英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽酶解工藝的研究

高嘉唯,韓 晶,左豫虎,張洪微,崔素萍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),黑龍江大慶 163319)

英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽酶解工藝的研究

高嘉唯,韓 晶,左豫虎,張洪微,崔素萍*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),黑龍江大慶 163319)

以英國紅蕓豆為原料,研究蕓豆蛋白質(zhì)抗氧化活性肽的酶解工藝。首先以水解度和總抗氧化能力為評價指標進行酶的篩選,并采用單因素及正交實驗設(shè)計優(yōu)化酶解工藝。結(jié)果表明,堿性蛋白酶對蕓豆蛋白水解能力最強,酶解產(chǎn)物的抗氧化能力最高;最佳酶解條件為底物濃度5.0%,溫度55 ℃,加酶量4000 u/mL,pH10,時間2 h,該條件下總抗氧化能力高達186.97 U/mg pro,英國紅蕓豆活性肽顯示出較強的抗氧化活性。

蕓豆蛋白,堿性蛋白酶,酶解,抗氧化肽

蕓豆學(xué)名菜豆,是普通菜豆(如小黑蕓豆、小白蕓豆等)和多花菜豆(如圓奶華蕓豆 H、N、D、X 等)的總稱。蕓豆在世界的種植范圍比較廣泛,而且在我國的種植面積也比較大,產(chǎn)地主要分布在我國的東北、華北、西北和西南等地區(qū)[1]。其中英國紅蕓豆引自英國,粒色紫紅,其中還含有花色苷、皂苷等能提高人體非特異性免疫,增強抗病能力的有效成分,可激活淋巴T細胞,抑制腫瘤細胞生長,已受到醫(yī)學(xué)界的廣泛重視[2]。蕓豆蛋白含量20.29%～27.73%[3],氨基酸比例比較均衡[4]。

本質(zhì)上氧化是導(dǎo)致人類疾病和發(fā)病的主要原因之一。所有的細胞組分和特定的成分都易受到自由基的影響。經(jīng)過大量研究證明,抗氧化肽能夠起到清除自由基、螯合金屬離子等作用。用酶水解植物蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生具有抑制生物大分子過氧化或清除體內(nèi)自由基的抗氧化。 Atsushi Yokomizo等[5]以豆渣蛋白為原料得到了4種抗氧化肽。Kong等[6]對玉米醇溶蛋白進行酶解,得到具有顯著的還原能力和清除自由基能力的活性肽。周麗卿[7]對鷹嘴豆多肽的制備及其改性進行研究,結(jié)果表明堿性蛋白酶對鷹嘴豆的酶解最好。

到目前為止,對于以植物蛋白來源的抗氧化肽研究主要以大豆蛋白抗氧化肽為主,其次集中在鷹嘴豆[7],米糠[8],黑豆[9],玉米[10],大米[11],菜籽[12]等上。其中膠原肽、大豆肽、鷹嘴豆肽[13]等生物活性肽已經(jīng)成為食品科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的研究熱點,但還未見英國紅蕓豆活性肽的相關(guān)報道。因為英國紅蕓豆具有極高的營養(yǎng)和藥用價值,蕓豆蛋白質(zhì)的利用率還比較低,是一種潛在的植物蛋白質(zhì)資源[14]。因此本文選用英國紅蕓豆作為研究對象。

制備抗氧化肽的方法包括提取法、酶解法,發(fā)酵法、化學(xué)合成法等,由于酶解法反應(yīng)條件易于控制,操作簡單,可以獲得較多的抗氧化肽[15],所以選用生物酶解法制備蕓豆氧化活性肽。每種蛋白酶作用的位點不同,使得酶解液所表現(xiàn)的抗氧化能力也不同。本文以英國紅蕓豆蛋白質(zhì)為研究對象,選用六種單酶對蕓豆蛋白質(zhì)進行酶解,以總抗氧化能力為指標,篩選出使獲得的酶解液抗氧化能力最強的蛋白酶,并確定其最適酶解的條件,希望可以為蕓豆主栽品種的進一步研究提供基礎(chǔ),同時也希望可以為抗氧化肽添加到食品中提供初步的研究成果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

英國紅蕓豆 由黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院提供。

堿性蛋白酶(2.0×105u/g)、風(fēng)味蛋白酶(5000 u/g)、胰蛋白酶(250 u/g)、胃蛋白酶(1.2 u/g)、糜蛋白酶(2.0×105u/g) 北京鑫澤天佑生物科技有限公司;濃鹽酸、氫氧化鈉 為分析純級;總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;AB204-N型分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;Christ Alpha型冷凍干燥機 CHRIST公司;T6型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;PHS.2C型精密pH計 美國METTLER TOLEDO公司;SENCO恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 英國紅蕓豆蛋白質(zhì)的提取 參考Osborne[16]的方法對蕓豆蛋白質(zhì)進行提取。蕓豆精選、粉碎過篩(60目)得到蕓豆粉。蕓豆粉以1∶10(w/v)的料液比加蒸餾水,在50 ℃、pH9.0條件下恒溫攪拌提取1 h,然后3000 r/min離心20 min,沉淀物再以1∶8(w/v)比例加蒸餾水進行二次提取。合并2次離心后的上層蛋白液,室溫下用1.0 mol/L HCl調(diào)pH至4.4,4000 r/min離心15 min,超純水洗滌沉淀3次,冷凍干燥得到蕓豆蛋白質(zhì)。經(jīng)測定,以干基計算蕓豆蛋白質(zhì)含量,英國紅提取率為95.48%。

1.2.2 蕓豆抗氧化肽的酶解工藝 蕓豆蛋白→加水配制一定濃度→預(yù)處理(90 ℃,10 min)→用1.0 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH→水浴調(diào)溫→加一定量蛋白酶恒溫酶解一段時間→滅酶(90 ℃,10 min)→調(diào)pH至4.4→4000 r/min離心15 min→上清液→真空濃縮→冷凍干燥→蕓豆蛋白肽[17]。

1.2.3 制備英國紅蕓豆蛋白質(zhì)抗氧化肽酶的篩選 分別選用堿性蛋白酶(2.0×105U/g),風(fēng)味蛋白酶(5000 U/g),胰蛋白酶(250 U/g),胃蛋白酶(1.2 U/g),糜蛋白酶(2.0×105U/g),按各自的最適條件(見表1)及相同的底物濃度進行水解,測定酶解產(chǎn)物的總抗氧化能力。

表1 蛋白酶酶解英國紅蕓豆蛋白質(zhì)的條件Table 1 Conditions of British red kidney bean protein enzymatic hydrolysis

1.2.4 水解度的測定 英國紅蕓豆蛋白質(zhì)酶解水解度的測定采用pH-stat法[18]。稱取一定量的蕓豆蛋白粉配成一定濃度的蛋白質(zhì)溶液,在90 ℃下預(yù)處理15 min。調(diào)節(jié)溶液pH至各蛋白酶所需值,加入適量蛋白酶并放入恒溫水浴鍋中不斷攪拌,用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié),使溶液的pH維持不變,記錄反應(yīng)過程中消耗NaOH溶液的體積。水解度的公式如下:

式中,B為消耗的NaOH溶液的體積(mL);Nb為NaOH溶液的濃度(0.2 mol/L);Mp為底物中蛋白質(zhì)的質(zhì)量;htot為每克蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù),對于蕓豆蛋白質(zhì)來說,htot=7.72[19]。

1.2.5 總抗氧化能力的測定 使用總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒,按照試劑盒說明書進行操作。機體中有許多抗氧化物質(zhì),能使Fe3+還原成Fe2+,后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物,通過比色可測出其抗氧化能力的高低。計算公式如下:

1.2.6 最佳酶解條件的研究 單因素實驗中,以總抗氧化能力和水解度為指標,分別對蛋白酶進行水解溫度(℃)、pH、水解時間(h)及加酶量(u/mL)進行研究,再通過正交實驗,以總抗氧化能力為指標確定其最佳酶解條件。

1.2.6.1 最適溫度的確定 選用1.2.5中篩選出的蛋白酶,選擇酶解溫度分別為45、50、55、60、65 ℃的條件下進行酶解,其它酶解條件為:蕓豆蛋白溶液濃度為5%,酶解時間2 h,pH為8.5,加酶量為1000 u/mL,以總抗氧化能力和水解度為指標,確定該蛋白酶的最適溫度。

1.2.6.2 最適pH的確定 該蛋白酶在pH分別為11.0、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0條件下進行酶解,其它酶解條件為:蕓豆蛋白溶液濃度為5%,酶解時間2 h,酶解溫度為50 ℃,加酶量為1000 u/mL,以總抗氧化能力和水解度為指標,確定該蛋白酶的最適pH。

1.2.6.3 最佳酶解時間的確定 本研究選擇了酶解時間分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h進行酶解,其它酶解條件為:蕓豆蛋白溶液濃度為5%,酶解溫度為50 ℃,pH為8.5,加酶量為1000 u/mL,以總抗氧化能力和水解度為指標,確定該蛋白酶的最佳水解時間。

1.2.6.4 最適加酶量的確定 本研究選擇了加酶量分別為1000、2000、3000、4000、5000 u/mL進行酶解,其它酶解條件為:蕓豆蛋白溶液濃度為5%,酶解時間2 h,酶解溫度為50 ℃,pH為8.5,以總抗氧化能力和水解度為指標,確定該蛋白酶的最適加酶量。

表3 各蕓豆蛋白酶解物總抗氧化能力Table 3 Total antioxidant capacity of different kidney bean protease solution

注:a～j指在同一行的不同字母存在顯著性差異(p<0.05)。

1.2.6.5 正交實驗優(yōu)化蛋白酶的酶解條件

根據(jù)單因素實驗的實驗結(jié)果,本研究采取L9(43)正交表,每組實驗進行三次重復(fù),以總抗氧化能力為指標,進一步確定該蛋白酶的酶解條件見表2。

表2 堿性蛋白酶酶解蕓豆蛋白質(zhì)正交實驗的因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiments on hydrolysis of kidney bean protein isolates

1.2.6.6 驗證實驗 按照正交實驗得到的最優(yōu)水平組合進行操作,蕓豆蛋白溶液濃度為5%,測定總抗氧化能力,驗證最佳實驗條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解英國紅蕓豆蛋白的能力

不同蛋白酶酶解蕓豆蛋白,酶解液的總抗氧化能力見表3。

從表3中可以看出,堿性蛋白酶水解蕓豆蛋白質(zhì)所得水解液的總抗氧化能力最強,抗氧化值為167.83 U/mg pro。所以選用堿性蛋白酶進行后續(xù)的水解研究。

李艷紅[20]對鷹嘴豆蛋白酶解物的制備及其抗氧化肽進行研究,分別用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等在各自適宜的條件下對鷹嘴豆進行酶解,實驗結(jié)果表明堿性蛋白酶的酶解效果最好;王璇[20]對黑豆肽的制備及其抗氧化活性進行研究,選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶,根據(jù)水解度選取最佳的酶為堿性蛋白酶;這與本實驗選取堿性蛋白酶的結(jié)果相一致,但是也有很多學(xué)者的研究結(jié)果與本實驗不同,如郭延熙[22]采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶對米糠抗氧化肽酶解法的制備進行研究,結(jié)果表明酸性蛋白酶對米糠蛋白酶解的效果好。由于蛋白酶的酶切位點不同,使得水解后獲得的產(chǎn)物所對應(yīng)的各種能力存在差異,因此,學(xué)者們對蛋白質(zhì)酶解物制備可選取的蛋白酶的種類是多樣化的。

2.2 堿性蛋白酶的最佳酶解條件研究結(jié)果

2.2.1 最適溫度的確定 不同溫度對水解度和總抗氧化能力的影響如圖1所示。

圖1 不同溫度對水解度和總抗氧化能力的影響Fig.1 Effects of different temperatures on the degree of hydrolysis and total antioxidant capacity

溫度對酶解反應(yīng)的影響是多方面的,由圖1可知,在45～55 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的不斷升高,總抗氧化能力呈上升趨勢;在55～65 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的不斷升高,總抗氧化能力呈下降趨勢;在55 ℃時,總抗氧化能力最強,此時總抗氧化值為185.41 U/mg pro。在55 ℃以后,隨著溫度的增加,酶解產(chǎn)物的抗氧化能力降低了,可能是由于溫度升高造成堿性蛋白酶變性失活。由圖1還可以看出,蕓豆蛋白質(zhì)水解度隨溫度變化的趨勢與總抗氧化能力變化趨勢一致。在55 ℃時水解度最大,此時的水解度為18.42%。所以,最佳酶解溫度暫時選擇為55 ℃。

2.2.2 最適pH的確定 不同pH對水解度和總抗氧化能力的影響如圖2所示。

圖2 不同pH對水解度和總抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of different pH on the degree of hydrolysis and total antioxidant capacity

溶液的pH通過影響蛋白酶和酶分子及蛋白質(zhì)的分子的解離狀態(tài),從而影響蛋白酶的穩(wěn)定性、酶與蛋白質(zhì)底物的結(jié)合以及酶促反應(yīng)的進行[23]。由圖2可知,pH在8.0～9.5的范圍內(nèi),總抗氧化值隨pH的增大,呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢,pH在9.5～11.0的范圍內(nèi),總抗氧化值隨pH的增大,呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢,當(dāng)pH為9.5時,總抗氧化能力最強,此時總抗氧化值為189.10 U/mg pro。pH大于10以后,蛋白質(zhì)酶解液的抗氧化能力減弱,可能是由于pH過高使得蛋白酶的活性降低造成的。如圖2所示,在pH8.0～10.0范圍內(nèi),隨著pH的增大水解度逐漸增加,但是,當(dāng)pH超過10.0,水解度趨于平緩。水解度在pH達到10.0時,水解度最大。此時的水解度為23.90%。因此,酶解蕓豆蛋白的最適pH暫時選擇為9.5。

2.2.3 最佳水解時間的確定 不同水解時間對水解度和總抗氧化能力的影響見圖3。

圖3 不同水解時間對水解度和總抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of different time on the degree of hydrolysis and total antioxidant capacity

由圖3可知,在0.5～3.0 h之間,隨時間的延長,總抗氧化能力的值越來越大,在3.0～4.0 h的時間內(nèi),總抗氧化能力的值隨時間的延長逐漸減小,在3 h時,總抗氧化能力最強,此時總抗氧化值為180.86 U/mgpro。在3 h后,酶解液的總抗氧化能力減弱可能是因為具有抗氧化活性的肽段被繼續(xù)水解,從而使得總抗氧化能力下降。從圖3還可以看出,在3 h前水解度隨著時間的延長逐漸增加,在3 h后趨于平緩。水解度在3 h達到最大值此時水解度為19.84%。水解度與總抗氧化能力不相關(guān)。所以,暫時選擇最佳的水解時間為3 h。

2.2.4 最適加酶量的確定 不同加酶量對水解度和總抗氧化能力的影響,如圖4所示。

圖4 不同加酶量對水解度和總抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of different enzyme dosageon the degree of hydrolysis and total antioxidant capacity

由圖4可知,加酶量在1000～4000 U/mL時,總抗氧化能力隨著加酶量的增加而增大,加酶量在4000～5000 U/mL時,總抗氧化能力隨著加酶量的增加逐漸減小,在加酶量達到4000 U/mL時,總抗氧化能力最強,此時抗氧化值為171.65 U/mg pro?？赡苁怯捎谑|豆多肽片段隨加酶量的增加繼續(xù)斷裂,使得酶解液的總抗氧化能力減弱。由圖4看出,水解度隨著加酶量的增加而增大,水解度在加酶量為5000 U/mL時,達到最大值,此時水解度為19.33%。水解度與總抗氧化能力不相關(guān)。故選用加酶量為4000 U/mL。

2.2.5 正交實驗優(yōu)化蛋白酶的酶解條件 根據(jù)以上單因素的實驗結(jié)果選取正交實驗表,如表2所示。正交實驗結(jié)果見表4。

以總抗氧化能力為考察指標,通過極差分析得出,各因素對堿性蛋白酶酶解蕓豆蛋白的影響主次順序是A>C>B>D,即溫度>水解時間>溶液pH>加酶量。由表4可以得出堿性蛋白酶水解蕓豆蛋白質(zhì)的最優(yōu)組合為A2B3C1D2,即酶解溫度為55 ℃,溶液pH為10,水解時間為2.0 h,加酶量為4000 U/mL,此時的總抗氧化能力為187.42 U/mg pro。

表4 堿性蛋白酶酶解蕓豆蛋白質(zhì)正交實驗結(jié)果Table 4 The results of orthogonal experiments on hydrolysis of kidney bean protein isolates

2.2.6 驗證實驗 采用以上得出的堿性蛋白酶的最佳酶解條件,即酶解溫度為55 ℃,溶液pH為10,水解時間為2.0 h,加酶量為4000 U/mL進行驗證實驗。測得蕓豆蛋白酶解液的總抗氧化能力為186.97 U/mg pro,這與預(yù)測值187.42 U/mg pro誤差在±1.00 U/mg pro內(nèi),說明采用正交優(yōu)化得到的堿性蛋白酶酶解蕓豆蛋白質(zhì)的最佳酶解條件參數(shù)準確可靠。

3 結(jié)論

本文研究了英國紅蕓豆蛋白質(zhì)的酶解條件,分別對蛋白酶的選擇,以及對所選的蛋白酶進行單因素實驗和正交實驗確定其最佳的酶解條件的研究。

利用多種蛋白酶對蕓豆蛋白質(zhì)進行酶解,通過對總抗氧化能力的比較,結(jié)果顯示,堿性蛋白酶酶解蕓豆蛋白質(zhì)獲得的酶解液總抗氧化能力較強,所以選用堿性蛋白酶酶解英國紅蕓豆蛋白。

通過單因素實驗、正交實驗確定了堿性蛋白酶的酶解最佳條件為溫度為55 ℃,酶解時間為2.0 h,pH為10,蛋白質(zhì)溶液為5%時,加酶量為4000 U/mL,加酶量隨著蛋白質(zhì)溶液的濃度加大,按照相應(yīng)的比例增加。此時的總抗氧化能力高達186.97 U/mg pro。

[1]黨根友,馮佰利,高冬麗,等.不同蕓豆品種種子發(fā)育過程中貯藏蛋白積累研究[J].西北植物學(xué)報,2008,28(7):1366-1370.

[2]周大寨,朱玉昌,周毅鋒.蕓豆蛋白質(zhì)的提取及超濾分離研究[J].食品科學(xué),2008,29(8):386-390.

[3]柴巖,馮佰利,孫世賢.中國小雜糧品種[M].2007:1-20.

[4]Sathe S K. Dry bean protein functionality[J]. Critical Reviews in Biotechnology,2002,22(2):175-223.

[5]Atsushi Yokomizo,Yoko Takenaka,Tetsuo Takenaka. Antioxidative activity of peptides prepared from okara protein. Food Sci Technol Res,2002,8(4):357-359.

[6]Kong B H,Xiong Y L. Antioxidant activity of zein hydrolysates in a Liposome system and the possible mode of action[J]. J. Agric. Food Chem,2006,54(16):6059-6068.

[7]周麗卿. 鷹嘴豆多肽的制備及其改性研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.

[8]呂飛,許宙,程云飛.米糠蛋白質(zhì)提取及應(yīng)用研究進展[J]. 食品與機械,2014,30(3):234-238.

[9]王璇. 黑豆肽的制備及其抗氧化活性的研究[D].鄭州:河南工業(yè)大學(xué),2012.

[10]石麗梅,唐學(xué)燕,何志勇,等.玉米抗氧化肽對于中式香腸的氧化穩(wěn)定性的影響[J].食品科技,2008,(10):135-138.

[11]賈俊強,馬海樂,曲文娟,等.超聲預(yù)處理大米蛋白制備抗氧化肽[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2008,24(8):288-293.

[12]劉清,謝奇珍,師建芳.菜籽蛋白活性肽研究[J].糧食與油脂,2008(3):4-6.

[13]裴小平,唐道邦,肖更生,等.抗氧化肽制備的應(yīng)用現(xiàn)狀及趨勢[J].食品工業(yè)科技,2009,30(2):319-322.

[14]張昊,任發(fā)政.天然抗氧化肽的研究進展[J].食品科學(xué),2008,29(4):443-447.

[15]張洪利,康大力.抗氧化肽的研究進展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(2):660-661.

[16]呂飛,許宙,程云飛.米糠蛋白質(zhì)提取及應(yīng)用研究進展[J]. 食品與機械,2014,30(3):234-238.

[17]李峰,潘瑤,陳奇.大豆活性肽酶解制備的工藝條件研究[J].食品科學(xué),2010,31(10):69-74.

[18]陳毓荃.生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)[M].北京科學(xué)出版社,2002:10-12.

[19]任海偉,朱冬梅,王玉麗,等. 蕓豆肽抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué),2010,31(21):105-109.

[20]李艷紅. 鷹嘴豆蛋白酶解物的制備及其抗氧化肽的研究[D].無錫:江南大學(xué),2008.

[21]王璇. 黑豆肽的制備及其抗氧化活性的研究[D].鄭州:河南工業(yè)大學(xué),2012.

[22]郭延熙.米糠抗氧化肽的酶法制備及其特性的研究[D]. 長沙:中南林業(yè)科技大學(xué),2013.

[23]姜錫瑞.酶制劑應(yīng)用手冊[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999:232-241.

Research of enzymolysis technology of the British red kidney bean protein antioxidant peptide

GAO Jia-wei,HAN Jing,ZUO Yu-hu,ZHANG Hong-wei,CUI Su-ping*

(Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

Study of enzymolysis technology of kidney bean protein antioxidative peptide with the British red kidney beans as raw material.First of all,the degree of hydrolysis and total antioxidant capacity as evaluation index for screening of enzyme.alkaline protease was selected from six different enzymes by single factor and orthogonal design.The results showed that the kidney bean protein could be effective hydrolyzed by the alkaline protease and the highest antioxidant capacity of enzymolysis products.The optimal conditions were substrate concentration of 5.0%(w/v),enzyme concentration of 4000 u/mL,pH10,temperature of 55 ℃,hydrolyzing time of 2 h,under this condition of the total antioxidant capacity to 186.97 U/mgpro. British red kidney beans peptide showed strong antioxidant activity.

kidney bean protein(KBP);alkaline pro-tease;enzymatic hydrolysis;antioxidant peptide

2016-08-26

高嘉唯(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:xialedi@163.com。

*通訊作者:崔素萍(1968-)，女，博士，教授，從事食品生物化學(xué)和分子生物學(xué)的教學(xué)與科研工作，E-mail:cuisup@163.com。

黑龍江省農(nóng)墾總局科技局項目(HNK125B-13-03)；黑龍江省教育廳項目(JG2012010458)。

TS209.1

B

:1002-0306(2017)03-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.036