產(chǎn)β-苯丙氨酸變位酶基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件優(yōu)化

葛 飛 唐 堯 朱龍寶 李藝雯 段振超 馬琪森 陶玉貴

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

產(chǎn)β-苯丙氨酸變位酶基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件優(yōu)化

葛 飛 唐 堯 朱龍寶 李藝雯 段振超 馬琪森 陶玉貴

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

構(gòu)建β-苯丙氨酸變位酶基因表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-pam，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得β-苯丙氨酸變位酶基因重組菌?？疾炫囵B(yǎng)基初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、種齡、發(fā)酵時(shí)間以及裝液量5個(gè)因素對(duì)β-苯丙氨酸變位酶基因工程菌產(chǎn)酶活性的影響，確定較佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時(shí)間24 h、裝液量50 mL/500 mL、種齡10 h。采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇了種齡、初始pH、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)對(duì)β-苯丙氨酸變位酶活力影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為：在種齡12.8 h、初始pH 6.7、發(fā)酵時(shí)間25.2 h條件下，PAM活力達(dá)到11.15 U/mL，比優(yōu)化前酶活4.87 U/mL提高了128.9%。

重組大腸桿菌；產(chǎn)酶條件；β-苯丙氨酸變位酶；發(fā)酵

β-苯丙氨酸氨基變位酶(β-Phenylalanine aminomutase，PAM)屬于MIO-依賴氨基變位酶(MIO-dependent aminomutase)，由于其特殊的催化特性可以在沒(méi)有輔酶因子的情況下催化α-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-苯丙氨酸[1-2]。β-苯丙氨酸可以作為食品添加劑改善食品香味，脫氫降解以后還可作為蜜餞的食品添加劑，改善蜜餞的口感風(fēng)味，也可作為食品的無(wú)公害環(huán)保防腐劑。另外，β-苯丙氨酸還是目前最有效的抗癌藥物紫杉醇(Taxol)合成中的重要前體物質(zhì)之一，自然界中僅在植物紅豆杉(Taxus L.)中發(fā)現(xiàn)含有PAM[3-4]。目前生產(chǎn)β-氨基酸的主要方法是化學(xué)拆分法和手性輔助劑合成法等[5-6]。這些方法合成過(guò)程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高昂，產(chǎn)品需要多次結(jié)晶才能使用，且在生產(chǎn)過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生有毒有害的副產(chǎn)物，不能滿足實(shí)際需求，利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建工程菌是未來(lái)高效、快速、安全生產(chǎn)的趨勢(shì)[7-8]。目前中國(guó)對(duì)PAM的報(bào)道鮮有提及，國(guó)外研究主要集中在β-苯丙氨酸變位酶(PAM)生產(chǎn)β-苯丙氨酸的方法方面，Szymanski W等[9]利用PAM催化得到了α-苯丙氨酸與β-苯丙氨酸的1∶1的混合產(chǎn)物。Wu等[10]使用PAM的幾種突變型酶進(jìn)行比較，選擇出了其中較高催化率的酶并研究探討了其催化機(jī)制。雖然有利用PAM催化生產(chǎn)β-苯丙氨酸的驗(yàn)證以及機(jī)制原理研究，但未見(jiàn)利用重組大腸桿菌生產(chǎn)PAM并優(yōu)化其發(fā)酵條件。因此構(gòu)建PAM基因重組菌，并利用重組大腸桿菌生產(chǎn)PAM，優(yōu)化其產(chǎn)酶條件具有一定的理論和實(shí)踐意義。本研究擬構(gòu)建PAM重組大腸桿菌，研究不同發(fā)酵條件對(duì)β-苯丙氨酸重組菌產(chǎn)酶的影響，并采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高PAM重組菌的產(chǎn)量，利用分子生物學(xué)手段和優(yōu)化發(fā)酵條件得到一種新型、環(huán)保、高效的β-苯丙氨酸的生產(chǎn)方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21、質(zhì)粒pET28a：本實(shí)驗(yàn)室保藏；

DH5α-pam：蘇州金唯智生物科技有限公司；

限制性內(nèi)切酶EcoRI、NdeI、Prime STAR DNA聚合酶：2.0×104units/mL，NEB公司；

SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、磁珠法DNA膠回收試劑盒、dNTP Mixture(每種8 μmol)：生工生物工程(上海)技術(shù)有限公司；

T4 DNA連接酶：4.0×105units/mL，生工生物工程(上海)技術(shù)有限公司；

胰蛋白胨、酵母提取物：生物試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

葡氯化鈷、氯化銅、氯化錳、乙二胺四乙酸、硼酸、乙酸鋅、雙氨基甲烷、十六烷基三甲基溴華胺：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

卡那霉素、α-苯丙氨酸、β-苯丙氨酸：生物試劑，生工生物工程(上海)技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

組合式全溫度震蕩培養(yǎng)箱：QHZ-123B型，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

無(wú)菌操作臺(tái)：YJ-1450型，蘇州工業(yè)園區(qū)三興凈化技術(shù)有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：JH-723型，上海菁華科技儀器有限公司；

臺(tái)式低速離心機(jī)：L550型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；

電子天平：YP-1002型，上海佑科儀器儀表有限公司；

數(shù)顯pH計(jì)：PHSJ-3F型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器：JK-2200型，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司。

1.3 重組菌的構(gòu)建

1.3.1 重組質(zhì)粒pET-28a-pam的構(gòu)建 依據(jù)NCBI所公布(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY724735.1； GenBank編號(hào):AY724735.1)的paPAM基因序列以及Lei等[11]的研究成果設(shè)計(jì)上下游引物，上游引物p1：5-GGAATTCCATATGATGGGGTTTGCCGTGGAATCGCGTTCTCACG-3'；下游引物p2：5-CGGAATTCCTAGACGCCGTTGGCGCACCCA-TTTGGTTGG-3'。在LB培養(yǎng)基中隔夜培養(yǎng)DH5α-pam，利用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取其中質(zhì)粒。使用50 μL體系在94℃預(yù)變性4 min、94℃變性1 min、58℃退火30 s、72℃延伸2 min條件下對(duì)其進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，50 μL體系為：模板2 μL、Primerup 1 μL、Primerdown 1 μL、5×PSBuffer 10 μL、Prime STAR 0.5 μL、dNTPMixture 4 μL，利用無(wú)菌水補(bǔ)充到50 μL。PCR產(chǎn)物回收后使用EcoRI/NdeI在37℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行雙酶切4 h，雙酶切體系為：回收產(chǎn)物40 μL、EcoRI 0.5 μL、NdeI 0.5 μL、100×H Buffer 5 μL，利用無(wú)菌水補(bǔ)充到50 μL。電泳后使用磁珠法DNA膠回收試劑盒回收純化含有目的基因的片段，將純化產(chǎn)物與pET28載體在-16℃條件下進(jìn)行連接，體系為：純化產(chǎn)物7 μL、pET-28 1.5 μL、10×Buffer 1 μL、T4 DNA Ligase 0.5 μL。1.3.2 PAM重組菌的構(gòu)建 使用氯化鈣法制作BL21感受態(tài)細(xì)胞，利用構(gòu)建出的表達(dá)載體pET-28a-pam和BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行KCM法轉(zhuǎn)化，得到重組大腸桿菌。

1.4 培養(yǎng)基配制

種子培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖1 g/L、卡那霉素0.5 g/L，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀13 g/L、葡萄糖20 g/L、硫酸鎂1.3 g/L、檸檬酸1.7 g/L、氯化錳1.5 g/L、氯化銅1.5 g/L、硼酸3 g/L、高猛酸鈉2.5 g/L、乙酸鋅13 g/L、乙二胺四乙酸8.4 mg/L、氯化鈷2.5 mg/L，pH 7.0。

1.5 培養(yǎng)方法

將菌種過(guò)夜活化后取1 mL放入50 mL種子培養(yǎng)基中，使用500 mL三角燒瓶進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)條件為200 r/min、30℃。以10%的接種量將種子培養(yǎng)基接入到100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用500 mL的三角燒瓶在200 r/min、30℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。16 h后于42℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，30℃繼續(xù)培養(yǎng)，直到可以檢測(cè)出酶活。

1.6 酶活測(cè)定

1.6.1β-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 詳細(xì)繪制方法見(jiàn)文獻(xiàn)[12～13]。分別取濃度為480 μg/mL和620 μg/mL的β-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液5 mL加入到10 mL比色皿中，再分別加入1 mL的茚三酮試劑使其充分混合均勻。使用數(shù)顯恒溫水浴鍋在90℃下水浴25 min，冷卻至室溫。利用723型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量其在570 nm下的光吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度和濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 測(cè)定方法 取5 mL菌種培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min，生理鹽水清洗,再次離心，用10 mL的25 mmol/L Tris—HCl溶液徹底懸浮細(xì)胞。取1 mL的懸浮液，用0.5 g/L 的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)于30℃水浴10 min，3 000 r/min離心10 min。沖洗沉淀，并加入50 mmol/Lα-苯丙氨酸溶液2.5 mL和25 mmol/L Tris—HCl 2 mL，40℃條件下反應(yīng)10 min，以0.2 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。離心后使用723紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在570 nm下的吸光度。利用式(1)計(jì)算酶活：

(1)

式中：

U——酶活單位，U/mL；

V——反應(yīng)體積，mL；

Mw——β-苯丙氨酸的分子質(zhì)量；

C——β-苯丙氨酸的濃度，mg/L；

T——反應(yīng)時(shí)間，min。

1.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.7.1 初始pH的確定 以1.4中發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在30℃、接種量10%、種齡12 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，分別以初始pH值6.0，6.5，7.0，7.5，8.0振蕩培養(yǎng)16 h。按1.6 的方法檢測(cè)PAM酶活，考察初始pH對(duì)PAM酶活的影響。

1.7.2 種齡的確定 以1.4中發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在30℃、接種量10%、初始pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，分別接種種齡為8，10，12，14，16 h的種子培養(yǎng)液于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16 h。按1.6的方法檢測(cè)PAM酶活，考察不同種齡培養(yǎng)液對(duì)PAM酶活的影響。

1.7.3 發(fā)酵時(shí)間的確定 以1.4中發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在30℃、接種量10%、種齡12 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、初始pH 7.0 條件下，分別于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)20，22，24，26，28 h。按1.6的方法檢測(cè)PAM酶活，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)PAM酶活的影響。

1.7.4 裝液量的確定 以1.4中發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在30℃、接種量10%、初始pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、初始pH 7.0條件下，分別于25，50，75，100，125 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h。按1.6的方法檢測(cè)PAM酶活，考察裝液量對(duì)PAM酶活的影響。

1.7.5 搖床轉(zhuǎn)速的確定 以1.4中發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在30℃、接種量10%、初始pH 7.0條件下，分別于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中在160，180，200，220，240 r/min搖床速度下培養(yǎng)16 h。按1.6的方法檢測(cè)PAM酶活，考察搖床轉(zhuǎn)速對(duì)PAM酶活的影響。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分析各個(gè)因素對(duì)產(chǎn)PAM的較佳條件。選擇對(duì)PAM產(chǎn)酶影響較大的3個(gè)因素，利用Design Expert軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，對(duì)種齡、初始pH、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)發(fā)酵條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAM重組菌的構(gòu)建

將構(gòu)建菌株在37℃條件下培養(yǎng)1 h，然后涂布于抗性平板篩選陽(yáng)性重組子。利用PCR進(jìn)一步驗(yàn)證重組子，提取重組菌的質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1)，PCR擴(kuò)增后使用EcoRI/NdeI進(jìn)行雙酶切。得到目的條帶大小約為2 100 bp(見(jiàn)圖2)，與預(yù)期相符合，測(cè)序與NCBI所公布的paPAM基因序列相符。證明成功構(gòu)建了含有目的基因的重組大腸桿菌。

2.2 單因素對(duì)重組菌產(chǎn)酶活的影響

2.2.1 初始pH對(duì)PAM酶活性的影響 由圖3可知，初始pH低于6.5時(shí)，PAM的活性明顯較低，可能與低pH值會(huì)影響菌株壽命和PAM酶活有關(guān)。在pH為6.5～7.0時(shí)，PAM酶活較高，pH為7.0時(shí)酶活最高達(dá)到5.77 U/mL；當(dāng)pH超過(guò)7.0后，酶活呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明過(guò)高pH也會(huì)抑制PAM酶活。

圖1 pET-28a-pam結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 pET-28a-pam Structure diagram

M. DL10000 marker 1. pET-28a-pam 2. pET-28a-pam digested with EcoR I/Mde I

圖3 初始pH值對(duì)PAM酶活性的影響Figure 3 Effects of initial pH value of fermentation medium on PAM activity

2.2.2 種齡對(duì)PAM酶活性的影響 由圖4可知，接種種齡小于10 h時(shí)的種子液，PAM酶活性呈遞增趨勢(shì)。種齡10 h的發(fā)酵液PAM酶活達(dá)到最大值(5.36 U/mL)，種齡超過(guò)10 h后，酶活呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。小于10 h的種子活力不夠，生長(zhǎng)速度較慢。10 h之后的種子開(kāi)始老化，活力受到代謝副產(chǎn)物的影響進(jìn)而導(dǎo)致酶活下降。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)PAM活性的影響 由圖5可知，發(fā)酵時(shí)間在20～24 h時(shí)，PAM酶活逐步增大，在發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，PAM酶活達(dá)到最大值(5.47 U/mL)。發(fā)酵時(shí)間超過(guò)24 h后，PAM酶活快速下降，可能與菌株培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體老化，發(fā)酵后期大量生成其它發(fā)酵產(chǎn)物有關(guān)。

圖4 種齡對(duì)PAM酶活性的影響Figure 4 Effects of inoculation time on PAM activity

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)PAM酶活性的影響Figure 5 Effects of fermentation time on PAM activity

2.2.4 裝液量對(duì)PAM活性的影響 由圖6可知，在500 mL三角瓶中裝入50 mL培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液中PAM酶活最高，為5.62 U/mL，裝液量在50～100 mL時(shí)，PAM酶活緩慢遞減，然后趨于穩(wěn)定。這是由于裝液量逐步增大時(shí)搖瓶?jī)?nèi)的溶解氧含量下降，較低的氧濃度影響了菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積累，致使PAM酶活下降。

圖6 裝液量對(duì)PAM酶活性的影響Figure 6 Effects of broth volume on PAM activity

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)PAM活性的影響 由圖7可知，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，PAM酶活最大，為5.56 U/mL，大于或小于200 r/min時(shí)都會(huì)導(dǎo)致酶活下降。這是由于轉(zhuǎn)速過(guò)低會(huì)導(dǎo)致溶解氧不足，菌株生長(zhǎng)、代謝受到抑制；而轉(zhuǎn)速過(guò)高會(huì)使菌株過(guò)快消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，初級(jí)代謝產(chǎn)物積累過(guò)快，影響PAM酶活性。

2.3 Box-behnken試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)PAM酶活影響較大的種齡、初始pH以及發(fā)酵時(shí)間作為優(yōu)化對(duì)象。利用Design Expert軟件設(shè)計(jì)出三因素三水平的方案，設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

圖7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)PAM酶活性的影響Figure 7 Effects of rotate speed on PAM activity

以Y(PAM活性)為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件分析表2中的試驗(yàn)結(jié)果，可以得到X1、X2、X3的三元二次回歸方程：

(2)

表1 中心組合試驗(yàn)三因素三水平表Table 1 Three main fermentation conditions and their three levels of optimization test based on central composition design principle

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表Table 2 Design and results of Box-Behnken

2.4 響應(yīng)面分析

使用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，可以得到種齡、初始pH、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素兩兩之間影響的關(guān)系。由圖8～10可知，每一個(gè)響應(yīng)面都存在極值，即每一個(gè)影響因子對(duì)于PAM重組菌均存在一個(gè)最優(yōu)條件；且等高線接近圓形，證明3個(gè)因素之間的交互作用不顯著。

經(jīng)軟件計(jì)算，所選3個(gè)影響PAM產(chǎn)酶活性因素的最優(yōu)組合為種齡12.8 h、初始pH 6.7、發(fā)酵時(shí)間25.2 h。上述3個(gè)數(shù)值均可以在實(shí)際操作中進(jìn)行驗(yàn)證。

2.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

在所得的最優(yōu)組合條件種齡12.8 h、初始pH 6.7、發(fā)酵時(shí)間25.2 h條件下，重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，PAM酶活平均值為11.15 U/mL，與預(yù)測(cè)值誤差為6.4%，誤差值在10%以內(nèi)，證明了利用響應(yīng)面法優(yōu)化重組菌產(chǎn)酶條件的準(zhǔn)確性。在優(yōu)化后發(fā)酵條件下，進(jìn)行工程菌培養(yǎng)PAM酶活可達(dá)11.15 U/mL，比優(yōu)化前提高了128.9%。

表3 參數(shù)估計(jì)及方差分析表?Table 3 Parameter estimates and analysis of regression equation obtained

圖8 種齡(A)和初始pH(B)交互影響PAM酶活性的響應(yīng)面圖Figure 8 RSD figure of inoculation time (A) and initial pH value(B) interacting on PAM activity

圖9 種齡(A)和發(fā)酵時(shí)間(C)交互影響PAM酶活性的響應(yīng)面圖Figure 9 RSD figure of inoculation time(A) and fermentation time(C) interacting on PAM activity

圖10 初始pH(B)和發(fā)酵時(shí)間(C)交互影響PAM酶活性的響應(yīng)面圖Figure 10 RSD figure of initial pH value(B) and fermentation time(C) interacting on PAM activity

3 結(jié)論

目前β-苯丙氨酸的主要生產(chǎn)方法為化學(xué)合成法，其技術(shù)也相對(duì)成熟，但是生物酶法具有安全、清潔、高效的特點(diǎn)有著巨大的優(yōu)勢(shì)，利用生物酶法制備β-氨基酸也被越來(lái)越多地關(guān)注。一些學(xué)者[11,14]在研究變位酶催化的機(jī)制，得到了關(guān)于PAM的催化機(jī)理以及催化特點(diǎn)，但仍然缺乏在生產(chǎn)、生活中利用PAM進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用的研究，對(duì)β-苯丙氨酸日益增長(zhǎng)的需求也未得到較好解決。

本試驗(yàn)利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建出產(chǎn)PAM重組大腸桿菌，并對(duì)PAM重組菌的產(chǎn)酶條件優(yōu)化，確定了重組菌較佳單因素試驗(yàn)條件，即初始pH 7.0、種齡10 h、發(fā)酵時(shí)間24 h、裝液量50 mL、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法得到了3個(gè)較主要影響因素的最佳組合為種齡12.8 h、初始pH 6.7、發(fā)酵時(shí)間25.2 h，進(jìn)一步促進(jìn)菌株發(fā)酵液中PAM酶活提高，為PAM在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。然而，利用重組菌獲得PAM還存在著產(chǎn)量低，菌株穩(wěn)定性不高等問(wèn)題，各種條件的優(yōu)化也還在進(jìn)一步探索之中，利用工程菌產(chǎn)酶優(yōu)化的方法、PAM的催化條件都尚需深入研究。

[1] WANG Kang, HOU Qin-qin, LIU Yong-jun. Insight into the mechanism of aminomutase reaction: A case study of phenylalanine aminomutase by computational approach[J]. Journal of Molecular Graphics & Modelling, 2013, 46(46C): 65-73.

[2] CALABRESE J C, JORDAN D B, BOODHOO A, et al. Crystal structure of phenylalanine ammonia lyase: multiple helix dipoles implicated in catalysis.[J]. Biochemistry, 2004, 43(43): 11 403-11 416.

[3] WALKER K D, KLETTKE K, AKIYAMA T, et al. Cloning, heterologous expression, and characterization of a phenylalanine aminomutase involved in Taxol biosynthesis[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(52): 53 947-53 954.

[4] 周華, 朱祺, 楊艷芳, 等. 紅豆杉分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2014(4): 373-381.

[5] DUURSMA A, MINNAARD A，F(xiàn)ERINGA J, et al. Conversion of 1,4 adducts into versatile chiral building blocks[J] J. Am. Chem. Soc., 2003, 125: 3 700-3 701.

[6] HOOK D F, GESSIER F, NOTI C, et al. Probing the proteolytic stability of beta-peptides containing alpha-fluoro- and alpha-hydroxy-beta-amino acids[J]. Chembiochem, 2004, 5(5): 691-706.

[7] 曾偉川, 許瑞安, 曾慶友.β-氨基酸合成研究進(jìn)展[J]. 合成化學(xué), 2013, 21(5): 634-644.

[8] 李秀娟, 尹玲, 李秀珍, 等. 植酸酶畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2010, 26(3): 11-13, 27.

[9] SZYMANSKI W, WU Bian, WEINER B, et al. Phenylalanine Aminomutase-Catalyzed Addition of Ammonia to Substituted Cinnamic Acids: a Route to Enantiopureα- andβ-Amino Acids[J]. Journal of Organic Chemistry, 2009, 74(23): 9 152-9 157.

[10] WU Bian, SZYMANSKI W, WYBENGA G G, et al. Mechanism-inspired engineering of phenylalanine aminomutase for enhancedβ-regioselective asymmetric amination of cinnamates.[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2012, 51(2): 482-486.

[11] LEI Feng, WANNINAYAKE U, STROM S, et al. Mechanistic, mutational, and structural evaluation of a Taxus phenylalanine aminomutase[J]. Biochemistry, 2011, 50(14): 2 919-2 930.

[12] 韓秋敏. 比色法測(cè)定β-苯丙氨酸含量的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(35): 15 294-15 296.

[13] 牛廣財(cái), 閆公昕, 朱丹, 等. Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定沙棘酒中總多酚含量的工藝優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(4): 80-83, 142.

[14] RATNAYAKE N D,WANNINAYAKE U,GEIGE H, et al. Stcreochemistry and mechanism of a microbial phcnylalanine aminomutase[J]. J. Am. Chem. Soc., 2011, 133: 8 531-8 533.

Construction of recombinant E coli. of producingβ-phenylalanine aminomutase and optimization of fermentation conditions

GE FeiTANGYaoZHULong-baoLIYi-wenDUANZhen-chaoMAQi-senTAOYu-gui

(CollegeofBiologyandChemicalEngineering,AnhuiPolytechnicUniversity,Wuhu,Anhui241000,China)

The genetic engineering strain with recombinant plasmid pET-28a-pam was expressed inE.coliBL21. The fermentation conditions of initial pH, shaking speed, inoculation time and fermentation time were optimized with the PAM activity by using single factor. The results showed that the optimal fermentation conditions were initial pH 7.0, 200 r/min, the tenth hour broth and liquid volume 50 mL/500 mL, fermented for 24 h. Furthermore, the three factors were optimized by Box-Behnken design, and the results showed that inoculation time, initial pH and fermentation time are main affecting factors and their optimal levels are 12.8 h, 6.7 and 25.2 h. Under the optimal conditions, th activity of PAM reached 11.15 U/mL, improved by 128.9% compared with that under initial culture conditions.

RecombinantEcoli.; Enzyme production conditions;β-phenylalanine aminomutase; fermentation

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31671797)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2016A801)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201510363072)

葛飛(1978—)，男，安徽工程大學(xué)副教授，博士。 E-mail: gerrylin@126.com

2016-12-17

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.004