赤靈芝多糖分離純化及體外抗氧化性研究

徐雪峰 李桂娟 閆 浩 張 玉 張敬暢

(1. 海南科技職業(yè)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，海南 ?？?571126；2. 長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；3. 北京化工大學(xué)理學(xué)院，北京 100029)

赤靈芝多糖分離純化及體外抗氧化性研究

徐雪峰1李桂娟2閆 浩1張 玉1張敬暢3

(1. 海南科技職業(yè)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，海南 ?？?571126；2. 長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；3. 北京化工大學(xué)理學(xué)院，北京 100029)

對(duì)赤靈芝多糖進(jìn)行分離、純化和體外抗氧化性研究。從赤靈芝中提取粗多糖，通過(guò)離子交換色譜、葡聚糖凝膠色譜對(duì)粗多糖進(jìn)行分離純化，采用凝膠滲透色譜、氣相色譜進(jìn)行分子量和單糖組成測(cè)試，對(duì)GLPa-2、GLPb-1、GLPc 3個(gè)級(jí)分進(jìn)行了體外抗氧化性研究。結(jié)果表明，3個(gè)多糖級(jí)分主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖組成，但單糖的摩爾比不同；GLPa-2、GLPb-1、GLPc的重均分子量分別為3.65×105，3.87×104，1.38×104Da；各樣品對(duì)自由基的清除率隨濃度升高而增大，呈量效關(guān)系，分子量最大的GLPa-2抗氧化活性最佳，表明赤芝多糖的抗氧化活性與其組成相關(guān)。

赤芝多糖；分離；分子量；單糖組成；抗氧化

赤靈芝(簡(jiǎn)稱(chēng)赤芝)，廣義上稱(chēng)之為靈芝[Ganodermalucidum(Curtis:Fr.)Karst]，為層菌綱非褶菌目靈芝菌科靈芝屬真菌，是一種廣泛應(yīng)用的藥食兩用真菌，具有促進(jìn)睡眠、緩解機(jī)體疲勞、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、保肝等藥理活性[1-3]，赤芝中的多糖是其主要活性成分之一[4-5]。王海燕等[6]對(duì)靈芝菌絲體多糖分離純化得到3個(gè)多糖級(jí)分，多角度光散射儀聯(lián)用裝置測(cè)得其重均分子量各不相同；楊慧等[7]從赤芝子實(shí)體分離得到2個(gè)多糖組分，經(jīng)PMP柱前衍生化反相色譜分析表明其單糖組成存在顯著差異；郝杰等[8]研究得出不同分子量石斛多糖的抗氧化活性不同；倪力軍等[9]研究了8種多糖的組成與活性，得出其間存在相關(guān)性；還有研究[10-11]表明，多糖的抗氧化能力與多糖的單糖組成、分子量有較大關(guān)系。張志軍等[12]研究了靈芝多糖在體外對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖具有抗氧化作用和清除自由基的能力。劉鈞發(fā)等[13]比較了超聲法和水提法靈芝多糖的抗氧化活性，表明超聲法提取的靈芝多糖的DPPH自由基清除率、還原能力和氧自由基清除能力高于水提法。葉穎霞等[14]通過(guò)化學(xué)修飾改變靈芝多糖的結(jié)構(gòu)并研究其抗氧化活性，結(jié)果指出乙酰化修飾可顯著提高靈芝多糖的抗氧化活性。另有文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道靈芝多糖的分子量、單糖組成對(duì)靈芝多糖的藥理活性具有一定影響。靈芝多糖已被證實(shí)具有抗氧化活性，且已有研究人員從不同提取工藝和化學(xué)修飾等方面研究靈芝多糖的抗氧化活性，但對(duì)靈芝多糖不同級(jí)分的抗氧化性進(jìn)行比較分析的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。尤其是當(dāng)前有關(guān)靈芝多糖提取分離方法和相關(guān)活性的研究已進(jìn)入一個(gè)瓶頸期，而對(duì)靈芝多糖分離后所得級(jí)分的分子量、單糖組成進(jìn)行分析，并比較不同級(jí)分的藥理活性，探索靈芝多糖活性與前兩者之間關(guān)系的研究仍處于空白階段。本研究擬提取赤芝粗多糖，通過(guò)離子交換色譜、葡萄糖凝膠色譜對(duì)粗多糖進(jìn)行分離純化，利用凝膠滲透色譜法(GPC)分析各級(jí)分的分子量，衍生化處理后運(yùn)用氣相色譜(GC)分析各級(jí)分的單糖組成。通過(guò)羥自由基和超氧陰離子清除試驗(yàn)對(duì)各級(jí)分進(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)試，比較其抗氧化能力強(qiáng)弱，并對(duì)赤芝多糖級(jí)分的抗氧化活性、分子量、單糖組成進(jìn)行比較分析，以期為赤芝多糖在天然抗氧化劑方面的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤芝：海南本地赤芝子實(shí)體，切片干燥后粉碎過(guò)60目篩；

D-葡萄糖(Glc)、D-木糖(Xyl)、D-阿拉伯糖(Ara)、D-半乳糖(Gal)、D-鼠李糖(Rha)、D-巖藻糖(Fuc)、D-甘露糖(Man)標(biāo)準(zhǔn)品：含量>98%，上海源葉生物科技有限公司；

DEAESepharose CL-6B凝膠、Sephacryl S-300HR凝膠：美國(guó)Pharmacia公司。

其他試劑均為分析純；

凝膠色譜儀：ELEOS System型，配Waters515泵，DAWN HELEOSⅡ18角度激光光散射檢測(cè)器，Optilab rEx示差檢測(cè)器，美國(guó)Wyatt公司；

氣相色譜儀：Agilent 6890型，美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 赤芝粗多糖的提取 參考文獻(xiàn)[17]采用超聲波輔助法提取，95%乙醇進(jìn)行沉淀，得赤芝粗多糖GLP。

1.2.2 赤芝粗多糖的分離純化 赤芝粗多糖GLP用洗脫緩沖液溶解后上DEAE Sepharose CL-6B層析柱，依次用Tris—HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.6)和含0.0，0.2，0.5，0.8 mol/L NaCl的Tris—HCI緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.6)梯度洗脫，洗脫速度為2 mL/min，6 mL每管分部收集，隔管檢測(cè)多糖含量(苯酚硫酸法A490)。按多糖含量檢測(cè)值分別合并收集單一峰組分，去離子水透析，凍干。得到4個(gè)主要赤芝多糖組分GLPa、GLPb、GLPc、GLPd。上步收集的各個(gè)組分通過(guò)Sephacryl S-300HR層析柱在同濃度NaCl的緩沖液洗脫下進(jìn)一步分級(jí)純化，隔管檢測(cè)多糖含量。按多糖含量檢測(cè)值分別合并收集單一峰級(jí)分，去離子水透析，凍干。得GLPa-2、GLPb-1、GLPc 3個(gè)赤芝多糖級(jí)分。

1.2.3 分子量測(cè)定 采用凝膠滲透色譜法測(cè)定分子量，使用激光檢測(cè)器和示差光檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)，色譜柱：Shodex OHpak SB-804 HQ、SB-806 HQ(8 mm×300 mm)；流動(dòng)相：0.12 mol/L 醋酸銨溶液(含0.02% 疊氮化鈉)；流速：1 mL/min；柱溫：25℃。

1.2.4 單糖組成分析 取GLPa-2、GLPb-1、GLPc各10 mg，置10 mL具塞試管中，加4 mL 2 mol/L TFA溶液，封閉，120℃烘箱中水解反應(yīng)1.5～2.0 h，取出，放冷至室溫后，將水解液轉(zhuǎn)入25 mL梨形燒瓶，60℃水浴減壓蒸干。單糖乙?；瘏⒖嘉墨I(xiàn)[18]的方法進(jìn)行。GC條件：進(jìn)樣量1 μL，色譜柱：Agilent HP-INNOWax 19091N-133(30 m×250 μm×0.25 μm)，檢測(cè)器：FID，載氣：N2，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口200℃，汽化室320℃，檢測(cè)室250℃，分流比為20∶l，程序升溫，初溫60℃，6℃/min升至180℃。

1.2.5 羥自由基(·OH)清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行。清除率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

S——羥自由基(·OH)清除率，%；

Ax——加入H2O2和樣品液組的吸光度；

A空——加入H2O2不加樣品液組的吸光度；

A0——加入樣品液不加H2O2組的吸光度。

1.2.6 超氧陰離子(O2-·)清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行。清除率按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

S——超氧陰離子(O2-·)清除率，%；

As——樣品組的吸光度；

A0——用等量水代替樣品組的吸光度。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 1.2.5和1.2.6中，每種樣品均制成0.05，0.10，0.20，0.40，0.80 mg/mL共5個(gè)濃度進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度下分別進(jìn)行5次試驗(yàn)，利用數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理并進(jìn)行誤差分析，分別比較同種樣品不同濃度及同濃度不同樣品的·OH清除率和O2-·清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的分離純化

赤芝粗多糖GLP經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B層析柱洗脫，洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。GLP分離得到4個(gè)主要多糖組分GLPa、GLPb、GLPc、GLPd，得率分別為29.6%，21.1%，13.7%，4.8%。由于GLPd組分得率較低，只將GLPa、GLPb、GLPc 3個(gè)組分進(jìn)一步通過(guò)Sephacryl S-300HR層析柱分級(jí)純化，洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。GLPa經(jīng)分離得到GLPa-1、GLPa-2、GLPa-3 3個(gè)級(jí)分，其中以GLPa-2為主要成分，得率62.5%，洗脫峰較對(duì)稱(chēng)。GLPb經(jīng)分離得到GLPb-1、GLPb-2 2個(gè)級(jí)分，GLPb-1為主要成分，得率66.1%，峰形較對(duì)稱(chēng)。GLPc再次柱層析后洗脫曲線(xiàn)峰形較對(duì)稱(chēng)，組成相對(duì)單一，得率69.2%。因此將對(duì)GLPa-2、GLPb-1、GLPc 3個(gè)得率較高級(jí)分樣品的分子量、單糖組成和體外抗氧化活性進(jìn)行研究。

圖1 GLP經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B柱洗脫曲線(xiàn)Figure 1 Elution curve of GLP on DEAE Sepharose CL-6B

圖2 GLPa、GLPb和GLPc經(jīng)Sephacryl S-300HR柱洗脫曲線(xiàn)Figure 2 Elution curve of GLPa,GLPb and GLPc on Sephacryl S-300HR

2.2 分子量測(cè)定

圖3為GLPa-2、GLPb-1、GLPc的GPC樣品的示差光檢測(cè)峰。經(jīng)ASTRA 5.3.4數(shù)據(jù)處理軟件分析得出GLPa-2的重均分子量(Mw)為3.65×105Da，數(shù)均分子量(Mn)為3.01×105Da；GLPb-1的重均分子量為3.87×104Da，數(shù)均分子量(Mn)為2.65×104Da；GLPc的重均分子量為1.38×104Da，數(shù)均分子量(Mn)為8.15×103Da。何晉浙等[21]研究靈芝多糖分子量分布得出，靈芝多糖分子量分布主要在8×104～2×105Da，以高分子量多糖為主。本研究對(duì)靈芝粗多糖初次分離得到的高分子量組分GLPa、GLPb得率達(dá)50.7%，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相似；而分離到的GLPa-2和GLPc的分子量為3.65×105Da和1.38×104Da，進(jìn)一步說(shuō)明通過(guò)多次凝膠層析可從赤芝多糖分離出分子量更大或更小的均一組分。一般認(rèn)為，分散指數(shù)Mw/Mn越大，表明分子量分步越寬，反之越窄。GLPa-2、GLPb-1、GLPc的Mw/Mn分別為1.22，1.46，1.40，說(shuō)明3個(gè)赤芝多糖級(jí)分的分子量分步較集中，純度較好。另有研究[22-24]報(bào)道，具有活性的靈芝多糖的分子量一般大于1.0×104Da，分子量低于此值的多糖一般沒(méi)有活性或活性很低，QI等[10]提出水溶性多糖抗氧化能力與分子量分布有很大關(guān)系。

2.3 單糖組成分析

單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見(jiàn)圖4，通過(guò)與各單糖乙酰酯的保留時(shí)間對(duì)比，各單糖乙酰化后出峰順序依次為鼠李糖(7.267 min)、阿拉伯糖(8.253 min)、巖藻糖(8.634 min)、木糖(9.887 min)、甘露糖(13.019 min)、半乳糖(13.398 min)和葡萄糖(13.782 min)，肌醇的保留時(shí)間為15.031 min。

圖3 GLPa-2、GLPb-1和GLPc的GPC圖Figure 3 Gel permeation chromatography spectrogram of GLPa-2, GLPb-1 and GLPc

圖4 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品乙酰酯氣相色譜圖Figure 4 Gas chromatogram of alditol acetates of monosaccharide standard

GLPa-2、GLPb-1、GLPc水解乙酰化后的GC分析結(jié)果見(jiàn)圖5～7，結(jié)合圖4，說(shuō)明GLPa-2主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖4種單糖組成，算得其摩爾比為1.18∶1.99∶2.04∶3.68；GLPb-1、GLPc主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖5種單糖組成，摩爾比分別為1.54∶0.87∶2.65∶0.33∶4.01和1.24∶1.44∶1.43∶0.39∶4.39。何晉浙等[21]通過(guò)GC分析了靈芝多糖的組成，得出靈芝多糖由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖組成，其中葡萄糖為主要成分，含量為89%。與其研究結(jié)果相比，靈芝多糖的總體組成一致，但各級(jí)分所含單糖比例不同，且GLPa-2不含半乳糖。以上表明分子量不同的赤芝多糖級(jí)分，其單糖組成和含量不同，多糖結(jié)構(gòu)存在差異；葡萄糖含量低于文獻(xiàn)[21]報(bào)道的89%，原因可能是靈芝品種不同，以及在分離純化過(guò)程中損失的其他級(jí)分主要組成為葡萄糖。

2.4 ·OH和O2-·清除率試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)羥自由基的清除率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，所有樣品對(duì)羥自由基均有清除作用，且清除率隨濃度升高而增大，清除率與濃度呈量效關(guān)系。當(dāng)濃度達(dá)到0.80 mg/mL時(shí)，GLPa-2、GLPb-1、GLPc、GLP和VC對(duì)羥自由基的清除率分別為71.44%，30.87%，37.64%，43.68%，88.45%，GLPa-2對(duì)羥自由基的清除率與VC最為接近，相當(dāng)于VC的80.77%，分別為GLP、GLPb-1、GLPc的1.64，2.31，1.90倍。表明GLPa-2具有較好的羥自由基清除能力，且優(yōu)于純化前的赤芝粗多糖GLP，其他級(jí)分對(duì)羥自由基清除能力一般。

圖5 GLPa-2水解產(chǎn)物乙酰酯氣相色譜圖Figure 5 Gas chromatogram of alditol acetates of GLPa-2

圖6 GLPb-1水解產(chǎn)物乙酰酯氣相色譜圖Figure 6 Gas chromatogram of alditol acetates of GLPb-1

圖7 GLPc水解產(chǎn)物乙酰酯氣相色譜圖Figure 7 Gas chromatogram of alditol acetates of GLPc

對(duì)超氧陰離子的清除率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9，與對(duì)羥自由基的清除率試驗(yàn)相似，各樣品清除率與濃度呈量效關(guān)系。由圖9 可知，與VC比較，GLP、GLPb-1、GLPc對(duì)超氧陰離子的清除能力一般，當(dāng)濃度增至0.80 mg/mL時(shí)，GLPa-2的清除率增加到86.27%，為VC的94.54%，分別是GLP、GLPb-1、GLPc的1.62，2.66，2.48倍。

綜上分析，赤芝多糖級(jí)分GLPa-2、GLPb-1、GLPc的分子量和單糖組成類(lèi)型及比例各不一致，其在不同體系中的抗氧化活性也存在明顯差異，說(shuō)明赤芝多糖的抗氧化活性和其分子量、單糖組成相關(guān)，與鮑素華等[25]對(duì)鐵皮石斛多糖的研究結(jié)果相似。赤芝多糖級(jí)分分子量大小為GLPa-2>GLPb-1>GLPc，但其抗氧化性大小為GLPa-2>GLPc>GLPb-1，表明赤芝多糖的抗氧化性與其分子量并非正相關(guān)。倪力軍等[9]指出各單糖對(duì)多糖體外抗氧化活性具有影響，從赤芝單糖組成分析結(jié)果可知，GLPa-2中木糖的組成比例高于其他2個(gè)級(jí)分，且不含半乳糖，推測(cè)可能是GLPa-2優(yōu)于GLPc和GLPb-1抗氧化活性的原因。表明赤芝多糖的體外抗氧化活性除與其分子量相關(guān)外，還受各級(jí)分單糖組成的影響，各單糖對(duì)其影響程度還有待進(jìn)行大量的試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析得出。

圖8 樣品對(duì)羥自由基的清除率Figure 8 Scavenging rate of hydroxyl radical of samples

圖9 樣品對(duì)超氧陰離子的清除率Figure 9 Scavenging rate of superoxide anion radical of samples

3 結(jié)論

之前，赤芝多糖的抗氧化活性已有研究報(bào)道[12,26-28]，本研究進(jìn)一步對(duì)赤芝粗多糖進(jìn)行分離純化，得到3個(gè)主要級(jí)分GLPa-2、GLPb-1和GLPc，并研究了各級(jí)分的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，赤芝多糖級(jí)分的分子量大小、單糖組成不同，其抗氧化性也存在差異。赤芝多糖純化級(jí)分GLPa-2對(duì)羥自由基和超氧陰離子的清除率明顯高于赤芝粗多糖和其他級(jí)分，與VC相近，具有良好的抗氧化活性，其重均分子量大小為3.65×105Da，由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖4種單糖組成。研究從赤靈芝粗多糖中分離并篩選出了一個(gè)最佳抗氧化活性級(jí)分——GLPa-2，這對(duì)赤芝多糖的綜合開(kāi)發(fā)和有效利用具有重要指導(dǎo)意義。

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Study on isolation and antioxidant activity of the polysaccharide fromGanodermalucidum

XU Xue-feng1LIGui-juan2YANHao1ZHANGYu1ZHANGJing-chang3

(1.CollegeofBiologicalandChemicalEngineeringofHainanInstituteofScienceandTechnology,Haikou,Hainan571126,China; 2.InstituteofChemicalEngineeringofChangchunUniversityofTechnology,Changchun,Jilin130012,China; 3.FacultyofScienceofBeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China)

Isolation, purification and antioxidant activity in vitro of polysaccharide fromGanodermalucidumwere studied. Polysac-charide was extracted fromG.lucidum, and three fractions were isolated through ion exchange chromatography and allyl dextran gel chromatography from them, including GLPa-2, GLPb-1, and GLPc. The weight-average molecular weight was detected by gel permeation chromatographic, and then monosaccharide composition was detected by gas chromatography. The results were described as follows. The component parts of polysaccharides were composed of glucose, arabinose, xylose and mannose, with different containing rates, and the average molecular weight of GLPa-2, GLPb-1, GLPc was detected to be 3.65×105Da, 3.87×104Da, 1.38×104Da, respectively. Moreover, a dose-effect relation between the concentration of polysaccharides fraction and the eliminating ratio was also found, and GLPa-2, composed of glucose, arabinose, xylose, and mannose, the largest molecular among the three ones, showed the highest antioxidant activity. Thus it turned out that the antioxidant activity of polysaccharides fromG.lucidumwas related to their composition.

Ganodermalucidumpolysaccharides; isolate; molecular weigh; monosaccharide composition; antioxidant activity

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(編號(hào)：214034)

徐雪峰，男，海南科技職業(yè)學(xué)院講師，江西理工大學(xué)在讀碩士研究生。

李桂娟(1957-)，女，長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)教授，博士。 E-mail: 332175870@qq.com

2016—10—12

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.033