建立非均衡競爭葉酸定量測定的化學(xué)發(fā)光免疫分析法

聶 紅，陳維賢，趙 清，王 玎，胡 琴，劉 萍，李 樸△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科 400000；2.博奧賽斯(天津)生物科技有限公司，天津 300000)

·技術(shù)與方法·

建立非均衡競爭葉酸定量測定的化學(xué)發(fā)光免疫分析法

聶 紅1，陳維賢1，趙 清1，王 玎1，胡 琴1，劉 萍2，李 樸1△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科 400000；2.博奧賽斯(天津)生物科技有限公司，天津 300000)

目的 制備抗人葉酸(FA)抗血清并應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)系統(tǒng)開發(fā)新型非均衡競爭技術(shù)，建立可常規(guī)應(yīng)用的定量檢測血清FA的化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)法。方法 FITC-FA類似物、FA抗體-HRP依次加入包被有抗FITC抗體的化學(xué)發(fā)光板，形成FITC抗體-FITC-FA類似物-FA抗體-HRP的免疫反應(yīng)復(fù)合物；并進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，同時(shí)與非FITC檢測系統(tǒng)及羅氏化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 成功制備FA抗血清并建立基于FITC系統(tǒng)的非均衡競爭CLIA；經(jīng)方法學(xué)評價(jià)，自研法的線性相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.990 0，靈敏度1.21 nmol/L，線性范圍1.21～38.80 nmol/L，批內(nèi)變異系數(shù)小于5%，自研法定量檢測性能優(yōu)于非FITC系統(tǒng)；與羅氏檢測系統(tǒng)結(jié)果有較好相關(guān)性(R=0.908 1)。結(jié)論 建立的非均衡競爭定量檢測血清FA的CLIA法，具有良好的檢測靈敏度與特異性，可應(yīng)用于常規(guī)檢測。

FITC;非均衡競爭;葉酸;化學(xué)發(fā)光免疫分析法

葉酸(folic acid,FA)是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，主要促進(jìn)骨髓中幼稚細(xì)胞成熟[1]。FA缺乏可引起巨幼紅細(xì)胞性貧血以及白細(xì)胞減少癥[1-2]。此外，F(xiàn)A對孕婦極為重要，F(xiàn)A缺乏可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷，增加裂腦兒發(fā)生率[3-4]。因此，定量測定血清FA水平對預(yù)防和判斷貧血原因、降低出生缺陷、指導(dǎo)合理膳食結(jié)構(gòu)，判斷療效及觀察病情變化等具有重要的臨床價(jià)值[1,5-7]。化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是采用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法，CLIA具有檢測靈敏度與特異性高、線性范圍寬、無放射性污染等優(yōu)勢，已逐步作為臨床定量檢測的首選方法[8-9]。但CLIA檢測成本較高，限制了其臨床廣泛應(yīng)用。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上[10-11]，擬進(jìn)一步采用抗異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)抗體包被發(fā)光微孔板，F(xiàn)ITC-FA類似物取代FA作為競爭抗原[12]，增加了FA校準(zhǔn)品或樣品與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記FA抗體結(jié)合能力；以基于FITC檢測系統(tǒng)為平臺，建立非均衡競爭定量檢測血清FA的CLIA分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料 2～3 kg健康雄性新西蘭大白兔購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑、FA類似物、FA抗原及FITC購自Sigma公司，Anti-FITC抗血清購自Fitzgerald公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自Abnova公司。Hi TrapTMProtein A親和層析柱購自GE Healthcare公司。微孔板發(fā)光分析儀(Bioscience PETECK96-1)、微孔板脫水機(jī)(BIOS-401)為博奧賽斯(天津)生物有限公司產(chǎn)品。自動酶免分析儀(SM-3)由Thermo公司提供。紫外分光光度計(jì)為上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品。Western blot所需相關(guān)試劑均購自碧云天，聚偏氯乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫原及抗人FA抗血清的制備與純化 參考文獻(xiàn)[13]，采用長程免疫方案。主要步驟如下：將甲酯化-FA和牛血清清蛋白(BSA)、牛γ球蛋白(BGG)耦聯(lián)(碳化二亞胺法)。另將1 mg FA-BSA溶于1 mL無菌水后與等體積弗氏完全佐劑充分混合乳化，于家兔背部、足墊、皮下等多點(diǎn)注射；采用相同方法，分別于第14天與第28天用弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫；第35 天經(jīng)兔耳緣靜脈取血，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測抗血清效價(jià)；第42天用1.0 mg純蛋白注射入兔腹股溝肌肉加強(qiáng)免疫。于末次加強(qiáng)免疫1周后頸動脈放血，37 ℃分離血清；經(jīng)Protein A親和層析、超濾管超濾脫鹽；Bradford法測定Anti-FA抗體濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定純化后抗血清純度。將純FA蛋白(1 mg/ mL)及人血清稀釋20倍后進(jìn)行SDS-PAGE，采用Western blot分析制備的抗血清識別人血清中FA的特異性。制備的FA抗血清加入適量甘油與疊氮鈉后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 FA CLIA

1.2.2.1 FITC系統(tǒng)CLIA檢測方法 參考文獻(xiàn)并略作改進(jìn)[14-16]，將抗FITC抗體用包被緩沖液稀釋成5 μg/mL的溶液包被化學(xué)發(fā)光微孔板，每孔加50 μL FITC-FA類似物，50 μL樣品，50 μL過碘酸鈉氧化法制備的酶結(jié)合抗體；同時(shí)設(shè)置高值、中值、低值質(zhì)控品(Bio-rad)，震蕩混勻，37 ℃孵育1 h。自動洗板儀洗板后加入100 μL發(fā)光底物液，避光反應(yīng)10 min后采用微孔板發(fā)光分析儀讀取發(fā)光值。

1.2.2.2 非FITC系統(tǒng)CLIA檢測法 將FA-BGG用包被緩沖溶液稀釋至2.5 μg/mL，參考文獻(xiàn)制備包被板[16]，每孔加入50 μL校準(zhǔn)品或樣品，50 μL酶結(jié)合抗體，混勻后37 ℃孵育1 h。自動洗板儀洗板，加入100 μL發(fā)光底物液，避光反應(yīng)10 min后微孔板發(fā)光分析儀讀取發(fā)光值。

1.2.3 檢測方法線性范圍與靈敏度 用去離子水將高值濃液的FA進(jìn)行對倍稀釋后檢測，用logit-log數(shù)學(xué)模型進(jìn)行線性回歸處理分析。測定10孔零值發(fā)光值，并取其平均值，求得標(biāo)準(zhǔn)差(s)，然后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得即為分析靈敏度。

1.2.4 檢測方法精密度 取10孔分析高值和10孔分析低值，分別計(jì)算出10孔高值和10孔低值的濃度平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(s)、變異系數(shù)(CV)值，計(jì)算CV值作為批內(nèi)精密度；選取不同專業(yè)實(shí)驗(yàn)員每天檢測1次，3 d共30孔的值求出的CV值即為批間精密度。

1.2.5 檢測方法特異性 血清FA定量分析的主要非特異性交叉反應(yīng)因子為氨喋呤、亞葉酸、甲氨喋呤。將上述干擾物質(zhì)稀釋成相應(yīng)的濃度梯度(氨喋呤：0.5、1.0 mmo1/L；亞葉酸：10、100 mg；甲氨喋呤：0.5、1.0 mmo1/L)，加入相應(yīng)的檢測血樣中，采用本檢測系統(tǒng)定量檢測FA，分析檢測方法的交叉反應(yīng)性(即檢測方法的特異性)。

1.2.6 建立本檢測方法的人血清FA參考區(qū)間 符合要求的健康體檢者血清樣本(空腹抽取靜脈血，無溶血、脂血或黃疸)150例，男75例，平均年齡40歲，女75例，平均年齡43歲。所有血樣于30 min內(nèi)離心(3 000 r/min，5 min)分離獲取血清，-20 ℃分裝保存。分析前置冰上復(fù)融后混勻，2 h內(nèi)檢測完畢。根據(jù)定量檢測結(jié)果初步確定該檢測方法的FA參考范圍。

1.2.7 與羅氏CLIA定量檢測系統(tǒng)比較 隨機(jī)選取130份血樣，采用建立的檢測方法與羅氏CLIA檢測方法對血清樣本中FA同時(shí)進(jìn)行檢測，將所得檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.8 檢測穩(wěn)定性 將相同批次試劑分別置37 ℃烘箱和4 ℃冰箱保存7 d，隨后取出平衡至室溫，同時(shí)測定相同的FA標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析比較二者的檢測結(jié)果有無差異。

2 結(jié) 果

2.1 anti-FA抗血清的制備與純化 ELISA檢測結(jié)果顯示，經(jīng)抗原長程免疫后血清效價(jià)為1∶1000 000。采用Protein A親和層析法純化血清中抗體；抗體洗脫液經(jīng)超濾濃縮脫鹽，定量檢測濃度為5 mg/mL；取適量進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明抗體蛋白在約55×103與25×103處可見預(yù)期蛋白帶(圖1A箭頭所指處)，表明制備的抗血清純度較好；Western blot結(jié)果證實(shí)，制備的抗血清能特異性識別內(nèi)源性FA，可應(yīng)用于定量檢測(圖1B)。

圖1 SDS-PAGE與Western blot檢測FA 抗血清純度及其識別特異性

2.2 自研法檢測線性范圍與定量分析靈敏度 應(yīng)用本定量檢測系統(tǒng)的線性范圍為1.21～38.80 ng/ mL，以5個(gè)系列校準(zhǔn)品濃度和一個(gè)零值校準(zhǔn)品點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，線性相關(guān)系數(shù)的絕對值│R│=0.998 6，檢測靈敏度為1.20 ng/mL。而非FITC系統(tǒng)CLIA檢測試劑的線性相關(guān)系數(shù)的絕對值│R│=0.997 4，分析靈敏度為3.5 ng/mL。檢測結(jié)果表明，與非FITC系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光檢測方法相比，F(xiàn)ITC檢測系統(tǒng)的定量分析靈敏度顯著提高(P<0.01)。

圖2 FITC化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測定FA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 自研法檢測系統(tǒng)分析精密度 本實(shí)驗(yàn)所建立的基于FITC CLIA分析系統(tǒng)測定血清FA的精密度優(yōu)于非FITC系統(tǒng)CLIA法(表1)，其批內(nèi)CV小于5%；而采用非FITC系統(tǒng)CLIA測定的結(jié)果批內(nèi)CV大于10%(P<0.05)。同時(shí)應(yīng)用FITC系統(tǒng)CLIA測定FA的QcL、QcH批間CV分別為4.27%、4.69%，而非FITC系統(tǒng)CLIA測定的批間CV接近10.00%。分析精密度結(jié)果表明，自研法與非FITC系統(tǒng)CLIA相比，采用FITC系統(tǒng)(CLIA)精密度較非FITC系統(tǒng)(CLIA)檢測精密明顯提高(P<0.01)。

2.4 FITC檢測系統(tǒng)分析特異性 已有研究表明，血清FA定量檢測的干擾因素主要有氨喋嶺、亞葉酸、甲氨喋呤等，應(yīng)用建立的基于FITC系統(tǒng)CLIA測定的交叉反應(yīng)結(jié)果表明氨喋呤、亞葉酸、甲氨喋呤的交叉反應(yīng)性均小于0.01%，血清中主要的3種干擾物對建立的自研法均無明顯干擾作用(P>0.05)。

2.5 自研法檢測系統(tǒng)檢測人血清FA水平參考區(qū)間的確定 本實(shí)驗(yàn)選擇了150例健康人群體檢合格血樣，應(yīng)用建立的FITC 系統(tǒng)CLIA對FA進(jìn)行定量檢測，初步確定本檢測方法的血清FA臨床參考區(qū)間(95%CI)為5.1～16.6 ng/mL。

表1 FITC與非FITC系統(tǒng)CLIA測定血清FA的 批內(nèi)精密度

a:P<0.05，與FITC系統(tǒng)比較。

2.6 與羅氏CLIA測定結(jié)果比較 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的基于FITC化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)與羅氏Elecscys2010檢測系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)行血清FA定量測定。方法比較的結(jié)果表明兩種檢測方法的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩種血清FA檢測方法測定值比較

2.7 FITC系統(tǒng)檢測與進(jìn)口試劑相關(guān)性比較 使用羅氏檢測分析系統(tǒng)和自研檢測法測定臨床血清標(biāo)本150例，以自研法的FITC系統(tǒng)CLIA測定血清FA值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)口試劑羅氏CLIA測定值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖3)。所得方程為Y=1.180 8X-16.79，線性回歸系數(shù)為1.180 8，r=0.901 8。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明兩種分析方法定量測定的血清FA測定值符合性較好。

圖3 FITC系統(tǒng)檢測法(自研法)與進(jìn)口試劑 測定臨床標(biāo)本FA的相關(guān)性分析

2.8 檢測系統(tǒng)測定值不一致的分析 表3顯示150例樣本中有6例測定值結(jié)果不一致，χ2檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對于不符合要求的樣本，經(jīng)進(jìn)口羅氏CLIA和自研法的FITC系統(tǒng)CLIA重復(fù)性檢測，檢測值無明顯改變。進(jìn)一步使用雅培FA定量檢測系統(tǒng)進(jìn)行分析，測得4例與羅氏CLIA結(jié)果一致，2例與自研法的FITC系統(tǒng)CLIA測結(jié)果一致。配對四格表χ2檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無規(guī)律性的偏差產(chǎn)生，多為臨界偏差，產(chǎn)生偏差的原因可能主要由個(gè)體差異、兩種方法檢測原理不同及檢測過程中隨機(jī)誤差等導(dǎo)致。

2.9 自研法試劑穩(wěn)定性 將檢測試劑分別于4 ℃及37 ℃儲存；1周后對血清FA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果見表4，經(jīng)配對資料t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.16，P>0.05)。

表3 自研法的FITC系統(tǒng)CLIA與羅氏CLIA FA測定值比較

表4 自研試劑穩(wěn)定性分析

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)基于非均衡競爭的檢測原理，成功建立了檢測人血清FA的定量分析平臺。自研FA檢測法采用棋盤稀釋法將FITC-抗原間接包被微孔板上，依次加入含有FA的血清樣品和酶結(jié)合物，此時(shí)的FA抗原不會與包被在發(fā)光板上的抗原反應(yīng)，只有當(dāng)最后加入酶標(biāo)記抗體時(shí)反應(yīng)才開始，有效避免了因加樣而延遲時(shí)間所引起非特異性反應(yīng)，而對檢測結(jié)果所造成的影響。此外，本研究將FA抗原標(biāo)記FITC，間接將FA類似物包被在微孔反應(yīng)板上，與血清FA相比，F(xiàn)A類似物親和力較高，競爭性結(jié)合Anti-FA-HRP抗體，顯著提高了分析特異性與靈敏度(自研法的FITC系統(tǒng)CLIA分析靈敏度為1.20 ng/mL，而非FITC系統(tǒng)CLIA為3.50 ng/mL)。另一方面，自研法采用包被FITC抗體，提高包被的濃度，與直接包被抗原相比，其精密度明顯提高(約2.5倍)。采用抗FITC-FITC放大系統(tǒng)在CLIA中應(yīng)用具有標(biāo)記效率高、抗原抗體易于結(jié)合與分離，且標(biāo)記物穩(wěn)定等優(yōu)勢，從而保證了該檢測系統(tǒng)的試劑儲存穩(wěn)定性及檢測可靠性。

自研法血清FA定量檢測系統(tǒng)經(jīng)方法學(xué)評價(jià)，結(jié)果表明采用自研法的FITC系統(tǒng)CLIA檢測血清FA的靈敏度達(dá)1.21 nmol/L，線性檢測范圍達(dá)1.21～38.80 nmol/L，其檢測性能符合常規(guī)檢測的要求。與非FITC化學(xué)發(fā)光方法檢測系統(tǒng)比較，本方法有較好的靈敏度和準(zhǔn)確性；整個(gè)檢測分析過程處于一個(gè)封閉流動的環(huán)境，最大程度降低了交叉污染和環(huán)境污染；該分析方法同時(shí)具有檢測時(shí)間短，結(jié)果準(zhǔn)確，特異性高，達(dá)到同類相關(guān)產(chǎn)品的檢測水平要求；此外，與進(jìn)口FA檢測系統(tǒng)相比，建立的自研法檢測費(fèi)用低廉，易于推廣應(yīng)用。

本研究建立的非均衡競爭FA CLIA法在特異性、靈敏度、測定范圍、精密性、穩(wěn)定性、臨床符合度及檢測費(fèi)用等方面有一定優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景。

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A method of human serum folic acid dectetion by non-equilibrium competitive immunoassay using FITC detecting system

NieHong1,ChenWeixian1,ZhaoQin1,WangDing1,HuQin1,LiuPing2,LiPu1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China;2.Bioscience(Tianjin)DiagnosticTechnologyLimitedCompany,Tianjin300000,China)

Objective To prepare anti-folic acid (FA) polyclonal antibody and develop a new non-balanced competing chemiluminescence analysis for clinical detection of FA.Methods Established the detection method by added FITC-FA-analogs and FA-HRP-antibody in the light emitting plate,which coated with anti-FITC antibody,to form the immune response complex of FITC/antibody-FITC-FA-analogs/FA-antibody-HRP.Then methodology evaluation was performed to evaluate the method performance;and further compared the detecting results with non-FITC system detection system and Electrochemiluminescence system (Roche Elecsys 2010).Results The ELISA results showed that the prepared anti-FA antibodies can recognize serum FA specificly.The methodology evaluation indicated that the linear correlation coefficient of the standard curve was 0.990 0;the analytical sensitivity was 1.21 ng/mL;the range of linear detection was 1.21～38.80 ng/mL;The coefficient variability of intra-assay was <5%,which was better than the results of non-FITC detection system;and the correlation coefficient was 0.908 1 compared with the Elecsys-2010 detection system.Conclusion The established chemiluminescence immunoassay for human serum FA has a good sensitivity and specificity,and suitable for clinical serum FA quantitative detecting.

FITC;non-equilibrium competition;folic acid;chemiluminescence immunoassay

聶紅(1969-)，副主任技師，本科，主要從事臨床免疫工作及研究?！?/p>

，E-mail:522564541@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.023

R915

A

1671-8348(2017)06-0792-04

2016-10-30

2016-11-28)