宜春市2011年至2012年乙型流感病毒耐藥基因分析

張紅波，莫尚鵬，陳玉紅，羅 維，熊英，李建雄，徐 燁

(1、宜春市疾病預(yù)防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民醫(yī)院，江西宜春336000)

宜春市2011年至2012年乙型流感病毒耐藥基因分析

張紅波1，莫尚鵬1，陳玉紅1，羅 維1，熊英2，李建雄2，徐 燁3

(1、宜春市疾病預(yù)防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民醫(yī)院，江西宜春336000)

目的分析宜春市2011~2012年B型流感病毒耐藥基因位點(diǎn)，掌握其耐藥情況，為臨床治療和疾病控制提供依據(jù)。方法采集宜春市流感監(jiān)測(cè)醫(yī)院和疑似流感疫情的流感樣病例鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行流感病毒分離，選擇分離到的16株B型流感病毒進(jìn)行核酸提取，采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增病毒NA基因后進(jìn)行基因序列測(cè)定，用DNAStar5.0，Mage3.1生物軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析處理，翻譯出氨基酸序列，進(jìn)行基因特性分析。結(jié)果16株B型流感病毒NA區(qū)域核苷酸序列長度均為1140bp，編碼380個(gè)氨基酸，所有毒株的NA蛋白催化活性位點(diǎn)和輔助位點(diǎn)均未發(fā)生氨基酸替換。結(jié)論16株毒株均對(duì)流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物敏感，我們應(yīng)該繼續(xù)對(duì)流行株耐藥情況進(jìn)行檢測(cè)。

B型流感病毒；耐藥性；NA基因

流行性感冒（influenza，簡稱流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一種傳染性強(qiáng)、傳播速度快的疾病。其主要通過空氣中的飛沫、人與人之間的接觸或與被污染物品的接觸傳播。典型的臨床癥狀是：全身疼痛、急起高熱、乏力顯著和輕度呼吸道癥狀。乙型流行性感冒病毒是引起流感的主要病原之一，目前臨床上用于治療乙型流感的藥物僅限于神經(jīng)氨酸酶抑制劑類的藥物。本研究分析了我市2011至2012年B型流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因特征以及特異性耐藥位點(diǎn)，從分子水平研究我市B型流感的耐藥性特點(diǎn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源采集宜春市流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院流感樣病例或者流感疫情病例咽拭子標(biāo)本。

1.2 病毒分離采用狗腎傳代細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，

根據(jù)細(xì)胞病變結(jié)合微量血凝實(shí)驗(yàn)（HA）來判斷是否有病毒存在。將HA≥1：8的標(biāo)本采用血凝抑制方法（HI）進(jìn)行流感病毒型別鑒定（MDCK和標(biāo)準(zhǔn)血清均由國家流感中心提供）。所有被研究毒株均經(jīng)國家疾控流感中心復(fù)核（所有毒株的毒株號(hào)均下載于國家流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)站）。

1.3 病毒選擇隨機(jī)選擇不同時(shí)間、不同監(jiān)測(cè)醫(yī)院監(jiān)測(cè)標(biāo)本或疫情咽拭子標(biāo)本中分離到的B型流感病毒，共16株病毒進(jìn)行基因擴(kuò)增和測(cè)序。

1.4 病毒RNA提取采用德國Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑對(duì)流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行核酸提取。

1.5 引物

NA-5’[2]BNAF GCAGAAGCAGAGCATATTCTTAG BNAR ATGGACAAATCCTCCCTTGATGC

以上引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成

1.6 RT-PCR擴(kuò)增NA基因采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件[4]：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循環(huán)如下：94℃40s，50℃40s，72℃1min 30s，35次循環(huán)，72℃10min。

1.7 核苷酸序列測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸雙向測(cè)定。

1.8 序列分析采用DNAStar5.0、Mage5.0分析軟件對(duì)NA-5’和NA-3’擴(kuò)增的產(chǎn)物測(cè)序后核苷酸進(jìn)行拼接、同時(shí)分析核苷酸和氨基酸的同源性，以B/ Beijing/1/1997的NA基因序列作為參照分析，收錄號(hào)為M54967。

2 結(jié)果

2.1 基因核苷酸同源性及遺傳進(jìn)化分析16株病毒核酸經(jīng)NA5’和NA3’引物擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)純化、雙向測(cè)序、序列拼接后，均獲得1140bp核苷酸，編碼380個(gè)氨基酸。經(jīng)上述軟件分析，與B/Beijing/1/ 1997進(jìn)行比對(duì)，核苷酸同源性在93.7%～94.8%之間、氨基酸的同源性在92.5%～94.0%之間。在NA基因氨基酸序列的進(jìn)化樹（圖1）上可見我市16株病毒同一分支上，但是這一分支又分為2個(gè)小分支，其中1個(gè)分支是是Yamagata系，另1個(gè)分支是Victoria系。

圖1 NA基因氨基酸進(jìn)化樹

2.2 NA基因耐藥性位點(diǎn)分析根據(jù)測(cè)序的核苷酸序列推導(dǎo)出NA基因的氨基酸序列（圖2），對(duì)NA基因各個(gè)酶催化活性位點(diǎn)（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、R374）氨基酸、輔助位點(diǎn)（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294位）氨基酸進(jìn)行分析，16株毒株全部未發(fā)生替換。對(duì)G141、N144、S249、T325、R374等其他位點(diǎn)進(jìn)行突變分析，也未發(fā)現(xiàn)氨基酸替換的現(xiàn)象。

3 討論

乙型流感一直以來都是困擾我們的日常疾病之一，近年來的一些監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)數(shù)據(jù)均顯示乙型流感病毒所帶來流行和死亡的疾病負(fù)擔(dān)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人們的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)乙型流感病毒平均發(fā)病到死亡的時(shí)間僅僅為3d，短于任何一次流感大流行時(shí)期的病例發(fā)病到死亡的時(shí)間，另外目前國內(nèi)某些藥物的不規(guī)范使用也是一個(gè)原因，人們應(yīng)對(duì)乙型流感病毒予以更多的重視及關(guān)注。

從我市近年流感病毒分離情況來看，主要為甲型流感病毒，同時(shí)出現(xiàn)少量乙型流感病毒[7]，乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系共同流行。乙型流感的治療主要依賴于神經(jīng)氨酸酶抑制劑（NAIs），病毒神經(jīng)氨酸酶為藥物作用靶點(diǎn)，不僅因?yàn)椴《旧窠?jīng)氨酸酶在病毒傳播流行中發(fā)揮著重要作用，而且神經(jīng)氨酸酶的酶催化活性位點(diǎn)氨基酸及周圍的輔助位點(diǎn)氨基酸及其保守。流感病毒神經(jīng)氨酸酶主要的七個(gè)氨基酸（N2 Numbering）（R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292、R-371）作為酶催化活性位點(diǎn)直接作用于底物或作為維持其功能的重要因素，而其他十個(gè)氨基酸（E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、1-222、E-227、H-274、E-277、N-294）作為輔助位點(diǎn)，神經(jīng)氨酸酶抑制劑作用于其催化活性位點(diǎn)或者輔助位點(diǎn)[10]，可以有效阻斷流感病毒的感染、復(fù)制及傳播過程。人們對(duì)于NA抑制劑的耐藥性的研究大多數(shù)集中在甲型流感病毒，而對(duì)于乙型流感病毒相關(guān)研究進(jìn)行的較少，盡管甲型流感病毒和乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶序列是不同的（一致情況僅20%~30%），但它們的活化位點(diǎn)的殘基及三維結(jié)構(gòu)是保守的，因此神經(jīng)氨酸酶抑制劑的作用機(jī)制是相同的。

距今美國FDA批準(zhǔn)的NAIs有Oseltamivir和Zanamivir，Oseltamivir2002年在我國注冊(cè)，隨著NAIs臨床的使用，將不可避免的出現(xiàn)耐藥株。Gubareva LV[12]等1998年報(bào)道從免疫功能低下的兒童標(biāo)本中分離到在神經(jīng)氨酶酶活性位點(diǎn)R152K（N2 numbering）突變的對(duì)Zanamivir耐藥的乙型流感病毒；之后許多研究人員從臨床研究中發(fā)現(xiàn)分離自NAIs治療的病人標(biāo)本的流感病毒出現(xiàn)D198N、I222T、H274Y、N294S位點(diǎn)以及E105K、G109E、E110K、S250G、G402S等其他位點(diǎn)的突變[13-15]，而一些監(jiān)測(cè)研究[16，17]也發(fā)現(xiàn)了流感病毒R371K、I222T、H274Y、D198E、D198Y、I222T/V位點(diǎn)以及R325I、G142R、N146K等其他位點(diǎn)的突變；而體外藥敏實(shí)驗(yàn)研究[18-20]發(fā)現(xiàn)了流感病毒R152K、R292K、E119A、E119D、E119G、E119V、D198N、

I222T位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)NAIs的敏感性降低。這些研究都提示乙型流感NA的耐藥位點(diǎn)的多樣性和耐藥病毒株越來越多的涌現(xiàn)，我國在2010～2011年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4株對(duì)Oseltamivir耐藥的I222T突變株，以及1株對(duì)Oseltamivir和Zanamivir耐藥的D198N突變株[20]。

雖然本次研究尚未發(fā)現(xiàn)NA基因耐藥位點(diǎn)的變異，為了我市人民的身體健康，乙型流感的耐藥監(jiān)測(cè)必須長期開展下去，也為我市流感的預(yù)防和控制提供數(shù)據(jù)支持。

圖2 NA蛋白氨基酸序列

[1]郭元吉，程小雯.流行性感冒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國三峽出版社，1997：1-43.

[2]WHO.Information for laboratory diagnosis of pandemic(H1N1) 2009 virus in humans-evised[S].WHO.2009.

[3]WHO.Information for molecular diagnosis of influenza virus in humans-update[S].2011.

[4]熊英，鄒明霞，龔甜，等.2004-2006年江西省乙型流感病毒HA1基因特性分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(2)：211-213.

[5]魏雄杰，陳玉紅，吳紹武，等.宜春市2011-2013年乙型流感病毒HA1基因特性分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，26(4)：549-552.

[6]熊英，龔甜，李建雄，等.江西省2009-2012年B型流感病毒耐藥基因分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24(15)：2232-2234+2259.

[7]陳玉紅，魏雄杰，黃秋艷.宜春市2013年流感病毒檢測(cè)結(jié)果分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，32(6)：793-794+799.

[8]Burnham AJ，Baranovich T，Govorkova E，et al.Neuraminidase inhibitors for influenza B virus infection[J].Antiviral Res，2013，100 (2)：520-534.

[9]Paddock CD，Liu L，Denison AM，et al.Myocardial injury and bacterial pneumonia contribute to the pathogenesis of fatal influenza B virus infection[J].J Infect Dis，2012，205(15)：895-905.

[10]Colman PM，Varghese JN，Laver WG.Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase[J].Nature，1983，303(5912)：41-44.

[11]Hatakeyama S，Sugaya N，Ito M，et al.Emergence of influenza B viruses with reduced sensitivity to neuraminidase inhibitors[J]. JAMA，2007，297(13)：1435-1442.

[12]Gubareva LV，Matrosovich MN，Brenner MK，et al.Evidence for zanamivir resistance in an immunocompromised child infected with influenza B virus[J].J Infect Dis，1998，178(5)：1257-1262.

[13]Higgins RR，Beniprashad M，Chong-King E，et al.Recovery ofinfluenza B virus with the H273Y point mutation in the neuraminidase active site from a human patient[J].J Clin Microbiol，2012，50(7)：2500-2502.

[14]Carr S，Ilyushina NA，F(xiàn)ranks J，et al.Oseltamivir-resistant influenza A and B viruses pre-and postantiviral therapy in children and young adults with cancer.Pediatr[J].Infect Dis J，2011，30(4)：284-288.

[15]Fujisaki S，Takashita E，Yokoyama M，et al.A single E105K mutation far from the active site of influenza B virus neuraminidase contributes to reduced susceptibility to multiple neuraminidaseinhibitor drugs[J].Biochem Biophi Res Co，2012，429(12)：51-56.

[16]Sheu TG，Deyde VM，Okomo-Adhiambo，et al.Surveillance for neuraminidase inhibitor resistance among human influenza A and B viruses circulating worldwide from 2004 to 2008[J].Antimicrob. Agents Ch，2008，52(9)：3284-3292.

[17]Wang D，Sleeman K，Huang W，et al.Neuraminidase inhibitor susceptibility testing of influenza type B viruses in China during 2010 and 2011 identifies viruses with reduced susceptibility to oseltamivir and zanamivir[J].Antiviral Res，2013，97(3)：240-244.

[18]Hatakeyama S，Ozawa M，Kawaoka Y.In vitro selection of influenza Bviruses with reduced sensitivity to neuraminidase inhibitors[J].Clin Microbiol Infect，2011，17(9)：1332-1335.

[19]Jackson D，Barclay W，Zurcher T.Characterization of recombinant influenza B viruses with key neuraminidase inhibitor resistance mutations[J].J Antimicrob Chemother，2005，55(2)：162-169.

[20]Cheam AL，Barr IG，Hampson AW，et al.In vitro generation and characterisation of an influenza B variant with reduced sensitivity to neuraminidase inhibitors[J].Antiviral Res，2004，63(3)：177-181.

Analysis of drug resistance gene in influenza B virus in Yichun from 2011 to 2012

ZHANG Hongbo，MO Shangpeng，CHEN Yuhong，et al.Center for Disease Control and Prevention of Yichun City，Yichun Jiangxi 336000，China.

Objective To understand the molecular characterization of neuraminidase(NA)genes and NA drug resistance of influenza B virus in YiChun from 2011 to 2012.Methods The specimens of nasopharyngeal swabs were collected from influenza like cases of monitor hospitals and influenza epidemic situation.16 strains of influenza B virus were randomly selected for detection and extract virus RNA from the specimens.Fragments of NA genes were amplified by one-step RT-PCR and then were sequenced.The data obtained were analyzed with the software DNAStar5.0 and Mage3.1.Results The nucleotides of NA gene of 16 strains were all 1140bp which encoded 380 amino acids.All strains had no mutation in catalytic residues and framework residues of NA gene.Conclusions All virus were sensitive to neuraminidase inhibitors，however continuous resistance surveillance is necessary for control and prevention influenza.

Influenza B virus；Resistance；NA gene

R446.5，Q939.92，R373.1+3

A

1674-1129(2017)01-0049-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.015

2016-07-22；

2017-01-11)

張紅波，1984年生，男，學(xué)士學(xué)位，主管技師，主要從事微生物及病毒的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)工作

徐燁，1985年生，女，學(xué)士學(xué)位，主管技師，主要從事臨床分子分型檢測(cè)工作。E-mail：233270758@qq.com