雷公藤抗氧化酶對福木假尾孢菌毒素侵染的響應(yīng)

張祖權(quán)

（福建省沙縣水南國有林場，福建 沙縣 365050）

雷公藤(Tripterygium Wilfordii)是一種著名中藥，又叫黃藤、黃臘藤、菜蟲藥、紅藥、水莽草，為衛(wèi)矛科植物，主產(chǎn)于福建、浙江、安徽、河南等地。原植物生于背陰多濕的山坡、山谷、溪邊灌木叢中，喜較為陰涼的山坡，以偏酸性、肥沃、土層深厚的砂質(zhì)土或黃壤土最宜生長，已有幾百年的入藥記錄[1,2]?，F(xiàn)代臨床及藥理學(xué)研究表明，雷公藤具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗生育等作用[3-7]，為臨床治療類風(fēng)濕或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常用中藥。

然而，雷公藤藥用成分含量極低，加之野生資源蘊(yùn)藏量少，人工栽培又存在生長緩慢、收獲期長的問題，無法滿足市場需求，成為中國珍貴緊缺中藥材。因此，加快對雷公藤的開發(fā)與利用已經(jīng)成為當(dāng)前生產(chǎn)亟需解決的問題。由于雷公藤野生資源的缺乏，大面積推廣種植雷公藤，使得原本在野生資源中就普遍存在的病害——雷公藤角斑病更加猖獗，致使大量葉片提前脫落，給農(nóng)戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然近年來國內(nèi)外學(xué)者對雷公藤做了大量的研究[13-14]，但對于角斑病的研究卻非常少，劉錫琎等[15]在湖南長沙的雷公藤病葉上發(fā)現(xiàn)一種致病菌福木假尾孢（Pseudocercospora elaeodendri），但目前對雷公藤抗福木假尾孢菌毒素侵染的研究還比較匱乏。

在病原菌或致病因子等外界脅迫條件下，植物往往啟動一些防御反應(yīng)酶。其中POD廣泛分布于植物體內(nèi)，它可以催化植物體內(nèi)許多化合物如脂肪酸、酚類物質(zhì)等的氧化反應(yīng)，同時還參與乙烯的生物合成等生理活動[16]。因此，POD活性的變化關(guān)系到植物體內(nèi)其它生理生化反應(yīng)的變化。有研究結(jié)果表明，POD的活性與植物抗病性呈正相關(guān)，即POD的活性越高，植物的抗病性越強(qiáng)[17-18]。且POD與SOD共同組成細(xì)胞內(nèi)清除活性氧傷害的保護(hù)酶系統(tǒng)，在阻止或減少羥基自由基形成方面起重要作用。有鑒于此，本研究通過測定在福木假尾孢菌毒素中培養(yǎng)不同時間的雷公藤幼梢健康葉片SOD、POD的活性變化，觀察植物組織中保護(hù)酶抵抗毒素的過程，為雷公藤進(jìn)一步的開發(fā)與利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

試驗所用的雷公藤材料取材于三明市泰寧縣林業(yè)局泰寧縣杉陽公司，通過扦插移植于福建農(nóng)林大學(xué)田間實驗室。取福建農(nóng)林大學(xué)田間實驗室剛長出的幼嫩雷公藤枝條若干，通過培養(yǎng)取其葉片待用。

取福建農(nóng)林大學(xué)田間實驗室中培養(yǎng)的帶病雷公藤植株的病葉，通過分離及進(jìn)一步純化得到福木假尾孢菌。

1.2 研究方法

1.2.1 雷公藤假尾孢菌毒素培養(yǎng)與含毒濾液的提取

將福木假尾孢菌菌種接種到PSA培養(yǎng)基上，29℃培養(yǎng)15 d，轉(zhuǎn)入查彼培養(yǎng)液中，每瓶接7個菌餅（直徑為6 mm）。在恒溫29℃的搖床中暗培養(yǎng)25 d。將所得菌液先用雙層紗布過濾，再用雙層濾紙過濾，濾液5 000 r/min下離心18min，上清液即為含毒濾液。將含毒濾液在45℃低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為原體積的1/10，在5 000 r/min下離心18min，取上清液，進(jìn)行無菌過濾，得到的即為雷公藤假尾孢菌的粗毒素。

1.2.2 取樣

將雷公藤幼梢插入裝有60 mL毒素液的廣口瓶中，使基部約3 cm浸在提取的毒素液中，每瓶放置10苗，每處理重復(fù)3次，并以清水為對照。處理的枝條置于室溫（23±5℃）下觀察。經(jīng)毒素處理后，分別于12、24、36、48、60 h取枝條上的葉片進(jìn)行測定。

1.2.3 酶液提取

稱取0.5 g雷公藤葉片，放入冰浴的研缽中，加入預(yù)冷 （4℃）POD提取介質(zhì)0.05 mol/L pH值 7.0的PBS（磷酸緩沖液）5 mL（先加3 mL，再加1 mL沖洗，最后再用1mL沖洗，沖洗液一并轉(zhuǎn)入離心管中）。將雷公藤葉片研磨成勻漿，在12 000 r/min，4℃下離心15min，取上清液備用。

1.2.4 SOD活性的測定

依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。3mL反應(yīng)混合液含有：2.0 μmol·L-1核黃素、75 μmol·L-1NBT、10 μmol·L-1EDTA-Na2、13mmol·L-1甲硫氨酸 （Met）、0.05mol·L-1pH值7.8磷酸緩沖液。加適量酶液后在4 000 lx下反應(yīng)10min，并在560 nm下測定光密度，以緩沖液代替酶液作空白，SOD以抑制NBT光化還原50%為一個酶單位。以每分鐘抑制NBT為氧化還原50%酶用量為一個酶活性單位：SOD 總活性＝（Ack-A）Vt/（0.5 AckWVt），其中Ack為照光對照管的吸光度，A樣品管的吸光度，V為樣品液總體積，Vt為測定時樣品用量，W為樣品鮮重。

1.2.5 POD活性的測定

過氧化物酶廣泛存在于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在的條件下，過氧化物酶可以使愈創(chuàng)木酚氧化，產(chǎn)生茶褐色物質(zhì)，在470 nm處有最大吸收峰，可根據(jù)單位時間內(nèi)A470的變化值，計算POD活性大小。

取10 uL酶液，加入1mL 0.1M pH值6.0的PBS和3mL POD反應(yīng)混合液，立即于470 nm處比色，每隔一分鐘記錄一次吸光度值，共測3次。按POD活性=（⊿A470×酶液總體積）/（測定時取酶液的量×樣品鮮重×反應(yīng)時間）計算酶的相對活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒素粗提取物處理對雷公藤體內(nèi)SOD活性的影響

從圖1中我們可以看出兩條曲線都是呈先增后降的變化趨勢，毒素處理24 h后SOD活性極顯著高于對照21%，首先達(dá)到了高峰。且24 h以前毒素處理的雷公藤SOD活性升高的速度也明顯大于對照。但24 h以后，毒素對SOD抑制作用加強(qiáng)。SOD活性下降，但48 h后酶活性又開始回升，到60 h的酶活性值高于初始值10%，比對照高出22%。這表明雷公藤受毒素侵染后植物機(jī)體首先表現(xiàn)出抵抗的效果，酶活性升高，但可能由于毒素毒性過強(qiáng)，難以抵制，活性逐步下降，但隨著機(jī)體SOD大量表達(dá)，48 h后酶活性又開始回升，到60 h的酶活性值高于初始值，表明SOD對毒素侵染有抵抗能力。因此，SOD可以作為雷公藤抗角斑病的生理指標(biāo)。

2.2 毒素粗提取物處理對雷公藤體內(nèi)POD活性的影響

從圖2可以看出毒素促進(jìn)了植物體內(nèi)的過氧化物酶的表達(dá)，60 h內(nèi)毒素處理的雷公藤植物的POD活性都高于對照的枝條。12 h毒素處理的雷公藤高于對照7%，24 h毒素處理的雷公藤高于對照28%，36 h毒素處理的雷公藤高于對照20%，48h毒素處理的雷公藤高于對照15%，12 h毒素處理的雷公藤高于對照34%。12～24 h毒素處理的雷公藤植株的POD活性的升高速度高于對照處理的植株；24～36 h二者的增長幅度相差不大，36 h時，二者都出現(xiàn)了峰值，36 h后POD活性下降，但48h后毒素處理的植株P(guān)OD活性上升，而對照的POD活性基本穩(wěn)定；這表明雷公藤受毒素侵染后植物機(jī)體首先表現(xiàn)出抵抗的效果，酶活性升高，但可能由于毒素毒性過強(qiáng)，難以抵制，活性逐步下降，但隨著機(jī)體POD大量表達(dá)，48 h后酶活性又開始回升，到60 h的酶活性值高于初始值，表明POD對毒素侵染有抵抗能力。因此，POD可以作為雷公藤抗角斑病的生理指標(biāo)。

圖1 不同處理的雷公藤SOD活性變化Figure 1 Different treatment Tripterygium wilfordii SOD changes

圖2 不同處理的雷公藤POD活性變化Figure 2 different treatment Tripterygium w ilfordii POD activity changes

3 結(jié)論與討論

植物的抗病能力由體內(nèi)的抗病基因決定，這些基因的表達(dá)速度、程度以及基因表達(dá)所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)量的多少都與抗病能力有直接的關(guān)系。大量研究表明，植物受病原菌侵染后過氧化物酶和多酚氧化酶的活性有較大的變化，其變化與植物的抗病性密切相關(guān)[19-22]。植物與病原菌相互作用過程中廣泛存在著活性氧爆發(fā)現(xiàn)象引發(fā)的體內(nèi)多種氧化反應(yīng)，這種現(xiàn)象被看做是植物防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制的一部分。正常情況下，植物體內(nèi)代謝保持平衡，而在逆境下，植物將產(chǎn)生大量的活性氧，過量的活性氧可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其他組分的嚴(yán)重?fù)p傷，甚至死亡[23-24]。

通過對雷公藤毒素處理，按照不同時間進(jìn)行取樣，從葉片中超氧化物歧化酶、過氧化物酶的指標(biāo)上進(jìn)行測定分析。由于本試驗毒素處理的雷公藤植株在60 h之后已接近死亡，故不再對其酶活性進(jìn)行測定。測量SOD所得數(shù)據(jù)均與各時間段雷公藤的抗病性相對應(yīng)，由于受到病菌毒素的侵染導(dǎo)致植物的酶活性提高，而后期由于毒性過強(qiáng)植物難以抵抗，SOD活性開始下降，從48 h這個轉(zhuǎn)折點來看，植物中SOD活性開始升高，這表明植物對病菌的侵染做出了抵抗。且整個實驗過程毒素處理的雷公藤植株P(guān)OD活性都高于對照水平，這也表明植物對病菌的侵染作出了抵抗。從圖1及圖2上可以看出SOD的最大值出現(xiàn)在24 h，而POD的最值出現(xiàn)在36 h，這證明了植物組織對活性氧的清除過程中SOD先行于POD，驗證了SOD能將O2-轉(zhuǎn)化為毒性較小的H2O2和O2，而POD又可進(jìn)一步清除H2O2生成無害的H2O和O2，兩種酶協(xié)同作用完成了對植物體的保護(hù)。試驗表明SOD、POD都可以作為雷公藤植株抗性的指標(biāo)。說明用毒素粗提物處理枝條來鑒定寄主對假尾孢菌毒素的抗性是可行的，由于用毒素處理雷公藤的方法對環(huán)境沒有影響，所以這將為今后雷公藤產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供理論參考。

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