兔椎間盤退變體內(nèi)模型建立的最新進展

俞佳斌，王宸，王善正，陳翔溆，馬良彧，賈軍，郭玉冬，馬雪倩

(1.東南大學 醫(yī)學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009；3.浙江大學 醫(yī)學院，浙江 杭州 310029)

兔椎間盤退變體內(nèi)模型建立的最新進展

俞佳斌1，王宸2，王善正2，陳翔溆2，馬良彧1，賈軍1，郭玉冬2，馬雪倩3

(1.東南大學 醫(yī)學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009；3.浙江大學 醫(yī)學院，浙江 杭州 310029)

椎間盤退變模型是研究椎間盤退變的病因和治療的基礎。目前兔是最適合構建椎間盤退變模型的動物，它具有操作簡單、飼養(yǎng)方便、價格合適、可重復性好等優(yōu)點。兔椎間盤退變體內(nèi)模型建立的方式主要分為異常應力模型、機械損傷模型以及化學損傷模型三大類。本文作者綜述了最近關于兔的椎間盤退變體內(nèi)模型的建立方法，并介紹各個模型退變的特點，以便于后期實驗能更好的來選擇椎間盤退變模型。

椎間盤退變； 兔； 模型建立; 綜述

椎間盤(intervertebral disk)是脊柱中連接兩個相鄰椎體的纖維軟骨盤，其中央部為富含彈性膠狀物質(zhì)的髓核(nucleus pulposus)，周圍部是由多層纖維軟骨環(huán)按同心圓排列而成的纖維環(huán)(annulus)。椎間盤具有承受壓力、緩沖震蕩沖擊、保護脊髓等作用。椎間盤的退變與病變往往會引起一系列的臨床癥狀，也是引起下腰痛最主要的原因之一。長期以來，盡管研究者對椎間盤退變做了大量的研究，但到目前為止，椎間盤疾病的發(fā)病原理依然不十分清楚，這對于研究者和臨床醫(yī)生都是一個重大的挑戰(zhàn)。良好的動物模型的建立，可以最大限度地復制臨床上椎間盤退變的各種組織病理學的發(fā)生發(fā)展與轉歸，是探索這一問題事半功倍的方法，為此研究者嘗試做出了多種動物模型來探索椎間盤病變的潛在的機制[1]。

目前，被用來建立椎間盤退變模型的實驗動物包括羊[2]、豬[3]、狗[4]、小鼠[5]等，每一種各有其優(yōu)缺點。綜合考量實驗成本、操作難度、成功率、復制病變的相似程度等問題，采用兔作為實驗動物具有更大的優(yōu)勢。相對于其他大型動物，如羊、豬、狗而言，兔的成本低廉，容易獲得，實驗條件要求不高。而與大鼠和小鼠相比，兔的體型比較適合，容易操作，建模成功率高[6]。因此，兔是目前建立椎間盤退變模型中最常用的實驗動物。

常見的兔椎間盤退變模型按照其建立方式主要分為異常應力模型、機械損傷模型以及化學損傷模型三大類。

1 異常應力模型

脊柱的異常應力和椎間盤退變之間有一定聯(lián)系[7]。異常應力模型是指對兔椎間盤施加異常的應力，其應力超過了椎間盤原本的生理負荷，引起椎間盤結構和細胞的一系列的改變，最終導致椎間盤的退變。許多動物模型的研究也分析了應力和椎間盤退變的關系[8]。

1.1 軸向加壓模型

Kroeber等[9]在兔的L4和L5上打入2根克氏針，再接入加壓裝置，給予兔5倍質(zhì)量的恒定的力加壓，分別持續(xù)7、14、28 d以及持續(xù)28 d后，再撤銷加壓，自愈28 d后與假手術組對比。通過X線攝片、組織及細胞病理切片的觀察發(fā)現(xiàn)，隨著持續(xù)時間的增加，兔椎間盤高度逐漸降低，退變逐漸加重，得出軸向加壓裝置可以高效誘發(fā)椎間盤退變。之后，Kroeber等[10]繼續(xù)給椎間盤退變的兔加了一個拉伸力，與撤銷壓力的兔子相比，加上拉伸力之后的兔椎間盤高度增加，退變明顯緩解，說明應力所導致的椎間盤退變是可逆的。Huang等[11]也創(chuàng)建了軸向加壓裝置，最終也導致兔椎間盤不同程度的退變。

1.2 剪切應力模型

Xia等[8]給兔裝上了剪切力裝置，該裝置通過4根基于實驗動物脊柱樣式的3D模型的不銹鋼直接連于兔子的L4/L5椎體上，并沒有通過克氏針。此外，該裝置上還有1個帶刻度的彈簧，能提供固定的壓力，使L4/L5產(chǎn)生一個恒定50 N的剪切力，分別持續(xù)1、2個月，并與假手術組及未手術組比較，通過X線、磁共振成像(MRI)及組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)隨著持續(xù)時間的增加，兔椎間盤高度逐漸降低，退變逐漸加重，鄰近椎間盤也出現(xiàn)不同程度的退變。

1.3 脊柱融合模型

脊柱融合模型是指通過固定相鄰階段的脊柱來使椎間盤產(chǎn)生退變。當某2個節(jié)段融合固定后，本應發(fā)生在固定節(jié)段的活動將被分配到上下2個節(jié)段，導致鄰近節(jié)段的活動度增加，椎間盤壓力增大，從而導致鄰近椎間盤的退變。許斌等[12]使用鋼絲對L4- L6行8字內(nèi)固定，然后用骨水泥包裹鋼絲，即融合L4- L6。結果顯示,3個月后L3到L4椎間盤即有退變，退變程度為Miyamoto 2級，至6個月時退變更加明顯，達到Miyamoto 3級。

1.4 脊椎不穩(wěn)模型

脊柱的生物力學穩(wěn)定性是指脊柱在生理載荷下不出現(xiàn)異常改變，這種穩(wěn)定性是由脊柱各個部分的合作而完成，任何部分的損傷或者缺損都可能破壞脊柱的穩(wěn)定性。而破壞脊椎穩(wěn)定性后，會造成椎間盤的受力不平衡，從而導致退變。有許多研究者建立了脊椎不穩(wěn)而導致椎間盤退變的模型。呂存賢等[13]從兔腰3棘突至腰6棘突，沿著棘突兩側切斷髂棘肌附著，沿棘突、椎板行骨膜下剝離，顯露棘突、椎板和關節(jié)突，切除腰3～6棘間、棘上韌帶及兩側關節(jié)突關節(jié)外1/2，造成椎間失穩(wěn)。創(chuàng)口愈合后，給兔背部加壓1/10體質(zhì)量物品2 h。對照組切開皮膚后直接縫合。術后用MRI及組織切片評估，顯示術后2個月后兔椎間盤出現(xiàn)明顯退變。

2 機械損傷模型

椎間盤是人體最大的無血管組織，屬于完全封閉的免疫豁免器官，由內(nèi)層的髓核、外層的纖維環(huán)及上下軟骨終板構成。破壞其密閉環(huán)境會導致一系列的變化，總體表現(xiàn)為組織脫水，進而纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙、終板軟骨骨化、纖維環(huán)斷裂以及最終髓核脫出，從而導致椎間盤退變。

2.1 纖維環(huán)損傷

纖維環(huán)由平行排列的膠原纖維組成[14]，最早在20世紀40年代Key等就用手術刀切開動物的纖維環(huán)成功誘導椎間盤退變。Masuda等[15]首先提出使用纖維環(huán)穿刺，用16 G、18 G及21 G的針頭刺入椎間盤5 mm，并與傳統(tǒng)的刀片損傷纖維環(huán)進行比較，最后對實驗動物分別使用X線、組織形態(tài)學及MRI評估，發(fā)現(xiàn)所有進行椎間盤穿刺的模型均造成了椎間盤的退變，并較刀片損傷纖維環(huán)模型的退變更為平緩。

因為椎間盤穿刺法對兔子的損傷較小，椎間盤退變的過程較為平緩，不破壞肌肉等其他組織，與人類的椎間盤退變更類似，且無須注入任何外來物品，對后續(xù)的生物化學指標檢測不會產(chǎn)生影響，所以其使用更為廣泛，發(fā)展更為迅速。近來通過微創(chuàng)手術來構建椎間盤退變模型成為熱點。蔣新華等[16]在透視引導下使用18 G穿刺針進至椎間盤中心，維持5 s，術后使用X線、病理學檢查及MRI掃描，并測定T2WI信號強度,發(fā)現(xiàn)穿刺后0～2周椎間盤迅速退變，2周后基本穩(wěn)定，退變緩慢。Zhou等[1]在CT引導下建立椎間盤退變模型;Kim等[17]在C臂機引導下建立，相比于CT引導，C臂機建模時間短，價格低廉，性價比更高。

手術切開暴露椎間盤有許多種手術入路，比如椎旁入路[18]、腹膜后入路[15,19- 20]、經(jīng)腹前外側入路[15]。切開暴露相比于透視下穿刺需要更多的時間、精力及花費。切開手術對于實驗動物會產(chǎn)生嚴重的壓力，從而導致死亡率的增高。賀慶等[21]比較經(jīng)皮纖維環(huán)穿刺及經(jīng)肌間隙纖維環(huán)刀刺建立兔椎間盤退變模型發(fā)現(xiàn),經(jīng)皮纖維環(huán)穿刺較經(jīng)肌間隙纖維環(huán)刀刺操作簡單，對兔損傷較小，感染率低，兔癱瘓幾率低，手術時間短，存活率高，4周及8周時退變程度輕，退變較為緩慢。

2.2 終板損傷

終板位于椎體中心的松質(zhì)骨和椎間盤之間，是椎間盤的上下邊界，由厚約0.5 mm的軟骨下骨和厚度相同的覆蓋其上的軟骨組成。其主要作用是防止椎間盤髓核組織嵌入椎體，同時具有平衡分散應力的作用。終板也是椎間盤與外界進行營養(yǎng)運輸及廢物輸出的通道。隨著年齡的增長，終板開始慢慢地礦化，繼而阻止椎間盤營養(yǎng)運輸及廢物輸出，從而導致椎間盤退變[22],而外界干預損傷終板能導致椎間盤提早退變。呂浩然等[23]使用自制的弧形針對終板進行多點、多角度的穿刺，術后行X線及MRI顯示進行穿刺的椎間盤較未進行穿刺的椎間盤椎體高度降低，椎體前緣出現(xiàn)唇緣樣增生，T2加權像信號降低，椎間盤出現(xiàn)退變。Hou等[20]在CT透視下將骨穿針刺入椎間盤的上終板，一組緩慢地注入1 ml平陽霉素，另一組緩慢地注入1 ml生理鹽水，手術后第4周開始進行MRI和病理學檢查發(fā)現(xiàn)信號降低和骨細胞損傷，而DSA檢查發(fā)現(xiàn)毛細血管出現(xiàn)損傷，第5周開始典型的椎間盤退變癥狀開始出現(xiàn)。終板的損傷導致椎間盤內(nèi)營養(yǎng)的供給及廢物的代謝障礙，同時終板的損傷破壞了椎間盤的免疫隔絕，髓核暴露于免疫系統(tǒng)中，進而激發(fā)自身的免疫反應，導致髓核細胞的凋亡和椎間盤的退變。此方法導致的椎間盤退變發(fā)生時間相比于破壞關節(jié)突、纖維環(huán)切開等方法明顯延遲，退變更為平緩。

2.3 髓核抽吸

目前椎間盤髓核細胞的減少被認為是椎間盤退變的主要也是最直接原因，造成這種現(xiàn)象是由于細胞的增殖減慢、凋亡增加。隨著年齡的增長，細胞增殖能力減弱，組織修復能力下降[24]。健康的椎間盤受到壓力時，含水量高的髓核由于液體的各相同性，靜水壓將壓力均勻傳遞到纖維環(huán)，避免應力集中[25]。當髓核中含水量減少或者髓核細胞減少時，壓力無法均勻傳遞，導致應力集中、纖維環(huán)的損傷和破裂。白亦光等[26]利用21 G穿刺針在兔L3- L4、L4- L5、L5- L6節(jié)段抽取髓核組織，與只暴露不抽吸的兔子相比在4周后椎間盤高度降低，髓核細胞減少，形態(tài)不規(guī)則，分布不均勻，纖維軟骨組織出現(xiàn)增生，排列紊亂。8周后椎體周圍出現(xiàn)骨贅，纖維環(huán)結構紊亂，髓核失去凝膠狀態(tài)，隨著時間的延長MRI T2加權像信號逐漸降低，退變逐漸加重。邵輝等[27]使用16 G穿刺針對纖維環(huán)穿刺抽吸髓核，抽吸L3- L4、L4- L5、L5- L6椎間盤髓核，穿刺組也同樣在4周后出現(xiàn)了退變。由此可見髓核抽吸后，椎間盤發(fā)生了退變，其退變可能與髓核被抽吸后髓核內(nèi)壓力降低及應力重新分布有關。髓核抽吸建立椎間盤退變模型相較于纖維環(huán)穿刺及終板損傷退變時間更早，進程較快，退變程度較重，當研究者需要迅速得到一個椎間盤完全退變模型時可采用此方法。

3 化學損傷

近年來，向椎間盤內(nèi)注入藥物促使椎間盤退變的研究也有了較大的進展，化學損傷可以避免損傷纖維環(huán)、椎板及周圍正常的組織，又可以更好地模仿人類椎間盤退變的過程，生物化學方面更接近[28]。目前，主要向椎間盤內(nèi)注入的是酶類物質(zhì)，比如木瓜凝乳蛋白酶、軟骨酶素ABC、纖連蛋白，從而造成髓核細胞的變性、死亡，導致椎間盤的退變。

3.1 木瓜凝乳蛋白酶

木瓜凝乳蛋白酶早期被用于椎間盤突出的髓核的溶解，將木瓜凝乳蛋白酶注入退變突出的椎間盤內(nèi)，可水解髓核中的軟骨蛋白多糖而釋放出結合水和更小的糖胺聚糖，從尿中排出而降低髓核內(nèi)的壓力，髓核逐步被溶解[29]。于是有研究者將其注入椎間盤，造成椎間盤的退變。Gullbrand等[30]將椎間盤及椎間盤兩端的椎骨從脊柱上分離下來形成一個節(jié)段，用27 G穿刺針穿刺椎間盤將100 μl生理鹽水及濃度不同的木瓜凝乳蛋白酶注入髓核，質(zhì)量濃度分別為3、15、100 U·ml-1，將脊柱節(jié)段用生理鹽水浸泡的紗布包裹置于室溫15 h使其完全作用，最后通過MRI及組織學檢測發(fā)現(xiàn)木瓜凝乳蛋白酶組蛋白多糖及水的含量減少，T2加權像信號降低，并發(fā)現(xiàn)注入3 U·ml-1的木瓜凝乳蛋白酶較15 U·ml-1的退變更為輕微，而100 U·ml-1的退變較為嚴重。

3.2 軟骨酶素ABC

軟骨酶素是由Yamagat等[31]在1968年從普通變形桿菌中提取出來的一種多糖酶，它可以選擇性地降解蛋白多糖中的透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素，而對角蛋白硫酸酯、肝素及肝素硫酸酯無作用，與木瓜凝乳蛋白酶相比軟骨酶素ABC能最小限度地減少對周圍組織的損傷。

Imai等[32]將軟骨酶素ABC和多糖混合注入兔椎間盤，每隔2周行1次X線檢查，在注射后6、8、12及16周后處死兔行組織學和生物化學分析發(fā)現(xiàn)，軟骨酶素ABC和多糖混合組的兔從第2周開始就有退變的產(chǎn)生，退變隨著時間的延長而加重。

3.3 纖連蛋白

纖連蛋白是一種能與細胞基質(zhì)中多種成分結合并促進其沉淀的大的纖維狀糖蛋白。在兔正常椎間盤中幾乎無Fn- f片段存在，而在退變的椎間盤中則成倍增加[33]。王娜等[34]在透視引導下使用30 G針頭向椎間盤內(nèi)注入N端30 kDa Fn- f，F(xiàn)n- f存在于退變的椎間盤之中，而正常的椎間盤中幾乎無Fn- f的存在，而且30 G 的針頭排除了手術及針刺創(chuàng)傷對椎間盤造成其他影響。最終在8周時注入Fn- f的椎間盤開始出現(xiàn)退行性變化，髓核和纖維環(huán)的結構出現(xiàn)進行性丟失，到16周時部分的髓核出現(xiàn)了壞死。這個模型更符合椎間盤退變的生物化學特性，退變較為緩慢，與其他方法相比更接近于椎間盤退變的進程。Liu等[35]向兔椎間盤中注入Fn- f得到了相同的結果。

4 總 結

建立一個好的椎間盤退變動物模型應該包含幾個注意事項：首先實驗動物要能較好地模仿人體內(nèi)椎間盤退變的過程；其次實驗動物要容易獲得，而且它應該有一個合適的體型，允許手術建模時較為方便地接觸到椎間盤；最后椎間盤退變的發(fā)生應該是可靠的，而且要具有較好的重復性[36]。一個好的動物模型能給后續(xù)的研究提供良好的幫助，盡管目前我們已經(jīng)有了這么多類型的椎間盤退變模型，但這些模型都是單一的模擬椎間盤其中一個退變機制，椎間盤退變是由于椎間盤組織內(nèi)髓核細胞數(shù)目減少[37]、細胞外基質(zhì)成分改變[38]、局部調(diào)節(jié)及炎癥小分子影響[39]等因素綜合作用下所致。目前，纖維環(huán)穿刺法適用最廣，終板損傷模型造模難度較高，髓核抽吸法造成的椎間盤退變較為迅速，而化學損傷法可能會影響后續(xù)生化指標檢測的準確性。椎間盤的退變往往是由多個因素引起的，所以我們需要一個具有多種混雜因素、更能模擬椎間盤退變，而且操作簡單、重復性好的模型，這就需要我們在日后的實驗中進一步探索和研究。

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2016- 11- 22

2017- 05- 05

國家自然科學基金資助項目(81572188)

俞佳斌(1992-)，男，江蘇蘇州人，在讀碩士研究生。E- mail:jiabinyumed@163.com

王宸 E- mail:101008139@seu.edu.cn

俞佳斌,王宸,王善正,等.兔椎間盤退變體內(nèi)模型建立的最新進展[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2017，36(4)：656- 660.

R- 332; R681.53

A

1671- 6264(2017)04- 0656- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.033