馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏對直腸黏膜急性損傷的修復(fù)作用及機(jī)制研究Δ

姜義武，李 杰，唐海云，錢珊英，趙 沖

(1.東莞常安醫(yī)院藥劑科，廣東 東莞 523560；2.東莞常安醫(yī)院護(hù)理部，廣東 東莞 523560；3.東莞常安醫(yī)院檢驗科，廣東 東莞 523560；4.東莞常安醫(yī)院普外科，廣東 東莞523560)

馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏對直腸黏膜急性損傷的修復(fù)作用及機(jī)制研究Δ

姜義武1*，李 杰2，唐海云1，錢珊英3，趙 沖4

(1.東莞常安醫(yī)院藥劑科，廣東 東莞 523560；2.東莞常安醫(yī)院護(hù)理部，廣東 東莞 523560；3.東莞常安醫(yī)院檢驗科，廣東 東莞 523560；4.東莞常安醫(yī)院普外科，廣東 東莞523560)

目的：探討馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏對直腸黏膜急性損傷的修復(fù)作用及機(jī)制。方法：選取成年雄性SD大鼠240只作為研究對象，按照編號順序分為對照組與觀察組，每組120只。2組大鼠給予全身麻醉，將3%的乙酸棉簽經(jīng)大鼠肛門置入直腸30 s。觀察組大鼠在損傷后30 min開始給予馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏20 mg，1日2次，連用7 d。對照組大鼠無任何藥物干預(yù)。2組于第7日使用藥物后的30 min及24、72、120 h各處死30只大鼠，在15倍放大鏡下，觀察2組大鼠直腸的形態(tài)特征，并采用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色，觀察馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏對各指標(biāo)的影響。結(jié)果：治療后24、72、120 h，觀察組大鼠直腸黏膜損傷計分顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。直腸黏膜損傷24 h后，觀察組大鼠血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶9水平均顯著低于對照組；直腸損傷72、120 h，血管內(nèi)皮生長因子、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素8、基質(zhì)金屬蛋白酶9、缺氧誘導(dǎo)因子-1α和增殖細(xì)胞核抗原的陽性表達(dá)率均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏能夠顯著緩解直腸黏膜急性損傷程度，加快損傷愈合速度。

直腸黏膜急性損傷；馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏；修復(fù)；作用機(jī)制

結(jié)直腸黏膜急性損傷多見于急性直腸炎、急性潰瘍性結(jié)腸炎、痔急性發(fā)作等疾病。相關(guān)臨床研究表明，馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏治療直腸黏膜急性損傷，療效較好，但缺少病理學(xué)基礎(chǔ)研究。本研究通過建立蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、免疫組化SP法染色和彈性纖維染色方法，觀察馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏促進(jìn)上皮細(xì)胞和腺體增生、減少肉芽組織的形成情況，探索馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏修復(fù)痔組織病理形態(tài)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏(馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：20160127)；蘇木精-伊紅染色劑(南昌雨露實(shí)驗器材有限公司)，乙酸為分析純。

1.2 動物

選取成年雄性SD大鼠240只作為研究對象，體質(zhì)量約240 g，按照編號順序分為對照組與觀察組，每組120只。

2 方法

2.2 實(shí)驗方案

2.2.1 大鼠直腸黏膜損傷模型的建立：采用全身麻醉途徑，應(yīng)用經(jīng)濃度為3%的乙酸蘸過的棉簽置于大鼠肛門直腸處，時間為0.5 min。然后將240只SD大鼠直腸黏膜損傷模型按照奇偶數(shù)分組方法均分為對照組與觀察組。觀察組大鼠在損傷后30 min～7 d給予馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏20 mg，1日2次；對照組大鼠未采用任何藥物進(jìn)行干預(yù)治療。2組于第7日使用藥物后的30 min及24、72、120 h各處死30只大鼠，2組大鼠于相同時間處死，在15倍放大鏡下，觀察2組處死大鼠直腸的形態(tài)特征。根據(jù)文獻(xiàn)中黏膜損傷的計分方法[1]，對黏膜損傷進(jìn)行計分。

2.2.2 染色方法：使用蘇木精-伊紅染色大鼠腎臟組織。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[2]，采用7種分別針對CD34、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的單克隆抗體行免疫組化SP染色。

2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

IL-8的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：血管內(nèi)皮細(xì)胞或者細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒；VEGF、MMP9、iNOS和PCNA的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：胞漿內(nèi)或者細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒；HIF-α的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。參考相關(guān)文獻(xiàn)中的評分標(biāo)準(zhǔn)[3]，將染色結(jié)果從染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞數(shù)量2個方面進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)的對比采用配對t檢驗；對待測指標(biāo)表達(dá)強(qiáng)度的高低采用t檢驗和Kruskal-WallisH檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 2組大鼠黏膜損傷計分比較

直腸黏膜損傷后24、72、120 h，觀察組大鼠黏膜損傷計分均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

組別黏膜損傷計分30min24h72h120h對照組(n=10)8.08±0.548.05±0.526.62±0.334.09±0.24觀察組(n=10)8.15±0.607.01±0.394.12±0.272.97±0.18t0.1873.3894.4934.012P0.3280.0410.0330.035

3.2 2組大鼠染色結(jié)果比較

直腸黏膜損傷24 h后，觀察組大鼠MMP9及VEGF水平顯著低于對照組；直腸黏膜損傷后72、120 h，觀察組大鼠VEGF、iNOS、IL-8、MMP9、HIF-1α、PCNA的陽性表達(dá)率分別為10.00%、10.00%、7.50%、6.67%、13.33%、15.00%，均顯著低于對照組的20.00%、28.33%、20.00%、33.33%、26.68%、20.00%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2組大鼠不同時間節(jié)點(diǎn)染色指標(biāo)表達(dá)比較的統(tǒng)計學(xué)分析見表2。2組大鼠標(biāo)本損傷72 h后的免疫組化染色圖見圖1。

表2 2組大鼠標(biāo)本不同時間節(jié)點(diǎn)各項免疫組化染色指標(biāo)表達(dá)比較的統(tǒng)計學(xué)分析Tab 2 Statistical analysis on comparison of immunohisto-chemical staining indicators at different time points between two groups

注：“*”為Kruskal-WallisH檢驗，“#”為t檢驗

Note：“*” means Kruskal-Wallis H test, “#” means t test

A. 對照組大鼠IL-8呈強(qiáng)陽性表達(dá)；B.觀察組大鼠IL-8呈陰性表達(dá)；C.對照組大鼠PCNA呈強(qiáng)陽性表達(dá)；D.觀察組大鼠PCNA呈弱陽性表達(dá)；E.對照組大鼠iNOS呈強(qiáng)陽性表達(dá)；F.觀察組大鼠iNOS呈陰性表達(dá)；G.對照組大鼠HIF-1α呈強(qiáng)陽性表達(dá)；H.觀察組大鼠HIF-α呈陰性表達(dá)。A. the IL-8 of control group is positive expression; B. the IL-8 of observation group is negative expression; C. the PCNA of control group is weakly positive expression; D. the PCNA of observation group is positive expression; E. the iNOS of control group is strongly positive expression; F. the iNOS of observation group is negative expression; G. the HIF-1αof control group is strongly positive expression; H. the HIF-1αof observation group is negative expression圖1 2組大鼠標(biāo)本損傷72 h后的免疫組化染色圖(SP法，×400)Fig 1 Immunohistochemistry staining results of rats after injury of 72 h(SP method，×400)

4 討論

近年來，人們飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變導(dǎo)致了我國痔瘡的高發(fā)。目前，我國治療痔瘡的外用產(chǎn)品主要有馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏(栓劑)、云南白藥痔瘡膏(栓劑)、復(fù)方角菜酸酯乳膏(栓劑)。隨著馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏的廣泛應(yīng)用，其在口腔潰瘍、創(chuàng)口愈合、子宮頸糜爛等方面都顯示出較好的治療效果[4]。臨床相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏有促進(jìn)創(chuàng)面愈合、減輕瘙癢和解毒等作用[5-7]。

馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏由人工麝香、人工牛黃、琥珀、冰片、珍珠、硼砂等組成，具有清熱消毒、活血化瘀、去腐生肌等作用。麝香辛溫行散，活血消腫，通經(jīng)散結(jié)止痛，芳香走竄，有消除一切惡瘡、痔、瘺腫痛及去腐生肌之功效；牛黃為清熱解毒之良藥，善治癰、疽、疔、瘡；珍珠含有碳酸鈣及各種氨基酸，具有清熱解毒、生肌斂瘡、止血消炎之功效；冰片具有較強(qiáng)的止痛、消炎、祛腐、生肌、抗感染、改善局部血液循環(huán)和加速創(chuàng)面愈合的作用。從黏膜損傷的角度探討馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏對黏膜層柱狀上皮、杯狀細(xì)胞、肌纖維、結(jié)締組織的修復(fù)情況對臨床應(yīng)用該藥有意義，或許能為潰瘍修復(fù)和創(chuàng)面愈合等研究提供一種潛在的全新思路。

近年來，各種實(shí)驗技術(shù)不斷進(jìn)步，給直腸黏膜損傷的基礎(chǔ)研究與臨床治療帶來了長足的發(fā)展，一些中成藥已經(jīng)在腸黏膜損傷中顯示了強(qiáng)大的修復(fù)功能。組織修復(fù)過程中的細(xì)胞增生是受生長因子調(diào)控的，生長因子加速創(chuàng)傷修復(fù)的機(jī)理主要涉及生長因子參與炎癥反應(yīng)，影響細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)RNA、DNA的合成、誘導(dǎo)新血管形成及細(xì)胞外基質(zhì)沉淀等[8-9]。

王振軍等[3]探討了表面黏膜的損傷是痔瘡發(fā)生、發(fā)展的病理形態(tài)改變之一，同時探討了復(fù)方角菜酸酯栓對大鼠直腸急性黏膜損傷治療前后黏膜的病理變化，并通過免疫組織化學(xué)方法研究復(fù)方角菜酸酯栓對與炎癥/損傷的基因(MMMP9、VEGF、iNOS、IL-8、PCNA、HIF-1α、MVD)表達(dá)的影響。王紅英等[10]采用熱板鎮(zhèn)痛法、小鼠皮內(nèi)色素滲出法進(jìn)行研究，結(jié)果表明，馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用。劉惟莞等[11]采用小鼠耳腫脹法、小鼠斷尾出血時間測定法等實(shí)驗研究，闡述了潰瘍表面壞死及滲出物狀況、肉芽組織中新生血管狀況、纖維母細(xì)胞的數(shù)量及大小、炎性水腫、炎性細(xì)胞浸潤程度等，認(rèn)為馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏具有活血化瘀、去腐生肌的作用；同時觀察到馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏具有促進(jìn)纖維母細(xì)胞生成少量膠原纖維的作用[12-14]。

本研究擬在大鼠直腸黏膜損傷模型中，運(yùn)用光鏡、超微電鏡和染色等方法，觀察黏膜損傷及治療前后痔瘡組織的病理形態(tài)學(xué)改變，探討馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏對黏膜損傷治療的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，治療后24、72、120 h，觀察組大鼠直腸黏膜損傷計分顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。直腸黏膜損傷24 h之后，觀察組大鼠VEGF、MMP9水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏能夠顯著緩解直腸黏膜急性損傷程度，加快損傷愈合速度；該藥的重要機(jī)制可能為通過降低MMP9、VEGF、IL-8、PCNA、iNOS及HIF-1基因的表達(dá)來保護(hù)直腸黏膜急性損傷。

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Study on the Repairing Effects and Mechanism of Musk Hemorrhoids Ointment on Acute Injury of RectalΔ

JIANG Yiwu1, LI Jie2, TANG Haiyun1, QIAN Shanying3, ZHAO Chong4

(1.Dept.of Pharmacy, Dongguan Chang’an Hospital, Guangdong Dongguan 523560, China; 2.Dept.of Nursing, Chang An Hospital, Dongguan Chang’an Hospital, Guangdong Dongguan 523560, China; 3.Dept.of Laboratory, Chang An Hospital, Dongguan Chang’an Hospital, Guangdong Dongguan 523560, China; 4.Dept.of General Surgery, Chang An Hospital, Dongguan Chang’an Hospital, Guangdong Dongguan 523560, China)

OBJECTIVE：To probe into the repairing effects and mechanism of musk hemorrhoids ointment on acute injury of rectal. METHODS: 240 male SD rats were extracted to be divided into observation group and control group via the serial number, with 120 cases in each. Two groups were general anesthetized with 3% acetic acid cotton swabs for 30 s. The observation group were given 20 mg musk hemorrhoids ointment after injury of 30 min, twice a day for 7 d; while the control group were not treated with any drugs. On the 7th day, after administration of 30 min, 24 h, 72 h and 120 h, 30 rats in each group were killed. Under 15-time magnifier, the morphological characteristics of rectum of two groups were observed. The hematoxylin-eosin stain was used to analyze the effects of musk hemorrhoids ointment on these indexes. RESULTS: After treatment of 24 h, 72 h and 120 h, the rectal mucosa damage score of observation group was lower than that of control group, with statistically significant difference(P<0.05). After rectal mucosa damage of 24 h, the VEGF, MMP9 level of observation group were lower than those of control group; after rectal mucosa damage of 72 h and 120 h, the positive expression rate of VEGF、iNOS、IL-8、MMP9、HIF-1α、PCNA was significantly lower than that of control group, with statistically significant difference(P<0.05). CONCLUSIONS: Musk hemorrhoids ointment can significantly relieve the acute rectal mucosal injury and accelerate the speed of wound healing.

Acute rectal mucosal injury; Musk hemorrhoids ointment; Repairing; Mechanism

東莞市科技局項目(No.201610515000147)

R96

A

1672-2124(2017)02-0176-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.02.010

2016-10-07)

*副主任藥師。研究方向：藥理分析。E-mail：juanhhmm@163.com