多基因表達系統(tǒng)在禽流感、登革及基孔肯雅病毒檢測中的應用研究*

高國龍,田綠波,陳肖瀟,石 瑩,樊學軍,楊 雨

(四川國際旅行衛(wèi)生保健中心，成都 610041)

·經(jīng)驗交流·

多基因表達系統(tǒng)在禽流感、登革及基孔肯雅病毒檢測中的應用研究*

高國龍,田綠波,陳肖瀟,石 瑩,樊學軍,楊 雨

(四川國際旅行衛(wèi)生保健中心，成都 610041)

目的 該研究利用多重基因表達分析系統(tǒng)(GeXP)檢測平臺，建立禽流感病毒(AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9)、登革病毒，基孔肯亞病毒的檢測技術(shù)方法。方法 制備病毒標準品質(zhì)粒，收集病原體樣本，利用GenBank下載病毒的核苷酸序列，根據(jù)病毒的序列特征，利用GeXP eXpress Profiler設(shè)計特異性引物，優(yōu)化條件使GeXP系統(tǒng)能夠特異性的檢測對應病毒。結(jié)果 優(yōu)化后的引物能夠同時檢測禽流感病毒(AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9)、登革病毒和基孔肯亞病毒病毒，特異性強，無交叉反應。結(jié)論 GeXP檢測方法的建立為快速檢測禽流感病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒提供了便利，對分子診斷有重要意義。

傳染病；禽流感；登革病毒；基孔肯雅病毒；多基因表達分析系統(tǒng)

隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展，交通與物流更加方便與快捷，人員交流更加頻繁，為呼吸道傳染病傳播、擴散提供了便利條件。同時，全球各地自然災害頻繁發(fā)生導致的局部環(huán)境變化，也為蟲媒傳染病媒介生物創(chuàng)造了孳生條件，直接影響到不同生存環(huán)境的蟲媒種類、種群和數(shù)量的變化，使得蟲媒傳染病防控工作更加艱難，蟲媒傳染病疫情不斷發(fā)生。近年來發(fā)生的重大新發(fā)、突發(fā)急性傳染病如禽流感、登革熱、基孔肯雅熱等傳染病是我國口岸重點排查的傳染病[1-3]。這類傳染病備受世界各國關(guān)注，已成為需要迫切解決的社會問題和人類社會必須面對的巨大挑戰(zhàn)。這些傳染病臨床表現(xiàn)主要是發(fā)熱、呼吸急促、乏力、頭痛等，重癥患者容易出現(xiàn)呼吸衰竭、多器官損傷，甚至導致死亡，對社會的穩(wěn)定和經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生了很大的影響。這類傳染病傳染性強，病死率高，人群普遍缺乏免疫力，極易導致大范圍傳播，在疫苗和抗病毒化學藥物短缺及病毒容易變異的情況下，已成為對人類健康威脅最大的病種之一。

近年來，分子生物學的迅速發(fā)展為我們快速檢測病原體帶來了希望，尤其是多重PCR技術(shù)的應用，它能在一次反應中同時檢測多種病原體，為臨床鑒別診斷提供了重要依據(jù)[4-5]。同時，多重PCR技術(shù)也具有穩(wěn)定性低和重復性差的不足，擴增中不同基因擴增效率的不同會導致出現(xiàn)多重偏愛擴增，降低檢測的靈敏度[6-7]。美國貝克曼(Beckman)公司基于多重RT-PCR及毛細管電泳開發(fā)出多重基因表達分析系統(tǒng)(gene expression profiler genetic analysis system,GeXP)技術(shù)，它能同時檢測40多個基因的表達量，使病原體檢測工作更高效[8]。GeXP技術(shù)利用軟件程序，根據(jù)擴增產(chǎn)物條帶大小檢測PCR產(chǎn)物，顯示出各種特異基因的差異，與預期的PCR產(chǎn)物大小比較，鑒定每個反應，同時根據(jù)熒光信號量來計算每個基因的差異表達量，GeXP技術(shù)與多重PCR聯(lián)用比其他多重檢測方法更加靈敏[9]。GeXP技術(shù)被成功地用于快速鑒定幾種炎癥性的細胞因子基因的表達量，在常見結(jié)腸息肉腫瘤中，能同時檢測68種水痘帶狀皰疹病毒和幾種人乳頭狀瘤病毒基因型[9-10]。

本研究擬建立一種GeXP遺傳分析系統(tǒng)與多RT-PCR聯(lián)用的方法，用于檢測我國重點關(guān)注的3種呼吸道和蟲媒病毒，包括禽流感病毒(AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9)、登革病毒(dengue virus)，基孔肯雅病毒(yellow fever virus)，為臨床的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 禽流感病毒(AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9)、登革病毒，基孔肯雅病毒標準品質(zhì)粒由Invitrogen公司完成，并通過酶切線性化。

1.2 引物的設(shè)計與合成 利用GenBank下載各病毒的核苷酸序列，使用ClustalX軟件進行多序列同源性比對分析，將結(jié)果輸入GeXP Express Profiler工具設(shè)計多重PCR特異性引物，并使用NCBI Primer-Blast和Primer Premier 5.0軟件進行分析篩選。分別在各特異性引物上、下游5′端加上一段非同源通用引物序列Un-F(上游帶有熒光標記)和Un-R，構(gòu)成特異嵌合引物。各引物均由上海Invitrogen公司合成。各引物信息見表1。

1.3 總RNA提取及cDNA合成 利用MiniBEST病毒RNA/DNA提取試劑盒(Takara，Dalian，China)提取130個病原體臨床樣本血清中的病毒RNA，NanoDrop測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa)進行cDNA的第一條鏈的合成。反應體系：各特異性嵌合引物下游1 μL(10 pmol/μL)，dNTP Mixture 1 μL(10 mmol/L)，RNA模板2 μL，5×PrimeScript 緩沖液 4 μL，RNase 抑制劑 0.5 μL(40 U/μL)，PrimeScript RTase 1 μL(200 U/μL)，無RNc-se ddH2O 10.5 μL。反應條件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，冰上放置或-20 ℃保存。

1.4 引物特異性驗證 (1)利用GeXP進行引物單一特異性驗證。PCR體系：5×PCR 緩沖液(含通用引物上下游各0.25 μmol/L)4 μL，MgCl2(25 μmol/L)4 μL，特異嵌合引物(各引物濃度均為0.2 μmol/L)2 μL，Taq DNA聚合酶0.7 μL，單一病毒質(zhì)粒(4×102ng/μL)2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過GeXP毛細管電泳系統(tǒng)檢測分析。(2)利用GeXP系統(tǒng)進行引物多重特異性驗證，PCR體系：5×PCR 緩沖液(含通用上、下游引物各0.25 μmol/L)4 μL，MgCl2O(25 μmol/L)4 μL，特異嵌合引物(各引物濃度均為0.2 μmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.7 μL，各病毒混合質(zhì)粒(4×102ng/μL)2 μL，加ddH2O至20 μL。

表1 引物信息

PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過GeXP毛細管電泳系統(tǒng)檢測分析。

1.5 臨床樣本檢測 利用GeXP系統(tǒng)進行臨床樣本檢驗，PCR體系：5×PCR 緩沖液(含通用引物上下游各0.25 μmol/L)4 μL，MgCl2(25 μmol/L)4 μL，特異嵌合引物(各引物濃度均為0.2 μmol/L)2 μL，Taq DNA Polymerase 0.7 μL，各臨床樣本cDNA 2 μL，加ddH2至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過GeXP毛細管電泳系統(tǒng)檢測分析。

2 結(jié) 果

2.1 引物特異性驗證結(jié)果 (1)單一特異性驗證：AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、登革病毒，基孔肯雅病毒病原體質(zhì)粒的GeXP結(jié)果見圖1。圖1A為AIV-H5病原體質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果，峰值出現(xiàn)于193.69 bp和223.98 bp;圖1B為AIV-H7病原體質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果，峰值出現(xiàn)于177.72 bp和192.19 bp;圖1C為AIV-H9病原體質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果，峰值出現(xiàn)于119.32 bp和192.73 bp;圖1D為登革病毒病原體質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果，峰值出現(xiàn)于211.92 bp;圖1E為基孔肯雅病毒病原體質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果，峰值出現(xiàn)于130.14 bp。5組實驗所檢測出的峰值條帶大小均與本實驗所設(shè)計的各病毒質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物大小相符。(2)多重特異性驗證：AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、登革病毒，基孔肯雅病毒病原體質(zhì)粒的多重特異性驗證結(jié)果見圖2。以混合病毒質(zhì)粒為模板進行PCR，產(chǎn)物為5條目的條帶，經(jīng)GeXP檢測，5個峰值位于為118.35、130.53、177.87、213.78、223.54 bp，產(chǎn)物分別符合本實驗所設(shè)計的AIV-H9、基孔肯雅病毒、AIV-H7、登革病毒、AIV-H5病原體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物條帶大小，混合質(zhì)粒的PCR設(shè)計的特異嵌合引物在混合實驗中可以排除干擾，特異擴增。

2.2 臨床樣本檢測結(jié)果 對130個病原體臨床樣本進行檢測，結(jié)果顯示本研究的方法可以用于臨床檢測這5種病原體，具體結(jié)果見表2。

A、B、C、D、E依次為AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、登革病毒和基孔肯雅病毒質(zhì)粒PCR檢測結(jié)果。

圖1 5種病原體質(zhì)粒的GeXP結(jié)果

圖2 AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、登革病毒和基孔肯雅 病毒質(zhì)粒多重特異性驗證結(jié)果表2 臨床樣本檢測結(jié)果

樣本樣本數(shù)(n)結(jié)果H5H7H9DENVCHIKVH520+----H720-+---H920--+--DENV20---+-CHIKV20----+H5+H7+H910+++--DENV+CHIKV10---++H5+H7+H9+DENV+CHIKV10+++++

H5：AIV-H5；H7：AIV-H7;H9：AIV-H9;DENV：登革病毒；CHIKV:基孔肯雅病毒。

3 討 論

近年，我國不斷加強口岸傳染病檢疫查驗工作，傳染病檢測技術(shù)能力不斷提升。2013-2015年，全國口岸年均發(fā)現(xiàn)有傳染病癥狀者5萬多例，共確診30多種傳染病。確診病例根據(jù)其傳播途徑，第一大類為呼吸道傳染病，第二大類為蚊媒傳染病，主要包括登革熱、瘧疾、基孔肯雅熱。近年來，隨著我國人民生活水平的提高和對外經(jīng)濟的不斷發(fā)展，我國赴境外旅游、經(jīng)商、勞務的人員明顯增多，其中一大批集中于非洲、東南亞等呼吸道和蟲媒傳染病流行疫區(qū)。禽流感病毒主要感染禽類等低等脊椎動物，因在人體內(nèi)無病毒的特異性受體，通常認為不能直接感染人類，但禽流感病毒通過不斷變異，正在突破種族屏障獲得感染人的能力[11]。登革熱是流行最為嚴重的蟲媒病毒傳染病之一，目前有 100 多個亞洲、美洲的國家和地區(qū)出現(xiàn)流行，東南亞和西太平洋地區(qū)受登革病毒的影響尤為嚴重，已成為兒童患者中需要住院治療和引起病死的主要原因，據(jù)報道，全球每年約有5 000萬至1 億登革病毒感染者，病死率在2.5%左右，在某些地區(qū)甚至可以達到5%[12]。自1952年引起疫情爆發(fā)以來，基孔肯雅病毒在過去的幾十年中作為一種重要的蚊媒致病病毒已引起公眾的高度關(guān)注[13-14]，我國廣東省東莞市于2010年出現(xiàn)204例基孔肯雅熱病例。

目前，傳染病病原體檢測方法主要有病毒分離與鑒定、血清學檢查和分子生物學檢測等方法。相對于分子生物學診斷，病毒的分離與鑒定耗時較長，對實驗室生物安全等級要求較高，血清學檢測的靈敏度和特異性較低。GeXP遺傳分析系統(tǒng)是一種全新的基因表達分析平臺，是一種基于多重PCR技術(shù)、毛細管電泳分離技術(shù)與高靈敏激光誘導熒光技術(shù)而開發(fā)出來的一種檢測分析系統(tǒng)，是多重PCR領(lǐng)域的突破性技術(shù)。GeXP遺傳分析系統(tǒng)巧妙的將多重PCR技術(shù)和毛細管電泳技術(shù)結(jié)合起來，將熒光標記的通用引物與特異嵌合引物按一定比例同時加入PCR反應體系，在同一PCR 反應體系里由通用引物和特異性嵌合引物引發(fā)多重PCR 反應，能夠有效解決傳統(tǒng)多重PCR技術(shù)中出現(xiàn)的多重偏愛擴增的問題，大大提高檢測速度和靈敏度。GeXP遺傳分析系統(tǒng)把基因表達研究提升到一個更高的水平，可監(jiān)控的基因數(shù)目可以達到幾十至幾百個，可以處理的樣本數(shù)可達數(shù)千個，其起始RNA用量可以低至20 ng，可以在單一RT-PCR反應中同時檢測多個基因的轉(zhuǎn)錄水平，提供了一種敏感的、靈活的和可重復的基因表達分析技術(shù)。

GeXP遺傳分析系統(tǒng)與多重RT-PCR聯(lián)用的方法開展病毒檢測，為病毒檢測方法改進提供了依據(jù)，已多次成功應用于衛(wèi)生檢疫和食品檢疫工作。Nagel等[15]，周麗芳等[16]先后構(gòu)建的GeXP遺傳分析系統(tǒng)成功用于皰疹病毒幽門螺桿菌的實驗室檢測工作，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，GeXP檢測方法在敏感性、特異性、有效性等方面均有明顯提升，顯示GeXP 系統(tǒng)可以滿足臨床標本實驗室檢測的需求。胡秀梅等[17]應用GeXP 遺傳分析系統(tǒng)特異地檢測出引起手足口病的9種常見人腸道病毒RNA，證明該方法靈敏度高、特異性強。蘆春斌等[18]從10份轉(zhuǎn)基因大豆和15份轉(zhuǎn)基因菜籽中挑選出6個最常見的外源基因(nos、Camv35s、epsps、pat、Fmv35s、bar)，采用的100 ng模板量為行業(yè)標準中建議的最低模板量，仍檢測出相應的轉(zhuǎn)基因成分，證明GeXP多基因表達分析系統(tǒng)構(gòu)建的檢測技術(shù)方法靈敏度完全達到行業(yè)標準要求，能夠用于食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測工作[18]。

本研究初步建立了一種GeXP遺傳分析系統(tǒng)與多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應聯(lián)用的方法，用于檢測禽流感病毒(AIV-H5、 AIV-H7、 AIV-H9)、登革病毒，基孔肯雅病毒，5組實驗所檢測出的峰值條帶大小均與本實驗所設(shè)計的各病毒質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物大小相符，以混合病毒質(zhì)粒為模板進行PCR，產(chǎn)物經(jīng)GeXP檢測，5個峰值位于為118.35、130.53、177.87、213.78、223.54 bp，分別符合本實驗所設(shè)計的AIV-H9、基孔病毒、AIV-H7、登革病毒、AIV-H5病原體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物條帶大小，各峰均獨立明確，峰面積值幾乎相等，符合判斷標準，證明設(shè)計的特異嵌合引物在混合實驗中可以排除干擾，能確保特異擴增?？傊?，本研究成功建立了一種GeXP遺傳分析系統(tǒng)用于開展流感病毒(AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9)、登革病毒和基孔肯亞病毒病毒多重病原體檢測的方法，通過系統(tǒng)優(yōu)化后的引物能夠同時檢測流感病毒(AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9)、登革病毒和基孔肯亞病毒病毒，特異性強，無交叉反應。本方法的建立為傳染病病原體高通量檢測開辟了新的途徑，為臨床診斷提供了依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.031

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFC1200904)；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2014IK064)；四川出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(SK201402)。

高國龍(1978-)，副教授，博士，主要從事細胞及分子生物學研究工作。

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1671-8348(2017)06-0818-04

2016-10-05

2016-11-04)