丁苯酞對(duì)腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及機(jī)制研究*

曹義甫，王秀芬，宋 培，解 坤，武 佳，劉翠紅，李 英

(1.河北省石家莊市第三醫(yī)院腎內(nèi)科 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科，石家莊050000；3.河北省石家莊市心腦血管病醫(yī)院內(nèi)一科 050000)

論著·基礎(chǔ)研究

丁苯酞對(duì)腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及機(jī)制研究*

曹義甫1，王秀芬2△，宋 培1，解 坤3，武 佳1，劉翠紅1，李 英2

(1.河北省石家莊市第三醫(yī)院腎內(nèi)科 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科，石家莊050000；3.河北省石家莊市心腦血管病醫(yī)院內(nèi)一科 050000)

目的 探討丁苯酞的腎保護(hù)機(jī)制及核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化還原反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)通路在腎間質(zhì)纖維化中的作用。方法 清潔級(jí)CD-1小鼠分為4組：假手術(shù)組、模型組、治療組、陽(yáng)性對(duì)照組。假手術(shù)組、模型組均給予等量生理鹽水灌胃。治療組、陽(yáng)性對(duì)照組分別給予丁苯酞、貝那普利灌胃。將各組小鼠分別于術(shù)后第3、7、14天處死，取梗阻側(cè)腎組織，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR等實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)腎組織Ⅰ型膠原蛋白、Nrf2及γ-GCS蛋白及mRNA的表達(dá)水平。并將Nrf2與γ-GCS及Ⅰ型膠原蛋白與γ-GCS進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 免疫組織化學(xué)及RT-PCR結(jié)果均顯示模型組Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白較假手術(shù)組有明顯升高，并且隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增多。治療組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)較模型組表達(dá)顯著減少。動(dòng)態(tài)觀察Nrf2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：與同期假手術(shù)組相比，術(shù)后3、7、14 d模型組小鼠腎組織中Nrf2、r-GCS、I型膠原蛋白mRNA表達(dá)均增加，給予丁苯酞干預(yù)后，Nrf2 mRNA在7、14 d時(shí)治療組與模型組比較表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，治療組Nrf2在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。RT-PCR學(xué)檢測(cè)γ-GCS mRNA變化趨勢(shì)同于Nrf2，其腎保護(hù)效應(yīng)隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)。相關(guān)性分析顯示：Nrf2與γ-GCS呈正相關(guān)(r=0.950，P<0.05)，γ-GCS與Ⅰ型膠原蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=-0.629，P<0.05)。結(jié)論 丁苯酞有抗腎間質(zhì)纖維化作用，機(jī)制可能與激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，提高腎間質(zhì)中Nrf2、抗氧化酶r-GCS活性水平有關(guān)。

腎間質(zhì)纖維化;核因子E2相關(guān)因子2;γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶;膠原Ⅰ型;丁苯酞

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis)是各種慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)的共同歸屬，是慢性腎衰竭的主要原因之一。其中氧化應(yīng)激在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor2,Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的非常重要的抗氧化應(yīng)激通路，在機(jī)體抗氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用。目前Nrf2-ARE信號(hào)通路在神經(jīng)損傷、癌癥、哮喘等領(lǐng)域的研究較多[1-3],而腎臟疾病的研究則側(cè)重在糖尿病腎病及腎臟缺血再灌注損傷等方面。丁苯酞具有抗氧化、抗炎、保護(hù)線粒體的功能，在缺血性腦卒中中廣泛應(yīng)用，在腎保護(hù)方面未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬通過(guò)建立單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)誘導(dǎo)的小鼠腎間質(zhì)纖維化模型，結(jié)合免疫組織化學(xué)、PCR等檢測(cè)手段，觀察梗阻性腎病小鼠腎臟中 Nrf2、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)情況并探索丁苯酞抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制及其對(duì)梗阻性腎病小鼠腎臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑 焦碳酸二乙酯(美國(guó)Amresco公司)，總RNA提取試劑、PCR反應(yīng)體系、DNA Marker(日本Takara公司)，756MC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，PE9600型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)，電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠)，紫外透射儀(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)，超低溫保存箱(MDF-382E，日本Sanyo公司)，高速冷凍離心機(jī)(1-15K，美國(guó)Sigma公司)等。

1.2 方法

1.2.1 UUO小鼠模型的制備 清潔級(jí)雄性CD-1小鼠72只,將小鼠分為4組：假手術(shù)組、模型組、治療組、陽(yáng)性對(duì)照組。采用結(jié)扎單側(cè)輸尿管的手術(shù)方法制造梗阻性腎病模型。假手術(shù)組、模型組均給予等量生理鹽水灌胃。治療組、陽(yáng)性對(duì)照組分別給予丁苯酞180 mg·kg-1·d-1,貝那普利5 mg·kg-1·d-1灌胃。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝食水，每天注意觀察小鼠的一般狀況，有無(wú)飲食及活動(dòng)異常。

1.2.2 標(biāo)本的采集和處理 各組分別于術(shù)后第3、7、14天處死6只小鼠，取梗阻側(cè)腎組織。用生理鹽水沖洗后放入10%甲醛中固定，待做免疫組織化學(xué)染色；部分腎組織放入用焦炭酸乙二酯(DEPC)水處理過(guò)的鋁箔紙中，后移入液氮迅速冷凍，最后-70 ℃保存用于RT-PCR檢測(cè)。

1.2.3 Ⅰ型膠原蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 通過(guò)二甲苯和梯度乙醇對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟及水化，自來(lái)水沖洗5 min，0.3% 去離子H2O2孵育30 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，緩沖液沖洗5 min，血清封閉，傾去多余的血清，勿洗，組織在緩沖液稀釋的一抗中孵育30 min，緩沖液沖洗切片5 min；組織在滴加生物素標(biāo)記的二抗中孵育30 min，緩沖液沖洗切片5 min，組織置于VECTASTAIN ABC試劑30 min，緩沖液沖洗切片5 min，組織在過(guò)氧化物酶底物溶液中孵育，直到所需的染色強(qiáng)度，自來(lái)水沖洗組織，復(fù)染、脫水、透明。使用Image-Pro Plus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件對(duì)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，每張切片選取5個(gè)視野對(duì)腎組織的病變情況進(jìn)行積分光密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.4 Nrf2、γ-GCS、Ⅰ型膠原蛋白mRNA檢測(cè) 首先進(jìn)行總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并行PCR反應(yīng)Ⅰ型膠原蛋白退火溫度為 54 ℃,上游引物5′-GAG ACA GGC GAA CAA GGT GA-3′,下游引物5′-CTC AAG GTC ACG GTC ACG AA-3′，擴(kuò)增片段為399 bp；Nrf2 退火溫度為 52 ℃，上游引物5′-GCC TTT TCT CCG CCT CTA AGT-3′，下游引物5′-CTG GGA CTG TAG TCT GGC G-3′，擴(kuò)增片段為246 bp；γ-GCS退火溫度為53 ℃，上游引物5′-CAT CCT CCA GTT CCT GCA CA-3′，下游引物 5′-CTC CGA TGC CGG ATG TTT CT-3 ′，擴(kuò)增片段為513 bp；GAPDH退火溫度為55 ℃，上游引物5′-CAT CAT CTC CGC CCC TTC TG-3′，下游引物，5′-TTG AGA GAA ATG CCA GCC CC-3 ′，擴(kuò)增片段為555 bp。分裝并稀釋real-time PCR引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物電泳。使用Quantity-One凝膠圖象分析軟件對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以?xún)烧咧e分吸光度的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 Ⅰ型膠原蛋白免疫組織化學(xué) 通過(guò)研究可看出，在假手術(shù)組小鼠腎小管上皮細(xì)胞質(zhì)中，Ⅰ型膠原蛋白有極少量表達(dá)。模型組表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，并且隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，病變進(jìn)一步加重，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)逐漸增多，至14 d時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰。治療組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)較模型組表達(dá)顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組Ⅰ型膠原蛋白的免疫組織化學(xué)結(jié)果±s，n=5)

a：P<0.05,與假手術(shù)組比較；b:P<0.05，與模型組比較；c:P<0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較.。

2.2 Ⅰ型膠原蛋白R(shí)T-PCR結(jié)果 與同期假手術(shù)組比較，術(shù)后3、7、14 d模型組小鼠腎組織中Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)，給予丁苯酞、貝那普利干預(yù)后，與同期模型組相比，治療組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠中Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，治療組Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)少于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A：PCR凝膠電泳圖；B：PCR分析圖；a:P<0.05,與同期假手術(shù)組比較;b：P<0.05，與同期模型組比較；c：P<0.05，與同期陽(yáng)性對(duì)照組組比較。

圖1 各組Ⅰ型膠原蛋白R(shí)T-PCR結(jié)果

A：PCR凝膠電泳；B：PCR分析圖；a:P<0.05,與同期假手術(shù)組比較;b：P<0.05，與同期模型組比較；c：P<0.05，與同期貝那普利組比較。

圖2 各組Nrf2 RT-PCR結(jié)果

A：PCR凝膠電冰圖；B：PCR分析圖；a:P<0.05,與同期假手術(shù)組比較;b：P<0.05，與同期模型組比較；c：P<0.05，與同期貝那普利組比較。

圖3 各組γ-GCS RT-PCR結(jié)果

2.3 Nrf2 RT-PCR結(jié)果 與同期假手術(shù)組相比，術(shù)后3、7、14 d模型組小鼠腎組織中Nrf2 mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)，給予丁苯酞、貝那普利干預(yù)后，與同期模型組相比，治療組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠中Nrf2 mRNA表達(dá)增加更加明顯，治療組Nrf2表達(dá)強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖2。

2.4 γ-GCS RT-PCR結(jié)果 與同期假手術(shù)組相比，術(shù)后3、7、14 d模型組小鼠腎組織中γ-GCS mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)，給予丁苯酞、貝那普利干預(yù)后，與同期模型組相比，治療組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠中γ-GCS mRNA表達(dá)增加更明顯(P<0.05)，治療組γ-GCS mRNA表達(dá)強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.5 相關(guān)性分析 對(duì)γ-GCS mRNA表達(dá)水平分別與Nrf2 mRNA、Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明：Nrf2 mRNA 與γ-GCS mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.950,P<0.05)，γ-GCS mRNA 與Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.629,P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

圖4 Nrf2 mRNA 與γ-GCS mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

圖5 γ-GCS mRNA 與Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討 論

許多研究表明，在終末期腎病的發(fā)展進(jìn)程中，腎小管間質(zhì)病變比腎小球病變所起作用更突出。觀察腎小管間質(zhì)在病理學(xué)檢查中的損害程度，對(duì)于患者的預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。因此，尋找針對(duì)腎臟纖維化的各種治療措施是當(dāng)前腎臟病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)選取清潔級(jí)CD-1小鼠結(jié)扎左側(cè)輸尿管誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化模型[4]。分別于第3、7、14天取梗阻側(cè)腎組織，用于免疫組織化學(xué)染色或RT-PCR，動(dòng)態(tài)觀察腎臟Nrf2、γ-GCS、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平。旨在觀察丁苯肽對(duì)腎間質(zhì)纖維化Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響，試圖從蛋白及轉(zhuǎn)錄水平研究丁苯肽防治腎間質(zhì)纖維化的可能機(jī)制。

γ-GCS是機(jī)體重要的抗氧化酶，受Nrf2-ARE信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，因此本研究選用上述指標(biāo)衡量機(jī)體抗氧化應(yīng)激狀態(tài)，并選用Ⅰ型膠原蛋白作為衡量腎間質(zhì)纖維化的指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)γ-GCS分子在模型組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)蛋白均有表達(dá)，且隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)進(jìn)一步增多，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，與Nrf2的表達(dá)含量呈正相關(guān)，與Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，從而證實(shí)γ-GCS有抑制腎間質(zhì)纖維化的作用，且在短期內(nèi)證實(shí)存在隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)、其濃度越高，即抑制腎纖維化程度也越強(qiáng)。提示γ-GCS參與了腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程。

Nrf2是轉(zhuǎn)錄因子CNC家族成員之一，包括6個(gè)高度保守的環(huán)氧氯丙烷(ECH)的同源結(jié)構(gòu)域。Nrf2是細(xì)胞中與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的一種細(xì)胞因子，最開(kāi)始被確認(rèn)具有預(yù)防腫瘤的功能。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)了Nrf2能對(duì)抗多種疾病的病理狀態(tài)[5-12]。目前,Nrf2/ARE信號(hào)通路在腎臟疾病的研究則側(cè)重在糖尿病腎病等方面，而在梗阻性腎病方面的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)顯示Nrf2分子在模型組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)蛋白均有表達(dá)，且隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)進(jìn)一步增多。提示在模型小鼠中，氧化應(yīng)激反應(yīng)分子Nrf2被激活，短期呈時(shí)間依賴(lài)性，但受實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ退?，僅觀察了短期14 d時(shí)間內(nèi)的基因表達(dá)水平。

本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)等觀察Nrf2、γ-GCS及Ⅰ型膠原蛋白在應(yīng)用丁苯肽治療后的表達(dá)變化，與模型組比較，治療組第7天腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)損傷開(kāi)始改善，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)開(kāi)始減少，到第14天時(shí)療效更佳，提示丁苯酞在減輕腎間質(zhì)纖維化作用的同時(shí)，存在明顯的時(shí)間依賴(lài)性。進(jìn)一步檢測(cè)腎組織中Nrf2及γ-GCS表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，治療組二者升高明顯，并且也存在時(shí)間依賴(lài)性。提示丁苯酞不管從基因水平還是從蛋白水平對(duì)腎間質(zhì)纖維化均有改善作用。從而推測(cè)丁苯酞治療腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制與激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，上調(diào)抗氧化酶γ-GCS有關(guān)[13]。

本研究中同時(shí)應(yīng)用貝那普利作為對(duì)照觀察發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組在第7、14天的治療效果不如治療組。推測(cè)貝那普利抑制血管緊張素Ⅱ后的抗腎間質(zhì)纖維化作用不如丁苯酞抑制活性氧(ROS)引起的腎間質(zhì)損傷作用強(qiáng)。

總之，在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Nrf2-ARE信號(hào)通路起到了保護(hù)作用，并進(jìn)一步證實(shí)Nrf2、γ-GCS能延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。丁苯酞有抗腎間質(zhì)纖維化作用，機(jī)制可能與激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，提高腎間質(zhì)中Nrf2、γ-GCS活性水平有關(guān)。短期觀察丁苯酞的腎保護(hù)作用優(yōu)于貝那普利。

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Effect mechanism study of butylphthalide on renal interstitial fibrosis*

CaoYifu1,WangXiufen2△,SongPei1,XieKun3,WuJia1,LiuCuihong1,LiYing2

(1.DepartmentofUrology,theThirdHospitalofShijiazhuangcity,Shijiazhuang,Heibei050031,China;2.DepartmentofUrology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Heibei050000,China;3.FirstDepartmentofMedicine,theHospitalofCardio-CerebrovascularDisease,Shijiazhuang,Heibei050000,China)

Objective To explore the rule of the Nrf2-ARE in renal interstitial fibrosis and the mechanism of butylphthalide on renal protective effect.Methods Seventy-two male CD-1 mice were divided into 4 groups,Sham group,UUO group,NBP group,ACEI group.The Sham group and UUO group were gavaged with physiological saline.The NBP group was gavaged with butylphthalide.The ACEI group was gavaged with benazepril.After 3,7,14 days,6 mice were executed and collection of kidney tissue.The expression of Nrf2,γ-GCS and type Ⅰ collagen were detected by immunohistochemisty,RT-PCR and Western blot.The correlation of Nrf2 and γ-GCS was assessmented by linear regression.Results The expression of type Ⅰ collagen in UUO group was increased compared with the Sham group,However,the expression of Type Ⅰ collagen in NBP group or ACEI group were reduced compared with the UUO group.Compared with Sham group,the expression of Nrf2mRNA,γ-GCSmRNA and type Ⅰ collagen mRNA in uuogroup were increased in 3,7,14 days after surgery.Compared with UUO group at 7th,14u day,the lelve of Nrf2 mRNA were apparently increased in NBP group (P<0.05).It was a positive correlation between the Nrf2 and γ-GCS and negative correlation between the γ-GCS and Type Ⅰ collagen.Conclusion The renal protective effect of butylphthalide in the renal interstitial fibrosis was more predominant than benazepril.The roles maybe occurred through increased the expression of Nrf2 and γ-GCS and alleviated the expression of Type Ⅰ collagen in nephridial tissue.

renal interstitial fibrosis；nuclear factor E2-related factor2；γ-GCS；type Ⅰ collagen；butylphthalide

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.007

河北省醫(yī)學(xué)科研重點(diǎn)課題計(jì)劃(ZD20140125)。

(1977-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事梗阻性腎和血液透析研究?！?/p>

，E-mail:wangxiufen@medmail.com.cn。

R285.5

A

1671-8348(2017)06-0742-04

2016-10-18

2016-11-16)