基于高通量測(cè)序分析海帶表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

孫丕海,錢(qián)坤,李曉麗,楊志平,丁鑒鋒,孫雪瑩,馬悅欣

(1.大連海洋大學(xué)海珍品苗種培育基地,遼寧大連116023;2.大連金普新區(qū)海洋與漁業(yè)局,遼寧大連116100;3.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;4.大連匯新鈦設(shè)備開(kāi)發(fā)有限公司,遼寧大連116039)

基于高通量測(cè)序分析海帶表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

孫丕海1,錢(qián)坤2,李曉麗3,楊志平4,丁鑒鋒3,孫雪瑩3,馬悅欣3

(1.大連海洋大學(xué)海珍品苗種培育基地,遼寧大連116023;2.大連金普新區(qū)海洋與漁業(yè)局,遼寧大連116100;3.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;4.大連匯新鈦設(shè)備開(kāi)發(fā)有限公司,遼寧大連116039)

為研究大連登沙河灣和正明寺海帶養(yǎng)殖區(qū)海帶Saccharina japonica表面及其周?chē)Ｓ蚝Ｋ募?xì)菌群落結(jié)構(gòu),分別于2015年1月、2月和4月,采用Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣本基因組DNA 的16S rRNA基因V3～V4區(qū)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明:從兩個(gè)海區(qū)健康海帶和海水中獲得優(yōu)化序列分別為130 158條和124 658條,海帶序列可歸為8個(gè)門(mén)和99個(gè)屬,海水序列可歸為14個(gè)門(mén)和135個(gè)屬;在門(mén)水平,海帶首要優(yōu)勢(shì)門(mén)為厚壁菌門(mén) (＞69%),其次為變形菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén) (＞1%),海水首要優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén) (＞46%),其次為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)和放線菌門(mén) (＞1%);在屬水平,海帶主要優(yōu)勢(shì)屬為乳球菌屬 (＞40%)和芽孢桿菌屬 (＞10%),其次為 Solibacillus、假單胞菌屬和節(jié)桿菌屬 (＞3%),海水首要優(yōu)勢(shì)屬為弧菌屬 (21.58%)和乳球菌屬 (28.29%),其次為科爾韋爾氏菌屬、弓形桿菌屬和亞硫酸桿菌屬 (＞2%)。研究表明,兩個(gè)海區(qū)海帶細(xì)菌群落組成相似,海帶和海水細(xì)菌群落組成則明顯不同。

海帶;細(xì)菌群落;高通量測(cè)序

海帶 Saccharina japonica(原名 Laminaria japonica)[1]隸屬于褐藻門(mén)、褐子綱、海帶目、海帶科、海帶屬,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,并廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等方面,是大連沿海海域大規(guī)模栽培的主要藻類(lèi)之一。研究人員曾使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)海帶表面細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定[2-4]。Balakirev 等[5]通過(guò)克隆文庫(kù)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),太平洋西北地區(qū)廣泛分布的海帶典型種 (TYP)及其常見(jiàn)形態(tài)變種 (LON和SHA)的共生微生物群落存在顯著差異,認(rèn)為宿主-共生體相互作用可導(dǎo)致高遺傳相似性形式 (TYP和LON)表型不同,細(xì)菌共生體可作為區(qū)分遺傳相似藻類(lèi)形式的敏感標(biāo)記。而假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas、弧菌屬Vibrio和鹽單胞菌屬Halomonas可使海帶發(fā)生病害[6-9]。Bengtsson等[10]首次使用高通量測(cè)序技術(shù),研究了Laminaria hyperborea表面細(xì)菌多樣性與次級(jí)生產(chǎn)力的關(guān)系。但有關(guān)海帶表面細(xì)菌群落的研究仍然較少。本試驗(yàn)中采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了大連登沙河灣和正明寺養(yǎng)殖區(qū)健康海帶表面和海水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),旨在為了解細(xì)菌與海帶間的相互作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

分別于2015年1月、2月和4月從大連登沙河灣和正明寺養(yǎng)殖區(qū)采集健康海帶孢子體和海水。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 剪取海帶葉片生長(zhǎng)點(diǎn)附近葉片約10 g,經(jīng)無(wú)菌海水沖洗3次,用無(wú)菌自封袋封裝。海水樣品經(jīng)0.22 μm孔徑的濾膜抽濾,將濾膜及海帶樣品置于冰盒,郵寄美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行檢測(cè),送樣24 h內(nèi),用1 L無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗樣品海帶,將濾液通過(guò)0.02 mm孔徑的濾膜過(guò)濾。

1.2.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增 依據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟用E.Z.N.A.?water DNA試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross,GA,USA)提取海帶及水體 (過(guò)膜后樣本)的總DNA,細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4片段的擴(kuò)增引物為338F(5′barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCA 3′)和806R(5′GGACTACHVGGG-TWTCTAAT 3′)[11-12]。PCR反應(yīng)體系 (共20 μL): 5×FastPfu緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,上、下游引物各0.8 μL(5 μmol/L),FastPfu聚合酶0.4 μL,模板DNA 10 ng,用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃下預(yù)變性3 min;95℃下變性30 s,55℃下退火30 s,72℃下延伸45 s,共進(jìn)行27個(gè)循環(huán),最后在72℃下再延伸10 min。每個(gè)PCR樣本設(shè)置3個(gè)平行,所得產(chǎn)物混合后經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 (AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.2.3 Illumina MiSeq測(cè)序及序列處理 將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) (Promega公司)進(jìn)行DNA定量,之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合,按標(biāo)準(zhǔn)流程Illumina Miseq PE300測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Trimmomatic和FLASH軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化,過(guò)濾序列尾部質(zhì)量值20以下的堿基,拼接序列的重疊區(qū)錯(cuò)配比率低于0.2,barcode錯(cuò)配數(shù)為0,最大引物錯(cuò)配數(shù)為2的優(yōu)化序列用于后續(xù)分析。將序列按照97%相似性進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類(lèi)[13],在聚類(lèi)過(guò)程中去除UCHIME嵌合體[14],得到 OTU的代表序列,與Silva數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.arb-silva.de)[15]進(jìn)行比對(duì),采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析[16](http://sourceforge.net/ projects/rdp-classifier/),置信度閾值為0.7。使用Mothur 1.30.1軟件 (http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)進(jìn)行rarefaction分析和單樣本α多樣性指數(shù)分析,包括Coverage、Ace、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)。使用Qiime軟件計(jì)算beta多樣性距離矩陣,進(jìn)行層次聚類(lèi)分析[17],使用非加權(quán)組平均法UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)算法構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu),比較樣本間細(xì)菌群落差異。利用R語(yǔ)言工具制作稀釋曲線圖、文氏圖、群落結(jié)構(gòu)組分圖和多樣本相似性樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)海區(qū)海帶及海水細(xì)菌群落組成

將3個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)序數(shù)據(jù)合并分析,從大連登沙河和正明寺兩個(gè)海區(qū)海帶和海水中共獲得254 816條優(yōu)化序列。所有序列可歸為531個(gè)OTUs。海帶序列可歸為8個(gè)門(mén)、17個(gè)綱、37個(gè)目、63個(gè)科、99個(gè)屬;海水序列可歸為14個(gè)門(mén)、23個(gè)綱、44個(gè)目、78個(gè)科、135個(gè)屬。

海帶和海水門(mén)水平細(xì)菌群落組成如圖1所示。從圖1可見(jiàn):海帶首要優(yōu)勢(shì)門(mén)為厚壁菌門(mén)Finnicutes,其在大連登沙河灣養(yǎng)殖區(qū)和正明寺養(yǎng)殖區(qū)所占比例分別為 69.25% (HBS)和 83.37% (HFS);次優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén)Proteobacteria、藍(lán)細(xì)菌門(mén)Cyanobacteria、放線菌門(mén)Actinobacteria和擬桿菌門(mén)Bacteroidetes。海水第一優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén),其在兩個(gè)海區(qū)所占比例分別為67.88% (HWB) 和46.39%(HWF);厚壁菌門(mén)在HWF中為第二優(yōu)勢(shì)門(mén),其比例為38.39%,而在HWB中比例為9.52%;其他次優(yōu)勢(shì)門(mén)為擬桿菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、放線菌門(mén)和疣微菌門(mén)Verrucomicrobia。

海帶和海水綱水平細(xì)菌群落組成如圖2所示。從圖2可見(jiàn):海帶首要優(yōu)勢(shì)綱為芽孢桿菌綱Bacilli,其在兩個(gè)海區(qū)所占比例分別為69.10%(HBS) 和83.03%(HFS);次優(yōu)勢(shì)綱包括藍(lán)細(xì)菌綱、γ-變形菌綱 γ-Proteobacteria、α-變形菌綱α-Proteobacteria、放線菌綱 Actinobacteria和黃桿菌綱Flavobacteriia。海水HWB中第一優(yōu)勢(shì)綱為γ-變形菌綱 (40.72%),γ-變形菌綱在HWF中為第二優(yōu)勢(shì)綱 (23.22%);HWF中第一優(yōu)勢(shì)綱為芽孢桿菌綱 (38.13%),在HWB中芽孢桿菌綱所占比例為9.51%;HWB和HWF的其余次優(yōu)勢(shì)綱包括α-變形菌綱、黃桿菌綱、藍(lán)細(xì)菌綱、ε-變形菌綱ε-Proteobacteria、δ-變形菌綱δ-Proteobacteria、β-變形菌綱β-Proteobacteria、放線菌綱、酸微菌綱Acidimicrobiia和噬纖維菌綱Cytophagia。

海帶和海水屬水平細(xì)菌群落組成如圖3所示。從圖3可見(jiàn):HBS和HFS中主要優(yōu)勢(shì)屬為乳球菌屬Lactococcus(43.61%、53.46%)和芽孢桿菌屬Bacillus(11.19%、12.58%),次優(yōu)勢(shì)屬包括Solibacillus、假單胞菌屬 Pseudomonas、節(jié)桿菌屬 Arthrobacter、芽孢八疊球菌屬Sporosarcina、鏈球菌屬Streptococcus、Lysinibacillus、乳桿菌屬Lactobacillus、Loktanella和肉桿菌屬 Carnobacterium。HWB中首要優(yōu)勢(shì)屬為弧菌屬 Vibrio(21.58%),弧菌屬在HWF中的比例為6.22%,HWF中首要優(yōu)勢(shì)屬為乳球菌屬 (28.29%),所占比例為6.69%;HWB和HWF中次優(yōu)勢(shì)屬包括科爾韋爾氏菌屬Colwellia、弓形桿菌屬Arcobacter、亞硫酸桿菌屬Sulfitobacter、芽孢桿菌屬、Loktanella、假交替單胞菌屬Pseudo-alteromonas、Owenweeksia、Ulvibacter、馬賽菌屬M(fèi)assilia、極地桿菌屬Polaribacter和Bacteriovorax。

圖1 兩個(gè)海區(qū)海帶及海水門(mén)水平細(xì)菌群落組成Fig.1 Bacterial communities in kelp and seawater in two sea areas at phylum level

2.2 海帶和海水細(xì)菌群落豐度和多樣性估計(jì)

海帶和海水優(yōu)化序列數(shù)量如表1所示,其中HBS序列66 812條,HFS序列63 346條,HWB序列62 807條,HWF序列61 851條。HBS和HFS的樣本OTU分別是220和198個(gè),而HWB和HWF的樣本OTU數(shù)量高于海帶,分別為408和435個(gè)。在OTU水平上生成的4個(gè)樣品稀釋曲線(圖4)皆接近平坦,表明測(cè)序深度足夠反映樣本的多樣性。通過(guò)Chao和Ace指數(shù)可估計(jì)海帶和海水群落豐度,通過(guò)Shannon和Simpson指數(shù)可估計(jì)樣本群落多樣性。從表1可見(jiàn),HBS和HFS群落豐度指數(shù)Chao和Ace為211～249,HWB和HWF的群落豐度指數(shù)Chao和Ace為415～451,表明海水(HWB和HWF)群落豐度高于海帶 (HBS和HFS)。同樣,Shannon和Simpson群落多樣性指數(shù)表明,海水群落多樣性也高于海帶。

圖3 兩個(gè)海區(qū)海帶及海水屬水平細(xì)菌群落組成Fig.3 Bacterial communities in kelp and seawater in two sea areas at genus level

圖4 兩個(gè)海區(qū)海帶及海水細(xì)菌群落稀釋曲線Fig.4 Dilution curve of bacterial communities in kelp and seawater in two sea areas

2.3 海帶和海水的細(xì)菌群落比較

圖5 兩個(gè)海區(qū)海帶及海水OTUs組成文氏圖Fig.5 Venn diagram of OTUs shared in kelp and seawater in two sea areas

海帶及海水樣本所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目見(jiàn)文氏圖 (圖5),HBS與HFS共有OTUs為153, Cyanobacteria_norank占其總 OTU的 57.74%, HWB與HWF共有OTUs為380,占其總OTU的82.07%。HBS與HWB共有OTUs為149,占其總OTU的31.11%,HFS與HWF共有OTUs為137,占其總OTU的27.62%,海帶 (HBS+HFS)與海水(HWB+HWF)共有OTUs為197,占總OTU (HBS+HFS+HWB+HWF)的37.10%。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,HBS與HFS聚為一支,HWB與HWF聚為另一支 (圖6)。文氏圖和聚類(lèi)分析結(jié)果均表明,兩個(gè)海區(qū)海帶之間細(xì)菌群落相似,海水之間細(xì)菌群落也相似;同一海區(qū)/兩個(gè)海區(qū)的海帶與海水之間細(xì)菌群落則存在明顯差異。

圖6 兩個(gè)海區(qū)海帶及海水OTU水平相似樹(shù)Fig.6 Similarity dendrogram of the OTU level betweenkelp and seawater in two sea areas

表1 兩個(gè)海區(qū)海帶及海水細(xì)菌群落豐富度及多樣性指數(shù)Tab.1 Richness and diversity indices of bacterial communities in kelp and seawater in two sea areas

3 討論

3.1 海帶細(xì)菌群落組成分析

高通量測(cè)序結(jié)果顯示,大連海區(qū)海帶細(xì)菌群落包括8個(gè)門(mén),即厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、浮霉菌門(mén)Planctomycetes和Armatimonadetes,研究人員通過(guò)培養(yǎng)方法和克隆文庫(kù)發(fā)現(xiàn),海帶細(xì)菌群落由變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén) (CFB群)、放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)組成[2-5,18]。從海帶屬的其他種如 Laminaria hyperborea細(xì)菌群落可檢測(cè)出除Armatimonadetes之外的7個(gè)門(mén) (通過(guò)培養(yǎng)方法、變性梯度凝膠電泳、克隆文庫(kù)、熒光原位雜交和高通量測(cè)序等方法檢測(cè))[9,19-21],從細(xì)布海帶Laminaria religiosa檢測(cè)的細(xì)菌群落為變形菌門(mén) (通過(guò)培養(yǎng)方法檢測(cè))[22],從Laminaria longicruris細(xì)菌群落檢出變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén) (通過(guò)培養(yǎng)方法檢測(cè))[23],Laminaria digitata附生細(xì)菌群落由變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)組成 (通過(guò)全細(xì)胞光譜方法檢測(cè))[24],Laminaria saccharina細(xì)菌群落也可歸為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)(通過(guò)培養(yǎng)方法和克隆文庫(kù)方法檢測(cè))[25-26]。

在綱水平,從健康海帶檢測(cè)出17個(gè)綱,包括優(yōu)勢(shì)綱6個(gè) (圖2)。其中,γ-變形菌綱、β-變形菌綱、放線菌綱、芽孢桿菌綱和黃桿菌綱為已報(bào)道海帶相關(guān)細(xì)菌群落成員[2-5,18,27]。從細(xì)布海帶可分離出 γ-變形菌綱和 β-變形菌綱細(xì)菌[22],從L.longicruris分離出 γ-變形菌綱和黃桿菌綱細(xì)菌[23],從L.digitata檢測(cè)出放線菌綱、γ-變形菌綱、α-變形菌綱和黃桿菌綱細(xì)菌[24],從L.saccharina檢測(cè)出α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、ε-變形菌綱、放線菌綱、黃桿菌綱和芽孢桿菌綱細(xì)菌[25-26],從L.hyperborea檢測(cè)出α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、藍(lán)細(xì)菌綱、芽孢桿菌綱和放線菌綱細(xì)菌[9,19-21]。

在屬水平,從健康海帶中共發(fā)現(xiàn)99個(gè)屬的細(xì)菌,包括優(yōu)勢(shì)屬12個(gè) (圖5)。其中,Arenicella、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬Corynebacterium、黃桿菌屬Flavobacterium、Granulosicoccus、假交替單胞菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、嗜冷單胞菌屬Psychromonas、葡萄球菌屬Staphylococcus和弧菌屬為已報(bào)道海帶相關(guān)細(xì)菌群落成員[2-5,18,27]。 從L.longicruris分離出黃桿菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬細(xì)菌[23]。從L.digitata檢測(cè)出節(jié)桿菌屬、副球菌屬Paracoccus、假交替單胞菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌[24],從L.saccharina中發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、假交替單胞菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬 Sphingomonas、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、亞硫酸桿菌屬和弧菌屬細(xì)菌[26], 從L.hyperborea中分離出芽孢桿菌屬、Granulosicoccus和Loktanella細(xì)菌[21]。

本研究中首次發(fā)現(xiàn)海帶細(xì)菌群落成員:Armatimonadetes、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、浮霉菌門(mén) Planctomycetes和疣微菌門(mén);酸微菌綱、α-變形菌綱、擬桿菌綱Bacteroidia、梭菌綱Clostridia、藍(lán)細(xì)菌綱、噬纖維菌綱、δ-變形菌綱、ε-變形菌綱、Negativicutes、Phycisphaerae、Sphingobacteriia和疣微菌綱 Verru-comicrobiae;優(yōu)勢(shì)屬乳球菌屬、Solibacillus、節(jié)桿菌屬、芽孢八疊球菌屬、鏈球菌屬、Lysinibacillus、乳桿菌屬、Loktanella和肉桿菌屬。本研究結(jié)果擴(kuò)展了人們對(duì)海帶表面微生物群落的認(rèn)識(shí)。

海帶表面相關(guān)細(xì)菌組成有多方面的功能,有的是潛在的抗菌資源,如一種芽孢桿菌、一種假單胞菌和一種黃桿菌Flavobacterium sp.具有抗微生物活力[28];有的可促進(jìn)植物生長(zhǎng),如 Pseudoalteromonas porphyrae MMM18菌株可提高蘿卜、小麥、大豆、燕麥、豌豆和白菜種子的發(fā)芽率和芽長(zhǎng)[18];但有些細(xì)菌對(duì)宿主是有害的,如Pseudoalteromonas bacteriolytica[7]和P.elyakovii[8]分別是海帶紅點(diǎn)病和葉斑點(diǎn)傷病害的病原菌。7株假交替單胞菌屬和4株弧菌屬細(xì)菌可能是海帶孔爛病的潛在病原[9]。本研究從海帶中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、假交替單胞菌屬和弧菌屬,其生態(tài)作用及其與宿主的相互作用有待于進(jìn)一步研究。

3.2 海帶和海水細(xì)菌群落比較

本試驗(yàn)中海帶養(yǎng)殖區(qū)海水中的細(xì)菌群落主要由變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)和放線菌門(mén)組成 (圖1)。這些門(mén)也分布在其他海藻生長(zhǎng)海域水體中,如L.saccharina生長(zhǎng)海域水體中的細(xì)菌屬于變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)[25]。澳洲石莼生長(zhǎng)海域水體中優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén),而藍(lán)細(xì)菌門(mén)和厚壁菌門(mén)豐度較低。在屬和OTU水平上海帶細(xì)菌群落與其周?chē)Ｋ募?xì)菌群落明顯不同 (圖3～圖5)。這一結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果類(lèi)似[20,25,29]。L.saccharina和海水細(xì)菌群落的DGGE條帶圖譜明顯不同,相似性僅為20%[14]。L.hyperborea表面生物膜與其周?chē)Ｋ?xì)菌群落重疊較少[20]。在門(mén)水平澳洲石莼附生細(xì)菌群落與其周?chē)Ｋ?xì)菌群落類(lèi)似,而種水平兩細(xì)菌群落則明顯不同[29]。其原因可能是兩種環(huán)境的物理差異引起群落組成有差異。海帶上細(xì)菌的可能來(lái)源之一是其周?chē)暮Ｋ?因此,海帶表面的細(xì)菌可能是通過(guò)選擇過(guò)程從海水較少的細(xì)菌種群中吸收或經(jīng)表面直接接觸細(xì)菌所致[20]。

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Characterization of bacterial community structure on surface of kelp Saccharina japonica by high-throughput sequencing

SUN Pi-hai1,QIAN Kun2,LI Xiao-li3,YANG Zhi-ping4,DING Jian-feng3,SUN Xue-ying3,MA Yue-xin3
(1.Seafood Seedling Breeding Base,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Dalian Jinzhou District Oceanic and Fishery Administration, Dalian 116100,China;3.Key Laboratory of Mariculture and Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;4.Dalian Huixin Titanium Equipment Development Company Limited,Dalian 116039,China)

The genomic DNA was extracted from surface bacteria sampled from healthy kelp Saccharina japonica and surrounding seawater in the sea areas of Dengshahe bay and Zhengmingsi in Dalian in January,February and March of 2015,and a gene segment from the V3-V4 portion of the 16S rRNA gene was sequenced using Illumina Miseq PE300 high-throughput sequencing platform to examine the bacterial community on the surface of the kelp in two sea areas in coastal Dalian.A total of 130 158 and 124 658 optimized sequences were obtained from the kelp and seawater,respectively.Sequences from kelp were classified into 8 phyla and 99 genera,and sequences from seawater were identified as 14 phyla and 135 genera using 16S rRNA gene database.In the kelp community,phylum Firmicutes(＞69%)was predominantly observed,followed by Proteobacteria,Cyanobacteria,Actinobacteria and Bacteroidetes(＞1%).In seawater community,Proteobacteria(＞46%)was most abundant,followed by Firmicutes,Bacteroidetes,Cyanobacteria and Actinobacteria.At genus level,Lactococcus(＞40%)andBacillus(＞10%)were dominant kelp members,followed by Solibacillus,Pseudomonas and Arthrobacter(＞3%),while Vibrio(21.58%)and Lactococcus(28.29%)were the dominant members in seawater from Dengshahe bay and Zhengmingsi,respectively,followed by Colwellia,Arcobacter and Sulfitobacter(＞2%).Dendrogram of hierarchical cluster analysis revealed that there were similar bacterial communities in the two sea areas,and different bacterial communities between the seawater and kelp surface.

Saccharina japonica;bacterial community;high-throughput sequencing

Q939.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.002

2095-1388(2017)01-0007-06

2016-09-22

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (2015020800);大連市金州新區(qū)海洋與漁業(yè)局項(xiàng)目 (2014115,2014118)

孫丕海 (1959—),男,高級(jí)工程師。E-mail:dlsph@aliyun.com

馬悅欣 (1963—),女,博士,教授。E-mail:mayuexin@dlou.edu.cn