正交設計與響應面法優(yōu)化山藥多糖提取工藝

龍菊，孫翠英，張紅霞，王家順

（安順學院農學院，貴州安順561000）

正交設計與響應面法優(yōu)化山藥多糖提取工藝

龍菊，孫翠英，張紅霞，王家順

（安順學院農學院，貴州安順561000）

采用微波纖維素酶法提取山藥多糖，并利用苯酚一硫酸法測定多糖的含量。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗和響應曲面法進一步優(yōu)化工藝。結果表明，最佳提取工藝條件為：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解時間64min、微波時間50 s，山藥多糖提取量為32.42mg/g。

山藥多糖；正交試驗；響應曲面法

山藥，又名薯蕷（Dioscorea japonica Thunb）。山藥作為一種食藥兩用的食品，營養(yǎng)成分全面，含有豐富的碳水化合物和蛋白質。具有增強免疫功能，降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等多種生理活性，對人體保持健康有重要的意義[1-3]。目前，多糖提取方法有微波輔助法、水提取法、超聲波輔助法和纖維素酶解法等，但提取時間較長，提取率較低[4]。為了進一步提高多糖提取率、縮短提取時間。本研究在單因素分析法的基礎上，利用正交設計及響應曲面法，并采用微波纖維素酶法提取多糖，為山藥多糖提取提供一套快速、高效的方法，為開發(fā)山藥類功能保健食品提供一定的工藝參數[5-10]。

1 材料與儀器

1.1 材料

山藥：安順劉管新鮮山藥。

1.2 試劑

纖維素酶：寧夏和氏璧生物技術有限公司；無水乙醇、濃硫酸、苯酚均為分析純。

1.3 儀器

AB204-N型電子天平：奧豪斯；752型紫外-可見分光光度計：美國安捷倫；恒溫水浴鍋：沈陽龍騰儀器有限公司；離心機：上海儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱：上海博訊有限公司；微量移液器：德國Brand；粉碎機：長沙平凡有限公司；微波爐：美的電器；旋轉蒸發(fā)器：寧波新芝儀器有限公司。

2 方法

2.1 山藥多糖提取工藝流程

山藥→干燥粉碎→稱量→蒸餾水溶解→微波水浴加熱→纖維素酶→滅活酶→水浴提取→離心取上清液→濃縮→山藥多糖

2.2 山藥多糖測定

精確稱取山藥粉（安順劉官山藥）1.0 g，加入蒸餾水10mL，用600W微波功率處理60 s，后再加入0.2%纖維素酶，在溫度50℃條件下酶解1 h，提取結束后抽濾提取液，用濃縮到適當體積。按照苯酚一硫酸法，測定其吸光值，計算山藥多糖的含量。

2.3 葡萄糖標準曲線繪制

利用苯酚一硫酸法，在最大吸收波長490 nm處測定葡萄糖吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程：y=0.013 5x-0.258 3R2=0.999 6。當測定多糖含量時，將吸光值代入標準曲線，即可求出所測溶液的多糖含量。

山藥多糖含量的計算公式：

2.4 微波纖維素酶法提取山藥多糖單因素試驗

通過參考相關文獻資料，選取微波法纖維素酶法提取山藥多糖提取量有顯著影響的4個因素，即微波功率、微波時間、纖維素酶量及酶解時間進行單因素試驗，考察每個因子對多糖提取量的影響。

2.5 微波纖維素酶法提取山藥多糖多因素試驗

2.5.1 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗以酶加量、酶解溫度、微波功率和微波時間，按L16（44）設計四水平四因素試驗，16個組合，3次重復，確定山藥多糖的最佳提取方法，試驗因子及水平見表1。

表1 試驗因子及水平Table1 Testing factors and levels

2.5.2 響應曲面試驗

在單因素試驗和正交試驗（微波時間不顯著）的基礎上，選用響應曲面試驗法，綜合考慮做3因素（A微波功率W，B酶加量%，C酶解時間min）3水平共15個試驗點的曲面分析試驗，響應面分析因素與水平編碼表見表2。

表2 響應面分析因素與水平編碼表Table2 Factors and levels of response surface experiment

3 結果

3.1 單因素試驗結果分析

3.1.1 不同微波功率對山藥多糖提取量的影響

通過設定微波時間60 s，纖維素酶加量0.2%，酶解時間1 h，微波功率為160、320、480、600、720、840W，不同微波功率對山藥多糖提取量的影響見圖1。

圖1 微波功率多糖提取含量的影響Fig.1 Microwave power on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.2 不同纖維素酶量對山藥多糖提取量的影響

通過設定微波功率為600W，微波時間60 s，酶解時間1 h，纖維素酶加量為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.30%，不同纖維素酶加量對山藥多糖提取量的影響見圖2。

圖2 纖維素酶加量對多糖提取含量的影響Fig.2 Cellulose enzyme concentration on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.3 不同纖維素酶酶解時間對山藥多糖提取量的影響

通過設定微波功率為600W，微波時間60 s，纖維素酶加量0.2%，酶解時間為20、30、40、50、60、70、80、90min，不同纖維素酶解時間對山藥多糖提取量的影響見圖3。

圖3 纖維素酶反應時間對多糖提取含量的影響Fig.3 Cellulose enzyme digestion time on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.4 不同微波功率對山藥多糖提取量的影響

通過設定微波功率600W，纖維素酶加量0.2%，酶解時間1 h，微波時間為10、20、30、40、50、60、70 s，不同微波功時間對山藥多糖提取量的影響見圖4。

圖4 微波時間對多糖提取含量的影響Fig.4 Microwave time on the influence of the content of the polysaccharide extraction

利用微波纖維素酶法的單因素試驗，分別考察微波功率、維素酶加量、酶解時間和微波時間對山藥多糖提取率的影響。由（圖1～圖4）可知微波功率600W、纖維素酶加量為0.2%、纖維素酶反應時間50min～70min，微波提取時間在30 s～50 s等單因素試驗的條件下，山藥多糖的提取含量較高。

3.2 微波纖維素酶法提取山藥多糖多因素試驗

3.2.1 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優(yōu)化山藥多糖的提取工藝。其正交試驗因素水平及結果分析見表3，方差分析表見表4。

表3 正交試驗因素水平及結果分析Table3 Orthogonal test and analysis of results

表4 方差分析表Table4 The variance analysis of the orthogonal trial

由表3可知，對山藥多糖提取量影響的因素為微波功率＞纖維素酶加量＞酶解時間＞微波時間。由表4方差分析表可知，微波功率和酶加量極顯著，酶解時間有一定影響，微波時間對多糖提取量的影響較小。山藥多糖提取工藝的單因素試驗與正交試驗結果一致，得出最優(yōu)的工藝組合為10號（A3B2C4D3），微波功率為600W、纖維素酶加量為0.2%、纖維素酶解時間70min和微波時間50 s。

3.2.2 響應曲面試驗結果

由單因素試驗和正交試驗的基礎上，利用響應面法優(yōu)化山藥多糖提取工藝。響應面試驗分析設計及結果表5，二次回歸模型的方差分析結果表6。

表5 響應面試驗分析設計及結果Table5 Design and result of response surface analysis

表6 二次回歸模型的方差分析結果Table6 Variance analysis of quadratic regression model

通過利用Design expert8.0軟件對表5進行回歸分析，得到影響山藥多糖含量的3因素與響應值的標準二次回歸方程模型：

由表6可知，該模型據極顯著（P＜0.01），擬合程度好（失擬項P＞0.05），誤差小，該模型相關系數R2= 0.999 8＞0.9），表明該模型內部試驗點相關。由F值可知，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2極顯著。該二次方程能夠較好擬合真實的響應面，試驗誤差小，可以用此模型對山藥多糖的提取工藝進行分析和預測。

通過回歸方程分析結果作出兩因子交互作用的模型響應面圖，圖直觀地反映各因素對響應曲面的影響，微波功率與酶加量的交互作用圖5，微波功率與酶解時間的交互作用圖6，酶加量與酶解時間的交互作用圖7。

圖5 微波功率與酶加量的交互作用Fig.5 Interaction between microwave power and enzyme concentration

圖6 微波功率與酶解時間的交互作用Fig.6 Interaction between microwave power and enzyme digestion time

圖7 酶加量與酶解時間的交互作用Fig.7 Interaction between enzyme concentration and digestion time

微波功率與酶加量（圖5）的交互作用對山藥多糖提取率影響最大，曲面圖比較陡峭；其次是微波功率與酶解時間液料比與提取時間（圖6）、酶加量和酶解時間（圖7），曲面圖相對較平緩，響應面的分析結果與方差分析結果一致。利用design expert軟件對試驗參數進行典型性分析后，山藥多糖最優(yōu)的提取條件為：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解時間64min。在上述優(yōu)化工藝條件下，經3次重復試驗驗證山藥多糖的提取量達32.42mg/g。

3.3 正交試驗與響應曲面試驗對比分析

通過正交試驗和響應曲面試驗，其優(yōu)化后的工藝參數，兩種試驗設計優(yōu)選結果對比見表7。

表7 兩種試驗設計優(yōu)選結果對比Table7 Comparison of results between Box-Behnken design and orthogonal design

結果表明，響應曲面法方程顯著性比較顯著，說明其擬合成度好，能進一步優(yōu)化山藥多糖提取的工藝參數。提高多糖提取含量，符合實際生產，降低生產成本，因此曲面響應法為最佳提取工藝。

4 結論

以山藥為研究對象，利用微波纖維素酶法提取山藥多糖，在單因素和正交試驗的基礎上，以山藥多糖提取量為指標，采用響應曲面法對山藥多糖提取工藝進行優(yōu)化。與正交試驗相比，響應曲面法考慮各因素水平間的交互作用，其穩(wěn)定性和工作量方面更簡易、科學和合理。通過優(yōu)化的最佳提取條件為：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解時間64min、微波時間50 s，山藥多糖提取量為32.42mg/g。

[1]葛立軍,朱振洪,沙躍,等.正交實驗優(yōu)化復合酶法提取山藥多糖工藝研究[J].時珍國醫(yī)藥,2010,21(12):3187-3188

[2]宋永剛,胡曉波,王震宙.山藥的活性成分研究概況[J].江西食品工業(yè),2007,1(4):45-48

[3]孫鋒,谷文英,丁霄霖.山藥粗多糖的提取工藝[J].食品與生物技術學報,2006,25(3):79-83

[4]Heinecke Jay W.The role of myeloperoxidase in HDL oxidation and atherogenesis[J].Current atherosclerosis reports,2007,6(4):249-251

[5]周梅,王傳洲,李再文,等.基于正交及響應曲面設計的自然煤矸地質聚合物配體優(yōu)化[J].硅酸鹽通報,2013,32(7):1258-1263

[6]謝偉杰,張永萍,徐劍,等.正交設計聯用Box-Behnken效應面法優(yōu)選復方石斛清肺散提取工藝[J].中成藥,2015,37(8):1684-1689

[7]陳少青,蔣旭鋼,汪財生,等.紫山藥多糖超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化性能研究[J].江蘇農業(yè)科學,2009,2(5):231-234

[8]陳惠雪.星點及正交實驗優(yōu)選穿龍薯蕷總皂苷的提取工藝[J].山西中醫(yī)學院學報,2015,16(4):36-38

[9]曾凡梅,張恒,孔明航.超聲波協同纖維素酶提取山藥多糖的工藝及組分測定研究[J].江西食品工業(yè),2010,12(2):32-34

[10]龍菊,黃元射,何映霞.微波協同纖維素酶法提取薯蕷多糖工藝研究[J].湖北農業(yè)科學,2015,54(17):4266-4269

Extracting Process Optimization of Yam Polysaccharide by Orthogonal Test and Response Surface Methodology

LONG Ju，SUN Cui-ying，ZHANG Hong-xia，WANG Jia-shun
（College of Agriculture，Anshun University，Anshun 561000，Guizhou，China）

Yam polysaccharide was extraced by microwave-enzyme synergistic method and its content was determined by the method of phenol-sulfuric acid. Orthogonal test and response surface methodology were used to optimize the extraction of yam polysaccharide based on the results of single factor experiments. The results showed that the best extractive technique conditions were as follows：microwave power 662 W，enzyme concentration 0.2 %，enzyme digestion time 64 min，microwave time 50 s. And the content of extracted yam polysaccharide was 32.42 mg/g under the conditions.

yam polysaccharide；orthogonal design；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.012

2016-05-26

貴州省科學技術廳科學技術基金資助項目（No.黔科合J字LKA[2012]05號、黔科合J字LKA[2013]06、黔教科合KY字[2013] 178號）

龍菊（1983—），女（苗），副教授，碩士研究生，研究方向：食品微生物。