QuEChERS結(jié)合柱凈化的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定有機肥中46種抗生素

汪建妹，劉艷平，陳 靜，吳慧珍，夏 魏，李祖光，錢鳴蓉*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江省植物有害生物防控重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2.浙江工業(yè)大學 化工學院，浙江 杭州 310014；3.浙江醫(yī)藥股份有限公司，浙江 紹興 312000)

QuEChERS結(jié)合柱凈化的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定有機肥中46種抗生素

汪建妹1，劉艷平2，陳 靜3，吳慧珍2，夏 魏2，李祖光2，錢鳴蓉1*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江省植物有害生物防控重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2.浙江工業(yè)大學 化工學院，浙江 杭州 310014；3.浙江醫(yī)藥股份有限公司，浙江 紹興 312000)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時測定有機肥中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類46種抗生素的分析方法。樣品用乙腈-EDTA緩沖溶液(pH 10.0)提取，鹽析后離心分層，乙腈層按QuEChERS法，采用吸附劑凈化；緩沖溶液層經(jīng)HLB柱凈化。ACQUITY UPLC BEH C18柱用作色譜分離，以2 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸)-甲醇為流動相進行梯度洗脫；電噴霧電離源正離子(ESI+)多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，基質(zhì)外標法定量。46種抗生素在1～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 6～0.999 9。在25，100，400 μg/kg加標濃度下，3類抗生素的回收率分別為67.8%～95.6%，65.6%～89.4%和66.6%～107.8%，相對標準偏差為0.4%～11.9%；方法檢出限(S/N=3)為0.6～4.6 μg/kg，定量下限(S/N=10)為2.1～15.4 μg/kg。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)；抗生素殘留；有機肥；QuEChERS結(jié)合柱凈化

大量研究表明，養(yǎng)殖場排出的動物糞便、污水和周邊土壤中含有多種抗生素殘留[1-6]，畜禽糞便經(jīng)發(fā)酵加工后可作為有機肥施于農(nóng)田，雖然部分抗生素在加工過程中發(fā)生吸附與降解，但商品有機肥中仍存在多種抗生素殘留，對生態(tài)環(huán)境具有潛在危害[3-6]。因此，建立有效檢測有機肥中抗生素的方法對于提高有機肥的質(zhì)量和維護生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義。

已報道的有機肥中抗生素檢測方法主要通過機械振動或超聲協(xié)助提取后，用HLB柱[4,7-9]或SAX-HLB串聯(lián)柱凈化[10-12]，然后以液相色譜-紫外法[4,10-11]或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-9,12]測定。其中，Hu等[4]采用HLB單柱凈化，高效液相色譜-紫外法測定有機肥中13種抗生素，需采用2種不同流動相分離待測物，導致部分抗生素的回收率低于60%；葛峰等[12]采用SAX-HLB串聯(lián)柱進行富集與凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定有機肥中18種抗生素，其過程相對繁瑣、耗時較長。QuEChERS(Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)方法是集萃取和凈化為一體的新型樣品前處理方法，在食品檢測中得到了廣泛應(yīng)用[13-14]，但在有機肥中抗生素多殘留檢測方面的應(yīng)用未見報道。

本文針對目前畜禽業(yè)常用的磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類46種抗生素，采用QuEChERS結(jié)合柱凈化的前處理手段進行富集與凈化，UPLC-MS/MS進行測定，建立了一種靈敏、高效同時測定商品有機肥中多種抗生素殘留的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAPTM6500三重四極桿-線性離子阱復合質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，i.d.，1.7 μm，Waters公司)；Sorvall Primo R高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg，Waters公司，使用前分別以10 mL甲醇、10 mL去離子水活化)。甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；NaCl、無水Na2SO4、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)(分析純)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18購自Agela公司。

18種磺胺類、19種喹諾酮類、9種大環(huán)內(nèi)酯類藥物購自Dr.Ehrenstorfer公司，純度均高于97%。藥物名稱及縮寫見表1。

1.2 標準溶液配制

以甲醇為溶劑分別配制標準儲備液(20.0 mg/L)，于-18 ℃保存。臨用時以甲醇稀釋上述標準儲備液，配制成所需濃度的標準工作液。

1.3 樣品采集

樣品為市售商品有機肥，于每種有機肥包裝袋內(nèi)5個不同位置采樣，混勻后按照四分法取0.5 kg作為供試樣品，風干粉碎后過1 mm篩，待用。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取 稱取1.0 g有機肥于50 mL離心管中，加入10 mL EDTA(pH 10.0)緩沖溶液，渦旋1 min，靜置15 min后加入10 mL乙腈，渦旋1 min，7 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管中，加入4 g NaCl，渦旋15 s，再次離心5 min后分層，上層為乙腈層，下層為緩沖溶液層。

1.4.2 多級凈化 取7 mL乙腈層于15 mL離心管中，加入350 mg PSA和700 mg C18，渦旋1 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于10 mL試管中，氮吹近干，待接收緩沖溶液層經(jīng)固相萃取凈化后的洗脫液。

取5 mL緩沖溶液層，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，轉(zhuǎn)移至活化后的HLB柱。待上樣完畢后用10 mL水淋洗，7.5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于上述吹干的試管中，氮吹近干，以1 mL甲醇-水(50∶50)定容，混勻，過0.22 μm濾膜，上機檢測。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，柱溫：40 ℃，進樣體積：5.0 μL，流動相：A為2 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，B為甲醇，流速：0.20 mL/min，梯度洗脫程序：0～3 min，5%～20% B；3～10 min，20%～30% B；10～16 min，30%～90% B，保持2 min；18～18.5 min，90%～10% B；18.5～19.5 min，10%～5% B，保持5.5 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離ESI(+)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；輔助氣：40 psi；46種藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

參考QuEChERs法(方法1)進行有機肥中抗生素的加標回收實驗。1.0 g樣品經(jīng)10 mL EDTA緩沖溶液(pH 4.0)、10 mL乙腈超聲提取15 min后，加入4 g NaCl，7 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液，加入500 mg無水Na2SO4,50 mg PSA和100 mg C18凈化并再次離心，取0.5 mL上清液，用去離子水定容至1 mL后過膜檢測?；|(zhì)外標法定量，結(jié)果如圖1～3所示，磺胺類抗生素中，STZ和SML的回收率低于40%，另有8種磺胺類抗生素的回收率為40%～60%；大環(huán)內(nèi)酯類中，CLI，TYL和KIT的回收率為41.5%～56.5%，LIN的回收率僅13.4%；喹諾酮類抗生素的提取效果普遍較差，僅有3種的回收率高于60%。隨后改變緩沖溶液pH值(pH=7.0和10.0)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值的變化對乙腈相提取抗生素的效果影響較小。

圖1 4種提取方法中18種磺胺類抗生素處于不同回收率范圍內(nèi)的數(shù)量Fig.1 Number of 18 sulfonamides located in different recovery ranges with four extraction methods

圖2 4種提取方法中19種喹諾酮類抗生素處于不同回收率范圍內(nèi)的數(shù)量Fig.2 Number of 19 quinolones located in different recovery ranges with four extraction methods

圖3 4種提取方法中9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素處于不同回收率范圍內(nèi)的數(shù)量Fig.3 Number of 9 macrolides located in different recovery ranges with four extraction methods

由于部分抗生素易溶于水相，難以轉(zhuǎn)移至乙腈相，故在方法2中對提取的上下兩相分別進行凈化。有機相采用吸附劑凈化；水相經(jīng)HLB柱凈化，并以凈化后的有機相作為洗脫液。收集洗脫液，氮吹近干，復溶過膜后檢測。結(jié)果如圖1～3，該改進步驟(方法2)可提高部分喹諾酮類抗生素的回收率，但仍有3種抗生素的回收率低于20%，9種抗生素的回收率為20%～40%，4種抗生素的回收率為40%～60%；大環(huán)內(nèi)酯類中，TYL和KIT的回收率略低于40%；部分磺胺類的回收率略有降低，回收率在60%～100%范圍內(nèi)的抗生素數(shù)量降至4種，STZ，SPD，SMX，SML的回收率低于40%，故仍需優(yōu)化。

在方法3中，有機相凈化后直接轉(zhuǎn)移至試管中氮吹近干，采用5%氨化甲醇作為HLB柱洗脫液[15-16]，并以上述含有機相的試管收集洗脫液，氮吹近干，復溶過膜后檢測。結(jié)果表明，磺胺類抗生素中僅有3種的回收率低于60%(SDZ，STZ，SML)；9種大環(huán)內(nèi)酯類的回收率均高于40%，且有5種的回收率為80%～110%；喹諾酮類抗生素的回收率普遍提高，較方法1和2均有明顯改善。

pH值可能會影響緩沖溶液提取有機肥中抗生素的效率，因此在方法3的基礎(chǔ)上，考察了3種pH值(pH=4.0，7.0，10.0)EDTA緩沖溶液對回收率的影響。當pH值為10.0時，磺胺類抗生素的回收率為68.4%～90.5%，喹諾酮類為65.8%～89.6%，大環(huán)內(nèi)酯類為66.3%～107.8%，明顯高于其他pH值緩沖溶液的提取效率(方法4)，結(jié)果見圖1～3。高pH值的緩沖溶液能破壞藥物在有機肥表面的氫鍵等吸附作用[17-18]，有利于化合物與基質(zhì)的解離。因此本實驗最終采用方法4作為樣品前處理方法。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

將空白有機肥樣品按“1.4”方法進行處理，分別配制50，100，200 μg/L 3個濃度水平的基質(zhì)加標溶液和純?nèi)軇┘訕巳芤?，在?yōu)化前處理條件下，當平均基質(zhì)效應(yīng)(增強或抑制)超過20%，則認為基質(zhì)效應(yīng)對定量檢測具有顯著影響?；|(zhì)效應(yīng)(ME)通過下式計算:ME(%)=(A2-A1)/A1×100%。式中，A1為特定濃度下的抗生素在純?nèi)軇┲械钠骄迕娣e；A2為相同濃度下的抗生素在空白有機肥萃取液中的平均峰面積。采用改進的前處理方法處理有機肥樣品并檢測，結(jié)果顯示6種抗生素(PIP，NOR，CIP，CIN，SPA，ERY)的基質(zhì)增強或抑制效應(yīng)略大于20%，因此采用基質(zhì)匹配校正曲線定量，以減少基質(zhì)干擾對結(jié)果的影響。

2.3 方法的線性關(guān)系

在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，46種抗生素混合標準溶液可獲得較好地分離。選用空白有機肥樣品按“1.4”方法處理，配制質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0，10.0，50，100，200 μg/L的基質(zhì)標準溶液，以質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標，定量離子色譜峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。46種抗生素的基質(zhì)匹配校正曲線在1.0～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 6～0.999 9。圖4為陽性豬糞源有機肥樣品中4種檢出抗生素的定量離子色譜圖。

2.4 方法的回收率、精密度與檢出限

選用空白有機肥樣品，按所建立的方法處理，分別在25，100，400 μg/kg水平下進行加標回收實驗，每個水平重復測定6次，磺胺類抗生素的平均回收率為67.8%～95.6%，相對標準偏差(RSD)為0.4%～7.6%；喹諾酮類的平均回收率為65.6%～89.4%，RSD為0.7%～10.9%；大環(huán)內(nèi)酯類的平均回收率為66.6%～107.8%，RSD為1.5%～11.9%(表1)。在25 μg/kg加標回收實驗條件下，根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)確定46種抗生素的檢出限(LOD)為0.6～4.6 μg/kg，S/N=10確定定量下限(LOQ)為2.1～15.4 μg/kg(見表1)。

表1 46種抗生素的保留時間、質(zhì)譜參數(shù)、方法檢出限、定量下限、回收率與相對標準偏差Table 1 Retention times,MS parameters,LODs,LOQs,recoveries and RSDs of 46 antibiotics

*quantitative ion

2.5 實際樣品的分析

應(yīng)用本方法測定了20份有機肥樣品(10份豬糞源，10份雞糞源)，對檢出濃度超出線性范圍的樣品進行逐步稀釋，結(jié)果檢出SDZ，SM2，OFL，CIP，NOR，ENR和TIL，檢出率分別為5%，30%，50%，15%，15%，65%和5%，檢出含量分別為30.5 μg/kg，31.9～232.7 μg/kg，20.3～262.8 μg/kg，18.2～33.4 μg/kg，57～80.7 μg/kg，15.2～678.6 μg/kg和11 μg/kg。

3 結(jié) 論

本文建立了QuEChERS結(jié)合柱凈化前處理手段，同時測定有機肥中46種抗生素的UPLC-MS/MS法，并成功應(yīng)用于實際樣品的分析。本方法操作簡單、靈敏度強、回收率較高、穩(wěn)定性好，能同時測定多種抗生素殘留，可作為有機肥中獸藥抗生素多殘留痕量檢測的方法。

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Determination of 46 Antibiotics Residues in Organic Fertilizer by UPLC-MS/MS with QuEChERS Combined with Column Purification

WANG Jian-mei1，LIU Yan-ping2，CHEN Jing3，WU Hui-zhen2，XIA Wei2，LI Zu-guang2,QIAN Ming-rong1*

(1.State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable，Pest and Disease Control，Institute of Quality and Standard for Agro-products，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China；2.College of Chemical Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；3.Zhejiang Medicine Co.，Ltd.，Shaoxing 312000,China)

A confirmative method was developed for the simultaneous determination of 46 antibiotics,including sulfonamides，quinolones and macrolides in organic fertilizer by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(UPLC-MS/MS).The samples were extracted with acetonitrile-EDTA buffer solution(pH 10.0),and separated by centrifugation after salting-out.The upper acetonitrile layer was purified by the QuEChERS steps with sorbents.The buffer solution layer was purified with solid-phase extraction cartridge.The separation of target drugs was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18column using a mobile phase consisting of 2 mmol/L ammonium acetate with 0.1% formic acid and methanol by gradient elution．The analysis of target compounds was carried out with positive electrospray ionization(ESI+)source under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The matrix-matched external standard calibration was used for quantification.Good linearities for the 46 antibiotics were achieved over the concentration of 1-200 μg/L,with correlation coefficients(r2) of 0.996 6-0.999 9.The recoveries of sulfonamides,quinolones and macrolides at spiked levels of 25，100,400 μg/kg were in the range of 67.8%-95.6%,65.6%-89.4% and 66.6%-107.8%,respectively,with relative standard deviations(RSDs) of 0.4%-11.9%.The limits of detection(LOD,S/N=3) were 0.6-4.6 μg/kg,and the limits of quantitation(LOQ,S/N=10) were 2.1-15.4 μg/kg.

ultrahigh performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(UPLC-MS/MS)；antibiotics residues；organic fertilizer；QuEChERS combined with column purification

2016-08-04；

2016-10-24

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項(201303091)；浙江省自然科學基金(LY14B070008)；省部共建國家重點實驗室培育基地項目(2010DS700124-ZZ1602);浙江省農(nóng)業(yè)科學院中美三方合作項目(2010DS700124-ZM1604)；寧波科技項目(2013C11024)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.011

O657.63;O629.5

A

1004-4957(2017)02-0218-06

*通訊作者：錢鳴蓉，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，Tel：0571-86404015，E-mail：qian_mingrong123@163.com