萬古霉素軟膏劑的制備及效果評(píng)價(jià)

郭善軍　張曉林　曾吉祥

摘 要 制備出具有良好抑菌效果的萬古霉素軟膏，并初步評(píng)價(jià)其透皮釋放性能。采用乳化法制備O/W型和W/O型兩種萬古霉素軟膏。通過比較這兩種軟膏的物理性狀、體外透皮釋放率、體外抑菌、動(dòng)物藥效學(xué)等質(zhì)量評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定更優(yōu)的軟膏劑制備處方并初步建立萬古霉素軟膏劑透皮實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，O/W型萬古霉素軟膏的制備工藝簡單，制劑穩(wěn)定性好，抑菌效果快速強(qiáng)效。

關(guān)鍵詞 萬古霉素 軟膏劑 透皮制劑 生物被膜

中圖分類號(hào)：R681.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

萬古霉素是一種糖肽類抗生素，臨床上主要用于治療由其他抗生素不敏感的革蘭氏陽性菌所引起的嚴(yán)重感染，如肺炎等。隨著抗生素的亂用，導(dǎo)致細(xì)菌感染的疾病增多，終止最為抗生素最后一道防線的萬古霉素的臨床使用增加，為了更好地指導(dǎo)臨床用藥，有必要對(duì)萬古霉素軟膏劑進(jìn)行研究。

1材料

2000高效液相色譜儀（日本日立公司），RYJ-6B 藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司），AB135-S 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），XK97-A 菌落計(jì)數(shù)器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市齊欣科學(xué)儀器有限公司），SW-CJ-TD 無菌操作臺(tái)（蘇州凈化有限公司），S-3000N 掃描電鏡（HITACHI）。萬古霉素（大連美倫生物技術(shù)有限公司），十八醇、丙二醇、白凡士林、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、十二烷基磺酸鈉、液狀石蠟均為藥用級(jí)。

2方法

2.1處方的組成

根據(jù)查閱的相關(guān)文獻(xiàn)和單因素實(shí)驗(yàn)篩選出了W/O型和O/W型2個(gè)最優(yōu)處方。W/O型處方：單硬脂酸甘油酯15g，硬脂酸5.0g，白凡士林15g，液狀石蠟14g，氫氧化鈣的飽和水溶液50g，萬古霉素1.0 g。O/W型處方：十二烷基硫酸鈉1.5g，白凡士林17g，丙二醇10g，水50g，十八醇20g，氯化鈣0.5g，萬古霉素1.0g。

2.2軟膏劑制備

2.2.1 O/W型軟膏劑的制備

稱取處方標(biāo)識(shí)量中的十八醇、丙二醇、白凡士林，在70℃的水浴下加熱融化為油相，稱取處方標(biāo)識(shí)量的氯化鈣、萬古霉素、水，在70℃的水浴下加熱融化為水相。然后再劇烈攪拌，將水相緩緩傾入油相中，使其成軟膏狀，即得到O/W型萬古霉素軟膏劑。

2.2.2 O/W型軟膏基質(zhì)的制備

按2.2.1中方法進(jìn)行制作，只是不加主要萬古霉素。

2.2.3 W/O型軟膏劑的制備

稱取處方中標(biāo)識(shí)量的單硬脂酸甘油酯、液狀石蠟、硬脂酸、白凡士林，在70℃的水浴中加熱融化為油相，稱取處方標(biāo)識(shí)量的萬古霉素、氫氧化鈣的飽和水溶液，在70℃的水浴中加熱融化為水相。在劇烈攪拌下，將水相緩緩傾入油相中，使其成軟膏狀，即得到W/O型萬古霉素軟膏劑。

2.2.4 W/O型軟膏基質(zhì)的制備

按2.2.3中方法進(jìn)行制作，只是不加主要萬古霉素。

2.3質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1性狀觀察

對(duì)兩種軟膏劑的顏色及外觀形態(tài)進(jìn)行觀察。

2.3.2穩(wěn)定性考察

（1）耐熱耐寒實(shí)驗(yàn)。分別取適量的W/O型和O/W型軟膏劑，在55℃的恒溫水浴中保存24h，取出后放至室溫，再在-20℃下放置24h，最后取出樣品，觀察樣品有無液化、變色、分層、粗化等現(xiàn)象。

（2）高速離心實(shí)驗(yàn)。分別稱取適量的W/O型和O/W型軟膏，在4000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心30 min，觀察有無分層、液化等現(xiàn)象。

2.4體外透皮釋放量測定

2.4.1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取萬古霉素2.02mg于容量瓶中，用蒸餾水定容至10mL，搖勻，作為儲(chǔ)備液。紫外分光光度計(jì)全波長掃描確定萬古霉素的最大吸收波長為236nm，以236nm作為檢測波長。

（1）液相色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（150mm€？.6mm，5 m）；流動(dòng)相是乙腈-0.05mol/L磷酸銨緩沖鹽（8∶92）；檢測波長236nm；流速1mL·min-1；最低檢測限0.8ng 。

（2）線性回歸方程的確定

精密配制濃度分別為3.1625 g·mL-1、6.325 g·mL-1、12.65 g·mL-1、25.3 g·mL-1、50.6 g·mL-1、101.2 g·mL-1、202.4 g·mL-1的萬古霉素溶液，以236nm作為檢測波長，每次進(jìn)樣量10 L，將濃度與峰面積進(jìn)行回歸即可得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）回收率實(shí)驗(yàn)

稱取適量萬古霉素，配制濃度分別為5.0 g·mL-1、50 g·mL-1、150 g·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將三種不同濃度的萬古霉素溶液各分為兩份，分別在每份中加入W/O型和O/W型基質(zhì)，在70℃水浴中使基質(zhì)全部融化，混勻，離心，用0.22 nm的慮膜過濾，經(jīng)HPLC分離后在236nm處檢測，計(jì)算其回收率。

2.4.2離體鼠皮的準(zhǔn)備

2.4.3透皮實(shí)驗(yàn)方法

配制一定量的生理鹽水作為釋放液。接收池中灌入6.5mL的生理鹽水，讓液面與接收池瓶口齊平。再在接收池瓶口蓋上離體鼠皮（皮膚的角質(zhì)層朝外），將釋放池蓋在離體皮膚上，最后用夾子將釋放池、接收池、離體皮膚固定。把透皮釋放裝置放于37℃透皮實(shí)驗(yàn)擴(kuò)散儀中，待接收池中溫度也維持在37℃時(shí)，分別將適量的W/O和O/W兩種軟膏均勻的涂抹在離體皮膚上，轉(zhuǎn)速設(shè)為300 r/min。分別在第0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h等不同時(shí)間點(diǎn)取樣，取樣量為100 L，取樣后向接收池中加入等量 37℃生理鹽水。將取得的樣品經(jīng)離心、0.22nm微孔濾膜過濾，最后在HPLC上檢測樣品中萬古霉素的濃度。

2.5軟膏劑體外抑菌效果試驗(yàn)

2.5.1藥皿抑菌試驗(yàn)

取1mL的金黃色葡萄球菌的菌液加入到含2%瓊脂粉的肉湯培養(yǎng)基中搖勻，再將這含有細(xì)菌的培養(yǎng)基倒入1個(gè)培養(yǎng)皿中（每個(gè)培養(yǎng)皿含有25mL培養(yǎng)基），待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板上平分區(qū)域打出4個(gè)大小一致的孔，在每個(gè)小孔中分別加入等量的O/W型軟膏基質(zhì)、W/O型軟膏基質(zhì)、O/W型萬古霉素軟膏、W/O型萬古霉素軟膏。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后測量其抑菌圈直徑的大小。

2.5.2對(duì)金黃色葡萄球菌生長的影響

體外透皮抑菌實(shí)驗(yàn)與體外透皮釋放實(shí)驗(yàn)相識(shí)，以6.5mL金黃色葡萄球菌稀釋液（0.1mL的金黃色葡萄球菌菌液和6.4mL的生理鹽水釋放液）作為釋放液。取出的0.1mL的樣品通過平板稀釋菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算其中的細(xì)菌量。

2.6軟膏劑動(dòng)物藥效試驗(yàn)

將36只體重約為20g健康小白鼠，雌雄各半，平分為6組，其中每組雌雄各半。用硫化鈉溶液脫去小鼠背部大約4cm2面積的毛，露出裸露皮膚，用生理鹽水清洗干凈。用滅菌后的刀片在小鼠背部裸露皮膚處劃下一個(gè)“井”字形的傷口，每天在“井”傷口中央皮下注射5 L的金黃色葡萄球菌菌液，連續(xù)注射3d。5d后每只小鼠背部傷口處都有化膿感染現(xiàn)象，且在“井”中央還有凸起。然后從第6d開始，按組分別在小鼠背部“井”傷口中央涂抹適量的O/W型軟膏基質(zhì)、W/O型軟膏基質(zhì)、O/W型萬古霉素軟膏、W/O型萬古霉素軟膏、市售紅霉素軟膏以及無菌生理鹽水，并且每天觀察傷口愈合情況。

3結(jié)果

3.1軟膏劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

所制得的W/O型和O/W型萬古霉素軟膏劑為白色膏狀物，通過耐熱耐寒、高速離心試驗(yàn)后，均無變色、分層、粗化、液化等現(xiàn)象，說明所制備的軟膏劑穩(wěn)定性良好。

3.2軟膏劑體外透皮釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

萬古霉素的水溶液在6.33～202.40 g·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性良好（如圖2），線性回歸方程：y=10378x-47127 ，r=0.9998。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明該方法的加樣回收率符合要求，在150 g·mL-1、50 g·mL-1、5 g·mL-1濃度下W/O和O/W型萬古霉素軟膏評(píng)價(jià)加樣回收率分別為99.12%、99.88%，RSD分別為0.57%、076%。

3.2.2透皮試驗(yàn)結(jié)果

W/O型萬古霉素軟膏累積釋放率為44.15%，O/W型萬古霉素軟膏劑累積釋放率為53.35%，在6h后2種軟膏劑藥物釋放均趨緩（見表2和圖3）。

3.3軟膏劑透皮抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1軟膏劑體外藥皿抑菌試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：W/O型和O/W型萬古霉素軟膏劑均能不同程度的抑制金黃色葡萄球菌的生長，而不含萬古霉素的軟膏劑基質(zhì)則無抑菌作用。

體外透皮抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示在給藥后2h內(nèi)，金黃色葡萄球菌已被殺滅大半數(shù)，8h的時(shí)候O/W型軟膏組的細(xì)菌已全部殺滅，而W/O型軟膏組的細(xì)菌則只有極少量的存活，表明透皮抑菌效果明顯。

3.3.2動(dòng)物藥效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)給藥后小鼠背部“井”字中央凸起膿包的大小和化膿傷口結(jié)疤情況來判斷各實(shí)驗(yàn)小組治療皮膚感染的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明生理鹽水組（陰性對(duì)照組）與紅霉素軟膏組（陽性對(duì)照組）和萬古霉素的軟膏組的P值都小于0.05，具有顯著差異。而軟膏劑的基質(zhì)組與生理鹽水組比較P值均大于0.05，無顯著差異。在給藥后的第3天，萬古霉素軟膏劑組的感染治愈率達(dá)100%，比陽性對(duì)照組的紅霉素軟膏組的治愈率明顯高（見圖5）。

4討論

通過對(duì)兩種不同類型的萬古霉素軟膏進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)O/W型萬古霉素軟膏的釋放速度更快、抑菌效果也更好，其可能原因在于O/W型軟膏中萬古霉素處于乳劑外部，且萬古霉素在水中的溶解度極好，因此此種軟膏劑更容易分散在水中，從而發(fā)揮藥效。

感染導(dǎo)致的，所以此實(shí)驗(yàn)選擇了革蘭氏陽性菌的典型代表金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象萬古霉素的抑菌范圍主要是針對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陽性菌，在皮膚感染中多由革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌。

基金項(xiàng)目：四川省教育廳項(xiàng)目（14ZB0383）。