋巴細(xì)胞增殖試驗是評價細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)之一[18]。

由圖3可知，與陰性對照組比較，給藥10，20，30 d后，高、中和低劑量組黃酮都能極顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.01)，給藥30 d高劑量組淋巴細(xì)胞增殖能力提高27.16%，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，隨劑量的增加，增殖作用逐漸增強(qiáng)。藤本豆豆莢總黃酮能刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能，黃芪黃酮也可顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖[19]。

*. 與陰性對照組比較P<0.05 **. 與陰性對照組比較P<0.01

2.5 藤本豆豆莢黃酮對小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的影響

Th細(xì)胞可分泌不同的細(xì)胞因子，維持機(jī)體正常的免疫功能，其中Th1屬于促炎因子，通過表達(dá)TNF-α和IFN-γ來促進(jìn)細(xì)胞免疫和抑制體液免疫；Th2屬于抑炎因子，通過分泌IL-4、IL-6和IL-10來促進(jìn)體液免疫和抑制細(xì)胞免疫[20]。

由圖4(a)可知，與陰性對照組比較，低、中和高劑量組都可顯著增加小鼠血清中IFN-γ因子的表達(dá)(P<0.01)，給藥30 d高劑量組可增加8.25%，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；由圖4(b)可知，給藥10 d后，高劑量組可顯著增加小鼠血清中IL-4的表達(dá)(P<0.05)，其他各給藥組都無顯著性差異。藤本豆豆莢總黃酮可誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥性反應(yīng)，明顯增加IFN-γ的表達(dá)，誘導(dǎo)Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫而抑制體液免疫，白花舌草也表現(xiàn)出相同的免疫活性[21]。

*. 與陰性對照組比較P<0.05 **. 與陰性對照組比較P<0.01

2.6 藤本豆豆莢黃酮對小鼠血清AKP活力的影響

堿性磷酸酶(AKP)在細(xì)菌等異物的消化降解過程中發(fā)揮重要作用，另外AKP可增強(qiáng)機(jī)體對病原體的識別和吞噬能力，是免疫學(xué)研究的關(guān)鍵指標(biāo)之一[22]。

由圖5可知，與陰性對照組比較，給藥10，20，30 d后，高、中和低劑量黃酮組都可顯著提高小鼠血清AKP的濃度(P<0.01)，給藥30 d高劑量組小鼠血清AKP活力增加82.52%，高于金銀花黃酮高劑量組(12.73 U/100 mL)[15]。藤本豆豆莢總黃酮可提高小鼠血清AKP的活性，在調(diào)節(jié)小鼠免疫功能中發(fā)揮重要作用。

*. 與陰性對照組比較P<0.05 **. 與陰性對照組比較P<0.01

2.7 藤本豆豆莢黃酮對小鼠血清SOD和GSH-Px活性的影響

機(jī)體內(nèi)活性氧(ROS)水平過高會導(dǎo)致細(xì)胞壞死，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能的下降，保持機(jī)體內(nèi)氧化—抗氧化的內(nèi)穩(wěn)態(tài)可以提高機(jī)體的免疫能力[23]。SOD和GSH-Px的活性強(qiáng)弱是衡量機(jī)體清除自由基、抗氧化能力的重要指標(biāo)之一。

由圖6(a)可知，與陰性對照組比較，給藥10，20，30 d后，低、中和高劑量組都能極顯著提高小鼠血清SOD活性(P<0.01)，給藥30 d高劑量組小鼠血清SOD活性提高10.46%，隨給藥時間的延長，SOD的活性逐漸增強(qiáng)，給藥30 d后SOD的活性最強(qiáng)，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。由圖6(b)可知，與陰性對照組比較，給藥10，20，30 d后，低、中和高劑量組都能極顯著提高小鼠血清GSH-Px活性(P<0.01)，給藥30 d高劑量組小鼠血清GSH-Px活性增加12.16%，GSH-Px活性的增加與黃酮濃度之間存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。藤本豆豆莢總黃酮可提高小鼠血清SOD和GSH-Px的活性，提高小鼠體內(nèi)增強(qiáng)自由基反應(yīng)的酶系統(tǒng)能力，降低機(jī)體內(nèi)活性氧的水平，輔助增強(qiáng)小鼠的免疫功能，中華稻蝗也表現(xiàn)出相似的體內(nèi)抗氧化活性[24]。

*. 與陰性對照組比較P<0.05 **. 與陰性對照組比較P<0.01

2.8 藤本豆豆莢黃酮對小鼠血清MDA濃度的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其血清中濃度的高低可反映機(jī)體受氧自由基攻擊的程度。是抗氧化功能評價的重要指標(biāo)之一[25]。

由圖7可知，與陰性對照組比較，給藥10，20，30 d后，低、中和高劑量組都能極顯著降低小鼠血清MDA水平(P<0.01)，給藥30 d高劑量組小鼠血清隨給藥時間的延長，MDA濃度逐漸降低，給藥30 d后MDA濃度最低(降低32.97%)，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。藤本豆豆莢總黃酮可減輕小鼠體內(nèi)活性氧引起的氧化損傷，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少細(xì)胞損傷，杜仲葉黃酮也表現(xiàn)出相同的抑制氧化產(chǎn)物MDA積累的作用[26]。

*. 與陰性對照組比較P<0.05 **. 與陰性對照組比較P<0.01

3 結(jié)論

本試驗以藤本豆豆莢為原料提取植物黃酮類化合物，利用AB-8樹脂進(jìn)行純化，利用小鼠體內(nèi)試驗評價其免疫活性和抗氧化活性，結(jié)果表明，藤本豆豆莢總黃酮能促進(jìn)正常小鼠免疫器官(胸腺系數(shù)增加12.34%、脾臟系數(shù)增加8.67%)的發(fā)育，促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖(增加114.68%)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活力(提高27.16%)，誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥性反應(yīng)(IFN-γ水平增加8.25%)，促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫，提高小鼠體內(nèi)增強(qiáng)自由基反應(yīng)的酶系統(tǒng)能力(SOD和GSH-Px活性分別增加10.46%和12.16%)，降低機(jī)體內(nèi)活性氧的水平，減輕小鼠體內(nèi)活性氧引起的氧化損傷(MDA水平降低32.97%)，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少細(xì)胞損傷。藤本豆豆莢總黃酮具有大豆黃酮[27]、芒果皮黃酮[28]、淫羊藿黃酮[29]、白花蛇舌草黃酮[21]等植物黃酮類化合物相同的免疫調(diào)節(jié)功能，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性。試驗可為藤本豆資源的綜合開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，但有關(guān)藤本豆豆莢總黃酮中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能和抗氧化活性的成分鑒定及機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Effect of total flavonoids from perennialLablabsp. Hull on immune function in mice

CAO Bai-yingJIANGXiu-juanQIYing-xinCHANGYou-quan

(FoodEngineeringCollegeofJilinEngineeringNormalUniversity,Changchun,Jilin130052,China)

The effect of total flavonoids from PerennialLablabsp. Hull(FPLH) on the immune function and antioxidant activity in vivo were studied. With index of immune organ, spleen lymphocyte proliferation function, phagocytic activity of macrophages, cytokine levels in serum(IFN-γand IL-4), the activity of alkaline phosphatase in serum, the activity of SOD, GSH-Px and the level of MDA in serum as the evaluated indices, the immune function and antioxidant activities of FPLH in mice was studied. The results showed that the thymus index and spleen index of FPLH was higher than the control group by 12.34% and 8.67% respectively; the spleen lymphocyte proliferation activity, macrophage phagocytic activity, IFN-γ, AKP, SOD and GSH-Px levels in serum were significantly increased by 114.68%, 27.16%, 8.25%, 82.52%, 10.47%and 12.16% respectively; the MDA level in serum was significantly decreased by 32.97%. FPLH showed strong immune function and antioxidant activity in vivo.

PerennialLablabsp. ; hull; flavonoids; immune function; antioxidant activity

吉林省教育廳十二五科技規(guī)劃項目(編號：2013369)

曹柏營(1979-)，男，吉林工程技術(shù)師范學(xué)院講師，碩士。E-mail:caobaiying@163.com

2016—08—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.036