電針對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Netrin-1受體DCC的影響※

杜 旭 王瑞輝 王鵬利 王 宇 張兆星 陳超朝 劉雯雯

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，咸陽712046）

電針對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Netrin-1受體DCC的影響※

杜 旭 王瑞輝 王鵬利 王 宇 張兆星 陳超朝 劉雯雯

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，咸陽712046）

目的探討電針對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)導(dǎo)向因子Netrin-1受體DCC的影響。方法SD大鼠70只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（10只）、假手術(shù)組（20只）、模型對(duì)照組（20只）和電針治療組（20只）。后兩組大鼠右坐骨神經(jīng)橫斷后即刻端對(duì)端縫合。電針治療組取“環(huán)跳”、“足三里”進(jìn)行治療，每天1次，每次15分鐘，7天1個(gè)療程，連續(xù)治療2個(gè)療程。每療程結(jié)束后應(yīng)用免疫組化法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段N etrin-1受體DCC的表達(dá)變化。結(jié)果電針治療組大鼠與模型對(duì)照組比較，損傷坐骨神經(jīng)、相應(yīng)脊髓段DCC在第一療程后表達(dá)均增強(qiáng)，后兩療程后有所降低，但前者始終強(qiáng)于后者，有非常顯著性差異(P＜0.01)，且兩組始終都強(qiáng)于空白對(duì)照組和假手術(shù)組，也有非常顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)論電針治療能增強(qiáng)損傷的坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段中Netrin1受體DCC的表達(dá)，可能是其治療周圍神經(jīng)損傷的機(jī)制之一。

電針；坐骨神經(jīng)損傷；神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Netrin-1；受體DCC；痹證；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；環(huán)跳；足三里

周圍神經(jīng)損傷，是指周圍神經(jīng)干或其分支受到外界直接或間接力量作用而發(fā)生的損傷，屬祖國醫(yī)學(xué)“痿證”“痹證”等范疇，處于臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病針灸病譜中第三位[1]。目前本病困擾醫(yī)患的問題是治療后神經(jīng)功能的恢復(fù)不能令人滿意[2]，但有研究表明，電針療效顯著，可促使患者肢體神經(jīng)功能的恢復(fù)[3-5]。在周圍神經(jīng)損傷后極其復(fù)雜的修復(fù)再生過程中，軸突的修復(fù)至關(guān)重要。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，引導(dǎo)損傷的軸突向正確的方向和途徑延伸的神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Netrin-1，在電針干預(yù)下表現(xiàn)出了和神經(jīng)功能恢復(fù)的相關(guān)性[6]。但其下游因子，如其受體DCC等的研究還鮮見報(bào)道。因此，本文擬從此方面繼續(xù)進(jìn)一步探究電針治療周圍神經(jīng)損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重200士20 g，70只，西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK（陜）2007-001）。動(dòng)物隨機(jī)分成空白對(duì)照組（10只）、假手術(shù)組（20只）、模型對(duì)照組（20只）和電針治療組（20只）。

1.2 模型制作大鼠10%水合氯醛(0.3ml/100 g)腹腔注射麻醉。行右后肢背側(cè)縱切口，無菌條件下暴露并游離坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下10 mm處將其銳性橫斷，兩斷端用10-0顯微縫合絲線端對(duì)端縫合外膜3針，保持吻合口無張力，分層縫合肌肉和皮膚。造模后見大鼠右側(cè)后肢無自主活動(dòng)，不能支撐身體，右膝、踝、趾各關(guān)節(jié)不能屈曲而下垂，移動(dòng)依賴其他肢體拖動(dòng)，標(biāo)志造模成功。

1.3 處理方法電針治療組術(shù)后第2日，取“環(huán)跳”（后肢髖關(guān)節(jié)后上緣）、“足三里”（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm），以0.19 mm×10 mm針灸針進(jìn)針0.5 mm，以G6805-2型電針機(jī)，采用疏密波，頻率為5 Hz治療，強(qiáng)度以肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為度，每天1次，每次15 min，7天1個(gè)療程，療程間隔1天，共治療2個(gè)療程；其他組不做治療，但與電針治療組同樣進(jìn)行動(dòng)物模擬抓取。

1.4 標(biāo)本制備每1療程結(jié)束后當(dāng)天，將各組10只大鼠以過量水合氯醛深度麻醉，取其坐骨神經(jīng)（縫合處近、遠(yuǎn)端各約1 cm，共約2 cm）和相應(yīng)節(jié)段脊髓（L4～L6段，約2 cm）組織。

1.5 免疫組化檢測(cè)將所取組織固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)縱（坐骨神經(jīng)）、橫（脊髓）切片（片厚5 μm），SP法常規(guī)染色。免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。每組10例，每例檢測(cè)3張切片，采用采用Zeiss ImergerA1顯微鏡和DXM1200FCCD圖像采集系統(tǒng)觀察并照相，光鏡下DCC陽性反應(yīng)物為突出背景的棕黃色顆粒，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus5.1測(cè)定其積分光密度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)冰上所取組織用冰凍生理鹽水沖洗，迅速置于液氮中保存后，轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。試劑和儀器RNA提取試劑盒，cDNA合成試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Quantitative real-time PCR）Super Mix試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），7500型RT-PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司），Nanodrop 2000C型核酸測(cè)定儀（美國Thermo公司）。引物設(shè)計(jì)與合成（武漢昆泰銳生物技術(shù)有限公司），DCC上游引物序列為：5’-CCACCCTTCCCAAGACTCAT-3’，下游引物序列為：5’-AAACTCGCCATTTGTTCGCT-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為181bp。內(nèi)參β-actin上游引物序列為：5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3’，下游引物序列為：5’-CACACAGAGTACTTGCGCTC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為238 bp。按RNA試劑盒抽提總mRNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)熱50℃2 min，預(yù)變性95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)的表達(dá)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS19.0 forwindows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行Oneway-ANOVA分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)模型對(duì)照組與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較，大鼠損傷的坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段中DCC積分光密度在第一療程后達(dá)到高峰后降低，但仍高于后兩組，都有非常顯著性差異(P＜0.01)。電針治療組與模型對(duì)照組比較，也在第一療程后達(dá)到高峰后降低，但均強(qiáng)于后者，也都有非常顯著性差異(P＜0.01)（見表1、2）。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)模型對(duì)照組與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較，大鼠損傷的坐骨神經(jīng)中DCC表達(dá)在第一療程后達(dá)到高峰后降低，但仍高于后兩組，有非常顯著性差異(P＜0.01)。電針治療組與模型對(duì)照組比較，也在第一療程后達(dá)到高峰后降低，且均強(qiáng)于后者，也有非常顯著性差異(P＜0.01)（見表3、4）。

表1 大鼠坐骨神經(jīng)DCC蛋白免疫組化積分光密度（IOD）比較（±s）

表1 大鼠坐骨神經(jīng)DCC蛋白免疫組化積分光密度（IOD）比較（±s）

注：與空白對(duì)照組、假手術(shù)組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，★表示P＜0.05，★★表示P＜0.01。（下同）

組別n第1療程（7 d）第2療程（15 d）空白對(duì)照組假手術(shù)組模型對(duì)照組電針治療組10 10 10 10 10321.55±785.54 10249.66±899.61 31041.25±2618.56▲▲38098.28±3094.65★★10479.54±852.21 10586.12±698.45 18786.47±1563.06▲▲29520.36±1809.39★★

表2 大鼠脊髓DCC蛋白免疫組化積分光密度（IOD）比較（±s）

表2 大鼠脊髓DCC蛋白免疫組化積分光密度（IOD）比較（±s）

組別n第1療程（7 d）第2療程（15 d）空白對(duì)照組假手術(shù)組模型對(duì)照組電針治療組10 10 10 10 5208.77±368.15 5520.32±298.65 10654.09±961.81▲▲15003.22±1004.37★★5610.23±305.01 5126.60±198.50 9779.58±754.07▲▲11650.02±995.27★★

表3 大鼠坐骨神經(jīng)DCC基因相對(duì)表達(dá)比較（±s）

表3 大鼠坐骨神經(jīng)DCC基因相對(duì)表達(dá)比較（±s）

組別n第1療程（7 d）第2療程（15 d）空白對(duì)照組假手術(shù)組模型對(duì)照組電針治療組10 10 10 10 1.00±0.02 1.00±0.03 1.45±0.04▲▲2.41±0.04★★1.00±0.03 1.00±0.01 1.24±0.05▲▲1.87±0.03★★

表4 大鼠脊髓DCC基因相對(duì)表達(dá)比較（±s）

表4 大鼠脊髓DCC基因相對(duì)表達(dá)比較（±s）

組別n第1療程（7 d）第2療程（15 d）空白對(duì)照組假手術(shù)組模型對(duì)照組電針治療組10 10 10 10 1.00±0.02 1.00±0.01 1.35±0.07▲▲2.59±0.04★★1.00±0.02 1.00±0.03 1.18±0.05▲▲1.98±0.03★★

3 討論

周圍神經(jīng)的修復(fù)再生極其復(fù)雜，影響因素眾多，且相互關(guān)系微妙，目前鮮有關(guān)于電針和周圍神經(jīng)損傷再生修復(fù)的關(guān)鍵——軸突再生修復(fù)的研究[6]。而Cajal 1928年就發(fā)現(xiàn)“神經(jīng)趨向性”：即神經(jīng)生長(zhǎng)突在發(fā)育、再生修復(fù)過程中，會(huì)受到來自外周組織釋放的某些化學(xué)物質(zhì)方向性的引導(dǎo)。目前已證實(shí)有四種重要的軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向分子家族：Slits、Netrins、Ephrins和Semaphorins[7]。其中Netrins是唯一長(zhǎng)程性吸引性導(dǎo)向因子，是一類由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中線底板分泌的蛋白，吸引性受體為DCC（Deleted colorectal cancer，結(jié)腸癌缺失蛋白）[8、9]。Netrin在眾多物種的神經(jīng)系統(tǒng)均表達(dá)，神經(jīng)軸突有促進(jìn)生長(zhǎng)錐生長(zhǎng)與誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐遷移的作用，缺乏Netrin將使本應(yīng)向中線生長(zhǎng)的神經(jīng)軸突發(fā)生方向性錯(cuò)誤[10]。Netrin-1在成年大鼠脊髓神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)，且大多數(shù)不是以自由的可溶性分子存在，而是與細(xì)胞膜或細(xì)胞外基質(zhì)相聯(lián)系的非擴(kuò)散性分子，主要富含于軸突周圍髓鞘及軸膜上[11]。研究還發(fā)現(xiàn)netrin-1mRNA在正常大鼠坐骨神經(jīng)中表達(dá)水平較低，坐骨神經(jīng)橫斷性損傷2周后表達(dá)水平明顯升高[12]。這與我們前期研究成果基本一致[6]。而Netrins受體DCC是膜結(jié)合的受體，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)TM和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)功能區(qū)。DCC蛋白介導(dǎo)神經(jīng)軸突朝向Netrin蛋白方向生長(zhǎng)，完成吸引性作用[8]。Netrin-1與其受體DCC結(jié)合后，在胚胎期可通過吸引和排斥的雙重機(jī)制引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和細(xì)胞遷徙，且參與對(duì)細(xì)胞凋亡的雙向調(diào)節(jié)[9、10]。但電針對(duì)Netrin-1的影響是否波及到其受體DCC，目前鮮見報(bào)道。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為周圍神經(jīng)損傷其病機(jī)主要以氣血不足、營衛(wèi)不調(diào)為主。其針灸臨床治療常以“治痿獨(dú)取陽明”為指導(dǎo)，常用“足三里”、“環(huán)跳”等穴?！白闳铩毖▽僮汴柮魑附?jīng)，為本經(jīng)合穴、胃的下合穴，是治療下肢痿痹、半身不遂等病證要穴；“環(huán)跳”穴屬足少陽膽經(jīng)，是膽經(jīng)與膀胱經(jīng)的交會(huì)穴，也是治療下肢痿痹要穴。統(tǒng)計(jì)分析針刺治療坐骨神經(jīng)痛1911年—2010年的臨床文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，納入的318篇文獻(xiàn)中，選穴涉及13條經(jīng)脈的123個(gè)穴位，“環(huán)跳”的使用頻次最高，“足三里”也極高[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取“環(huán)跳”、“足三里”來探究電針治療周圍神經(jīng)損傷的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，坐骨神經(jīng)損傷大鼠電針治療后，損傷的坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段中DCC表達(dá)強(qiáng)于模型對(duì)照組；模型對(duì)照組也強(qiáng)于空白組損傷和假手術(shù)組，均有非常顯著性差異。本研究表明電針治療能明顯增強(qiáng)損傷的周圍神經(jīng)DCC蛋白的表達(dá)，但電針治療如何影響信號(hào)通路——Netrin-1、DCC及其下游因子的表達(dá)則是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，可能還牽涉到其他信號(hào)通路的眾多因素。因此，電針能促進(jìn)DCC蛋白的表達(dá)，可能是其促進(jìn)軸突乃至周圍神經(jīng)損傷修復(fù)再生的一個(gè)方面，還需要更進(jìn)一步的研究。

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Effects o f Electroacupun ctu re on Recep tor DCC o f Nerve G row th Guidance Facto r Netrin-1 o f Rats a fter Sciatic Nerve In ju ry

DU Xu,WANGRuihui,WANG Pengli,WANGYu,ZHANG Zhaoxing,CHEN Chaochao,LIUWenwen

(Departmentof Acupuncture and M assage,ShannxiUniversity of ChineseM edicine,ShaanxiProvince,Xianyang 712046,China)

ObjectiveTo discuss the effects on receptor DCC of nerve growth guidance factor Netrin-1 of rats after sciatic nerve injury.M ethods70 SD rats were random ly divided into control group,sham-operated group,model group and the electroacupuncture (EA)group(n=20).In the latter two groups,the right sciatic nerve was transected and end-to-end suture immediately.The treatmentof EA on"Huantiao"(GB 30)and'Zusanli'(ST 36)was applied once daily,and 7 dayswas a course of treatment,which included continuous treatment of two courses.The changes in expression of receptor DCC in sciatic nerve and corresponding section of spinal cord were detected by quantitative real-time PCR and immunohistochemicalmethods at the end of each course of treatment.Resu ltsEA group was compared with themodel group,DCC in the injured rat sciatic nerve and spinal cord segments reached a peak after the first course of treatment,then decreased gradually,were higher than themodel group,and therewas a remarkably significant difference(P＜0.01).The two groups were always higher than the control group and sham-operated group,and there were also remarkably significant differences(P＜0.01).ConclusionEA treatment can remarkably strengthen expression of DCC in sciatic nerve and corresponding section of spinal cord after sciatic nerve injury.Thismay be the one of themechanisms for the treatment of peripheral nerve injury.

electroacupuncture;sciatic nerve injury;nerve growth guidance Netrin-1;receptor DCC;bi syndrome;animal experiment; Huantiao(GB 30);Zusanli(ST 36)

：李海燕本文校對(duì)：劉海燕

2016-10-27）

陜西省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目【No：13-JC018】；陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目【No：2013JK0825】

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.05.054

1672-2779（2017）-05-0128-03