Red/ET同源重組技術(shù)在載體構(gòu)建中的應(yīng)用

郭善軍　張曉林　陳章寶　曾吉

摘 要 Red/ET同源重組技術(shù)是以原有的重組技術(shù)為基礎(chǔ)，利用Rac噬菌體ET系統(tǒng)或者 噬菌體的Red系統(tǒng)進(jìn)行外源基因重組的重組方法。該方法使同源重組過(guò)程變得更方便快捷。本文對(duì)Red/ET同源重組技術(shù)的原理，改進(jìn)和載體構(gòu)建方面的應(yīng)用做了綜述。

關(guān)鍵詞 Red/ET同源重組 噬菌體 載體構(gòu)建

中圖分類(lèi)號(hào)：Q392 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

2001年人類(lèi)基因組測(cè)序完成，基因中所含有的大量的功能信息越來(lái)越受到人們的關(guān)注。為了解這些復(fù)雜的人類(lèi)密碼的含義，對(duì)單個(gè)基因功能的研究也顯得越來(lái)越重要。然而，對(duì)于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表達(dá)的外顯子之外，還含有很多調(diào)控序列等內(nèi)含子，如此一個(gè)基因片段則可能大至幾十或上百Kb。雖然現(xiàn)今有相應(yīng)的載體，如BAC（人工染色體）和PAC（P1人工染色體）能裝載如此大量的基因信息，但是要找到這些基因片段的限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)，并在體外對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)距離的片段擴(kuò)增的難度比較大。

Red/ET重組技術(shù)是以傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)為基礎(chǔ)，但是，相對(duì)于普通的同源重組技術(shù)而言，它具有簡(jiǎn)單、快速、高效等特點(diǎn)，而且整個(gè)重組過(guò)程不需要經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增階段，這樣可以避免外界環(huán)境引起的不必要的突變。

1傳統(tǒng)同源重組

自然發(fā)生的同源重組是兩個(gè)DNA分子之間進(jìn)行片段交換，從而使序列重排。同源重組分析最早開(kāi)始于1956年。在大腸桿菌中，A John Clark發(fā)現(xiàn)了兩種與同源重組有關(guān)的酶，RacA和RecBCD。在同源重組發(fā)生的時(shí)候，RecA結(jié)合DNA單鏈或雙鏈，對(duì)雙鏈DNA進(jìn)攻，把原來(lái)配對(duì)的互補(bǔ)鏈分開(kāi)，并嘗試自身與被入侵DNA鏈配對(duì)。當(dāng)配對(duì)成功后，RecA蛋白脫落?；蛘咴赗ecBCD的引導(dǎo)下，使目標(biāo)DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的幫助下進(jìn)行重組。當(dāng)兩條鏈發(fā)生重組時(shí)，會(huì)產(chǎn)生holliday中間體，該中間體在重組完成時(shí)由RuvAB和RecG蛋白進(jìn)行拆分。至此，形成兩條含有異源序列的雙鏈DNA。

在質(zhì)?；蚴删w轉(zhuǎn)入大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)同源區(qū)段小于75bp時(shí)會(huì)使重組率顯著降低。但是實(shí)際上，在RecA重組系統(tǒng)中，要求同源臂的長(zhǎng)度在1kb左右，且反應(yīng)條件要求比較苛刻。

2 Red/ET同源重組技術(shù)

Red/ET同源重組系統(tǒng)，其實(shí)是Red同源重組系統(tǒng)和ET同源重組系統(tǒng)的總稱(chēng)，其中ET系統(tǒng)于1998年由Stewart等在大腸桿菌中誘導(dǎo)的Rac噬菌體中發(fā)現(xiàn)，隨后又在 噬菌體中發(fā)現(xiàn)了Red系統(tǒng)。在這兩個(gè)系統(tǒng)中，整個(gè)重組過(guò)程由DNA重組酶參與而不需要限制性?xún)?nèi)切酶，且對(duì)同源臂長(zhǎng)度的要求低，僅需35-50bp的同源序列，而傳統(tǒng)的RecA同源重組則需要大約1kb的同源序列。并且該系統(tǒng)介導(dǎo)的整個(gè)同源重組過(guò)程都是在細(xì)內(nèi)進(jìn)行，避免了因胞外反應(yīng)引起的不必要突變。

2.1 ET同源重組系統(tǒng)

該系統(tǒng)于1998年由Stewart等在大腸桿菌中誘導(dǎo)的Rac噬菌體中發(fā)現(xiàn)，其所需的單側(cè)同源臂長(zhǎng)度僅為35-50 bp，該噬菌體通過(guò)表達(dá)蛋白R(shí)ecE和RecT來(lái)介導(dǎo)重組反應(yīng)。其中RecE蛋白有5′-3′外切酶活性，能夠從5′-3′端依次切下雙鏈DNA上的堿基，使DNA分子形成3′粘性末端。RecT是一種單鏈結(jié)合蛋白，保護(hù)單鏈核苷酸不被降解，能在退火時(shí)指導(dǎo)單鏈入侵。

在ET系統(tǒng)中，帶有同源臂的外援DNA分子可以直接通過(guò)同源臂找到同源區(qū)域，然后進(jìn)行DNA的互換。

2.2 Red同源重組系統(tǒng)

Red重組系統(tǒng)也是由Stewart的實(shí)驗(yàn)小組在 噬菌體中發(fā)現(xiàn)，它是由Red 和Red 兩種蛋白組成的同源重組系統(tǒng)。Red 由三個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成，中間的空隙能消化DNA分子，與ET系統(tǒng)中的RecE蛋白相似，它具有5′-3′端核酸外切酶活性，能形成3′粘性末端。Red 也是一種單鏈結(jié)合蛋白，作用相似于ET系統(tǒng)中的RecT蛋白。

3 重組原理及操作

3.1 Red/ET同源重組的原理

根據(jù)Red/ET中Red 及RecE、Red 及RecT的功能，推測(cè)了該同源重組系統(tǒng)的作用機(jī)理。

當(dāng)帶有同源臂的外源DNA分子進(jìn)入到大腸桿菌中時(shí)，Red 或RecE發(fā)揮其5′-3′端核酸外切酶功能，由5′端開(kāi)始降解DNA序列，產(chǎn)生的3′粘性末端，這時(shí)外源DNA具備了與受體DNA發(fā)生重組的條件。產(chǎn)生的粘性末端被RecT或者Red 結(jié)合35bp的單鏈核苷酸序列，同時(shí)防止被細(xì)胞內(nèi)存在的核酸內(nèi)切酶降解。在DNA退火時(shí)，含有粘性末端的3′單鏈進(jìn)攻雙鏈DNA片段，重組。發(fā)生重組的兩條DNA鏈經(jīng)過(guò)剪切和DNA聚合酶的修復(fù)作用后，重組DNA形成，外源DNA成功導(dǎo)入受體DNA中。

但是在大腸桿菌中有一種RecBCD蛋白，它具有極強(qiáng)的核酸外切酶活性，能將外源線(xiàn)性DNA降解掉，從而降低重組的成功率。所以在RecBCD蛋白缺失的大腸桿菌中Red/ET同源重組的方法才能最大可能的發(fā)揮作用。為了能提高外源DNA在大腸桿菌中的重組率，首先應(yīng)該抑制RecBCD在大腸桿菌中的表達(dá)量，為此將 噬菌體Gam蛋白的基因?qū)氲街亟M系統(tǒng)中。Gam蛋白能與RecBCD形成RecBCD-Gam符合體，抑制RecBCD的核酸外切酶活性。

3.2操作方式

該重組技術(shù)在的操作方式主要有兩種。（1）建立含有將 基因的ET系統(tǒng)或Red系統(tǒng)的質(zhì)粒，在實(shí)施重組時(shí)將三者共同導(dǎo)入受體分子中，共同表達(dá)。（2）直接在受體菌中篩選出能進(jìn)行Red/ET重組的菌株。前者的重組成功率更高，但是當(dāng)受體分子不容易接受外源DNA時(shí)，后一種方式就顯得更加便捷。

4系統(tǒng)優(yōu)化

最初Red/RT系統(tǒng)采用的是pDAB-ET 依托型質(zhì)粒載體，在該載體中，recE、recT以及 基因分放在PBAD、EM7和Tn-5啟動(dòng)子下共表達(dá)。在之后構(gòu)建的pDAB-ETg和pDAB-gba載體中，RecE/RecT/Red 和Red /Red /Red 被放在PBAD啟動(dòng)子后面共表達(dá)，該啟動(dòng)子受L-阿拉伯糖誘導(dǎo)調(diào)控。但是在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題。

（1）在發(fā)生重組后該載體不容易從宿主細(xì)胞中去除，影響后續(xù)的研究工作。為此，研究人員開(kāi)發(fā)了溫控性質(zhì)粒。其原理是將Red /Red 與 基因放在含有PL啟動(dòng)子和cI857基因的載體上，然后導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)。在溫度為30℃時(shí)，cI857基因啟動(dòng)PL啟動(dòng)子，使Red系統(tǒng)不表達(dá)。當(dāng)溫度為42℃時(shí)，cI857基因的作用被抑制，Red系統(tǒng)得以重新表達(dá)。

（2）由于工程用大腸桿菌一般都缺乏RecA蛋白，在這樣的情況下重組的發(fā)生率會(huì)降低。在最初的目的中使RecA缺失，其目的是讓真?zhèn)€表達(dá)系統(tǒng)中外源DNA復(fù)制更穩(wěn)定。但是為了避免RecA缺失對(duì)重組率的影響又從新引入了RecA蛋白。

（3） 基因在表達(dá)的過(guò)程中不易控制，它的過(guò)度表達(dá)會(huì)影響RecBCD的活性，進(jìn)而影響質(zhì)粒表達(dá)的穩(wěn)定性（Gam蛋白與RecBCD蛋白結(jié)合只是抑制了RecBCD對(duì)核酸的降解能力，但仍然能對(duì)同源重組起促進(jìn)作用）。為了解決這樣的問(wèn)題，研究者將 基因和Red/ET系統(tǒng)共表達(dá)，從而對(duì) 基因進(jìn)行調(diào)控。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)， 基因上的5′端的非翻譯區(qū)域?qū)χ亟M效率有很大的影響。將含有5′端的非翻譯區(qū)突變的基因與Red 和Red 連接，可以很大程度的提高重組效率。

5在載體構(gòu)建中的應(yīng)用

2006年Osterrieder等運(yùn)用Red/ET系統(tǒng)和反篩選系統(tǒng)（I-SceI蛋白）設(shè)計(jì)出了兩步重組方法。首先設(shè)計(jì)一個(gè)含有I-SceI同源臂的基因片段，通過(guò)Red/ET系統(tǒng)轉(zhuǎn)入載體之中。構(gòu)建好的重組載體通過(guò)誘導(dǎo)I-SceI蛋白的表達(dá)，使雙鏈產(chǎn)生切口。切口處可作為同源臂，進(jìn)行下一次的異源重組。這種兩步重組系統(tǒng)大大地提高了重組的精確性。

在對(duì)致病菌基因的研究中，朱善元等對(duì)禽致病大腸桿菌的ibeA基因進(jìn)行缺失，用缺失該基因的大腸桿菌粘附與侵襲人微血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果顯示，缺失ibeA基因的大腸桿菌與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力顯著下降，侵襲率也顯著下降。Murphy等還通過(guò)該技術(shù)對(duì)致病大腸桿菌的有毒基因進(jìn)行敲除，以為免疫制劑的進(jìn)一步研究提供理論方法。

蘭德松等，利用Red/ET同源重組技術(shù)，通過(guò)兩步重組法構(gòu)建了禽流感A/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）毒株的血凝素（HA）基因的重組火雞皰疹病毒。他們的研究為新型禽流感重載活性疫苗的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

6展望

Red/ET同源重組技術(shù)的使用，為外源基基因的重組表達(dá)提供了一種快捷、簡(jiǎn)單的方法。在抗生素的開(kāi)發(fā)中，使抗生素異源表達(dá)，提高產(chǎn)量也是研究中的重點(diǎn)。該技術(shù)除了能方便的運(yùn)用于抗生素的異源表達(dá)方面，還可以通過(guò)對(duì)基因簇的修飾、重排、刪除等來(lái)創(chuàng)造新的抗生素?，F(xiàn)在已有該方面的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬先勇，姚開(kāi)泰.同源重組技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，1996，16（3）：16-23.

[2] 王軍平， 張友明. Red/ET重組及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2000，18（12）：502-506.