和顏坤泰膠囊對卵巢早衰大鼠性激素水平和VEGF、bFGF mRNA表達的影響*

徐文君，高 慧，李 楊，梁 策

(1.華北理工大學,河北唐山 063000;2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院中醫(yī)科,河北承德 067000)

論著·基礎(chǔ)研究

和顏坤泰膠囊對卵巢早衰大鼠性激素水平和VEGF、bFGF mRNA表達的影響*

徐文君1，高 慧2△，李 楊1，梁 策1

(1.華北理工大學,河北唐山 063000;2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院中醫(yī)科,河北承德 067000)

目的 探討中成藥坤泰膠囊治療不同階段卵巢早衰的效果。方法 采用雷公藤多苷片75 mg/kg制作卵巢早衰大鼠模型；將60只SD雌性大鼠分別為空白組，模型組，造模前坤泰膠囊組(造模前組)，造模中坤泰膠囊組(造模中組)，造模后坤泰膠囊組(造模后組)，西藥組(結(jié)合雌激素治療)。觀察大鼠行為學的改變，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、血清雌二醇(E2)及抗繆勒管激素(AMH)的水平。RT-PCR法檢測卵巢組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) mRNA的表達。結(jié)果 空白組和各給藥組血清FSH及LH水平明顯低于模型組(P<0.05)，E2、AMH水平明顯高于模型組(P<0.05)?？瞻捉M及各給藥組卵巢組織中VEGF、bFGF mRNA的表達明顯高于模型組(P<0.05)，其中造模前組VEGF、bFGF mRNA水平高于造模中組、造模后組(P<0.05)，造模前組VEGF mRNA的表達與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 坤泰膠囊對卵巢性激素水平具有調(diào)節(jié)作用，能提高血清E2及AMH的水平，降低血清FSH、LH的水平，提高卵巢對性激素水平的敏感性；修復受損的卵巢組織，促進卵泡的生長發(fā)育，從而抑制卵泡過早耗竭。

坤泰膠囊;卵巢功能早衰;雌激素類;血管內(nèi)皮生長因子A;堿性成纖維細胞生長因子2

卵巢早衰是指女性40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)及低雌激素和高促性腺激素的現(xiàn)象，臨床上多伴隨心煩易怒、烘熱汗出等圍絕經(jīng)期現(xiàn)象，已成為婦科領(lǐng)域常見的內(nèi)分泌疾病。近年來，卵巢早衰的發(fā)生已經(jīng)呈低齡化趨勢，且發(fā)病率逐年升高。目前，西醫(yī)對本病病因還有一部分尚未明確，治療上多以激素療法為主，但激素治療帶來的不良反應，增加靶器官癌變的不確定性，患者不易承受，臨床上依從性較差。坤泰膠囊服用簡便，主要成份為熟地、黃連、白芍、阿膠、黃芪、茯苓，共同起滋陰降火、滋腎養(yǎng)肝、養(yǎng)心安神、調(diào)節(jié)陰陽平衡的作用[1]。本課題擬觀察坤泰膠囊在卵巢儲備功能低下及卵巢早衰等不同卵巢損傷程度下的防治作用及機制，將為臨床使用本藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g，清潔級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號SCXK(京)2014-0004。飼料同為北京華阜康藥業(yè)提供的大鼠飼料，飲水為雙蒸水，動物飼養(yǎng)于自然光照好，清潔級實驗室內(nèi)。

1.2 實驗藥品及試劑 灌胃用雷公藤多苷片，每片10 mg，遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司提供，生產(chǎn)批號20150617，批準文號國藥準字Z42021212。坤泰膠囊每粒0.5 g，由貴州新天藥業(yè)股份有限公司提供，生產(chǎn)批號20150534，批準文號國藥準字Z20000083。大鼠的卵泡刺激素(FSH)、血清雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)、抗繚勒管激素(AMH)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 檢測試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、甘油醛3-磷酸脫氧酶(GAPDH)引物購自美國Invitrogen公司;Trizol總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。Multiskan MK3酶標儀購自芬蘭Thermo公司；熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司。

1.3 動物造模及分組 適應性喂養(yǎng)4 d后，對大鼠進行陰道脫落細胞學涂片，連續(xù)7 d光鏡下觀察，篩選出動情周期正常的60只健康雌性大鼠進入正式實驗。將雷公藤多苷片研碎加入等體積雙蒸水，配制成75 mg/kg,用法及劑量根據(jù)人鼠比例換算得出;坤泰膠囊將成品粉末與等體積雙蒸水混合后，同樣按照人鼠比例換算，配制成0.6 g/kg灌胃。所有藥品根據(jù)大鼠體質(zhì)量按照100 g/mL灌胃。將60只大鼠分為空白組、模型組、造模前組、造模中組、造模后組和西藥組，每周稱體質(zhì)量。模型組每天給予雷公藤多苷片水溶液進行灌胃，連續(xù)2周；空白組自由飲水；造模前組先給予坤泰膠囊灌胃36 d，結(jié)束24 h后，給予雷公藤多苷片灌胃14 d；造模中組于每天上午9點灌胃雷公藤多苷片，連續(xù)14 d，下午7點灌胃坤泰膠囊，連續(xù)36 d；造模后組先給予雷公藤多苷片灌胃14 d，再給予坤泰膠囊36 d；西藥組先給予雷公藤多苷片水溶液14 d，再給予結(jié)合雌激素片水溶液36 d，配制方法與雷公藤多苷片相同，濃度為0.625 g/kg。

1.4 取材 灌胃結(jié)束后，取材。大鼠麻醉后腹主動脈取血，以3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清；剖腹取子宮、卵巢。一部分用多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水后，浸蠟，包埋；一部分裝在無菌EP管中，-80 ℃冰箱保存用于PCR實驗。

1.5 血清性激素水平的檢測 采用ELISA法檢測FSH、LH、E2、AMH的水平，實驗步驟按照試劑說明書進行操作。(1)標準品的稀釋：按照所給圖表的稀釋濃度將標準品依次稀釋。(2)加樣：分別設(shè)空白孔，標準孔，待測樣品孔。在酶標被板上標準品加樣50 μL，待測樣品各加樣品稀釋液40 μL，然后加待測樣品10 μL,樣品最終稀釋度為5倍。(3)溫育：封板膜封板后37 ℃溫育30 min，然后洗滌。(4)加酶：每孔加入酶標試劑50 μL,除空白孔外。(5)顯色：每孔加入顯色劑A、B，37 ℃避光顯色10 min。(6)終止：每孔加入終止液，終止反應。(7)結(jié)果判定：在Multiskan MK3酶標儀上，450 nm波長依序測量各孔吸光度(A)值。

1.6 real-time PCR法檢測大鼠卵巢中VEGF、bFGF mRNA的表達 Trizol法提取總RNA，取各組卵巢總RNA各1 μg分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應;real-time PCR法檢測卵巢組織VEGF、bFGF mRNA的相對表達水平，結(jié)果用2-△△Ct表示。反應體系為上游引物(10.0 μmol/L)0.5 μL,下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，2×Master Mix 10 μL,每孔加入對應的cDNA 2.0 μL,加ddH2O補足至20.0 μL。將上述96-PCR板放置于real time PCR儀上進行反應，按照如下程序進行：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 40 s,40個循環(huán)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應結(jié)束后，按95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃15 s；并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃。VEGF、bFGF引物設(shè)計見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 血清FSH、LH、E2、AMH水平的測定 與空白組相比，模型組、造模前組、造模中組、造模后組血清中FSH、LH水平明顯增高，E2、AMH水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，各給藥組血清FSH、LH水平明顯降低，E2、AMH水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明坤泰膠囊可通過調(diào)節(jié)血清FSH、LH、E2、AMH的水平，改善激素水平，防止卵泡過快過早耗盡；與西藥組相比，造模前組血清FSH、LH、E2、AMH 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模中組及造模后組血清FSH、LH、E2、AMH水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明使用坤泰膠囊預防卵巢早衰效果與西藥組相同。

表2 大鼠血清水平FSH、LH、E2、AMH的影響

a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c:P<0.05，與西藥組比較。

2.2 大鼠卵巢VEGF、bFGF mRNA的表達 與空白組相比，模型組卵巢VEGF、bFGF mRNA的表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組卵巢VEGF、bFGF mRNA的表達明顯升高(P<0.01)，說明坤泰膠囊有修復并促進受損卵巢新生血管生成的作用；與西藥組相比，造模前組卵巢VEGF mRNA 的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，造模中組及造模后組bFGF mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。從表中還可以看出VEGF、bFGF mRNA的表達從造模前到造模后組逐漸降低，見表3、4。

2.3 各樣本實時擴增曲線圖和樣本擴增產(chǎn)物曲線圖 見圖1～3。

表3 實時熒光PCR大鼠卵巢VEGF mRNA的 相對表達

a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c:P<0.05，與西藥組比較。

A：擴增曲線圖；B：溶解曲線圖。

圖1 VEGF 基因?qū)崟r擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

A：擴增曲線圖；B：溶解曲線圖。

圖2 bFGF 基因?qū)崟r擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖表4 實時熒光PCR大鼠卵巢bFGF mRNA的 相對表達

a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c:P<0.05，與西藥組比較。

A：擴增曲線圖；B：溶解曲線圖。

圖3 GAPDH基因?qū)崟r擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

3 討 論

雷公藤多苷片為中草藥雷公藤植物根莖中的提取物，具有抗炎及抗腫瘤等活性成份，廣泛應用于腎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。但其不良反應明顯，長期使用會對消化系統(tǒng)、血管系統(tǒng)等器官造成損害，尤以生殖系統(tǒng)的損害最為嚴重[2]。王瑛等[3]在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)使用雷公藤藥物制劑治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎等疾病時，可引起女性月經(jīng)不調(diào)及閉經(jīng)等癥狀，因此懷疑雷公藤多苷片可損傷卵巢功能。首創(chuàng)使用雷公藤藥物制劑造成SD大鼠卵巢早衰模型[4]。本實驗在造模后發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)弓背、蜷縮、脫毛、行動緩慢、體質(zhì)量下降等，陰道圖片顯示動情間期時間較長，性激素檢測模型組FSH、LH血清水平明顯升高(P<0.05)，E2、AMH水平明顯降低(P<0.05)，提示造模成功。FSH是檢測卵巢早衰的最重要指標，也用來判斷損傷程度[5]。卵巢早衰患者由于體內(nèi)性激素水平低下，可引起脂質(zhì)代謝紊亂，極易導致高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠狀動脈性心臟病等，因此對卵巢早衰的治療已涉及預防保健的范疇[6]。中醫(yī)“治未病”思想提出未病先防，已病防變，認為治病應防重于治[7]。卵巢早衰的發(fā)病是一種漸進性過程，從卵巢儲備功能下降到卵巢功能衰竭大約需要1～6年[8]。本課題在造模后組基礎(chǔ)上進一步研究預防卵巢早衰的療效，建立造模前組及造模中組。認為造模前組及造模中組為卵巢儲備功能下降的“未病”階段，造模后組為卵巢早衰的“已病”階段，分別給藥。

卵巢早衰的發(fā)病原因主要是原始卵泡儲備過少，卵泡閉鎖或者耗竭太快。卵巢血流是維持卵泡生長,類固醇激素分泌及卵泡對促性腺激素敏感性的重要因素[9]，VEGF、bFGF為血管內(nèi)皮生長因子，可改善受損卵巢血管通透性，尤其可以特異性地促進類固醇激素生成器官的細胞增殖存活和趨化，促進新生血管生成[10]。

LISA結(jié)果顯示：與模型組比較，各給藥組在灌胃坤泰膠囊后，E2、AMH水平明顯升高(P<0.05)，F(xiàn)SH、LH水平明顯降低(P<0.05)，提示坤泰膠囊能提高血清中E2、AMH的水平，降低FSH、LH的水平，改善卵巢功能。RT-PCR結(jié)果顯示：模型組中VEGF、bFGF的表達明顯減少(P<0.05)，說明卵巢內(nèi)血流減少，卵泡減少，血管受損。灌胃坤泰膠囊后VEGF、bFGF表達明顯升高(P<0.05)。說明坤泰膠囊可保護血管內(nèi)皮細胞，使卵巢內(nèi)血液運行通暢，提高卵巢儲備能力，防止卵巢早衰。進一步研究發(fā)現(xiàn)：致病因素時間不同，VEGF、bFGF的表達不同。實驗表明造模前組的表達及造模中組高于造模后組。

卵巢早衰是婦科常見的內(nèi)分泌疾病，西醫(yī)治療主要結(jié)合實驗室檢查及患者臨床表現(xiàn)給予激素替代療法，此療法可恢復月經(jīng)規(guī)律，促進生殖器官發(fā)育，但長時間用藥會導致各種不良反應的發(fā)生，增加其他疾病的患病率[11]。而中成藥治療具有良好的調(diào)節(jié)作用，也無長期使用激素的不良反應，為卵巢早衰的治療提供新的治法。和顏坤泰膠囊主要成分為熟地黃、白芍、阿膠、茯苓、黃芩、黃連等六味中藥組成。其中熟地黃為君藥，滋陰養(yǎng)血、補腎、生精益髓；黃連、白芍、阿膠為臣藥，黃連清虛火、清心除煩，與熟地黃配伍，滋陰降火、交通心腎；白芍、阿膠補血養(yǎng)陰,補而不滯,養(yǎng)陰不膩,且能收斂精氣,固攝元氣；黃芩、茯苓為佐藥,黃芩清熱瀉火，茯苓健脾益氣,安神，以上六味中藥合用,起到滋陰養(yǎng)血,補精益髓,安神除煩,交通心腎,調(diào)節(jié)陰陽平衡的作用[12]，通過調(diào)補腎陰腎陽可增加卵巢供血及營養(yǎng)，從而達到激活卵巢功能的效果[13]。其中熟地黃含有的5-羥甲基糖醛成分具有改善血液循環(huán)的作用 ，阿膠具有補血滋陰的作用二者均可以上調(diào)VEGF、bFGF mRNA的表達[13]，促進卵泡發(fā)育，改善受損卵巢。

實驗證明，坤泰膠囊有治療卵巢早衰的作用，其預防作用更為明顯。通過調(diào)節(jié)激素水平及上調(diào)VEGF、bFGF mRNA的表達減輕雷公藤多苷片對卵巢功能造成的損害，延緩或阻遏卵巢早衰，促進卵泡發(fā)育，改善卵巢功能。

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Effect of Yan Kuntai capsule on rat sex hormone level and VEGF bFGF mRNA expression in different stages and premature ovarian failure*

XuWenjun1,GaoHui2△，LiYang1,LiangCe1

(1.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Heibei063000,China;2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde,Heibei067000,China)

Objective To explore the Chinese medicine treatment of QUNTAI capsule in different stages of premature ovarian failure effect.Methods Sixty SD female rats were divided into 6 groups:normal group,model group,prevention group,intervention group,the treatment group,and Western medicine group.To observe the changes of behavior in rats,enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the levels of follicle stimulating hormone FSH,LH,serum estradiol E2,and anti Mueller hormone AMH.RT-PCR was used to detect ovarian tissue vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic effect of fibroblast growth factor (bFGF) mRNA expression.Results The levels of FSH and LH in the normal group and the administration group were significantly lower compare to model group (P<0.05),and the contents of AMH and E2were significantly higher compare to model group (P<0.05).The FSH and LH content in the model group was significantly higher than that of the normal group and each treatment group,E2,AMH content was significantly lower than that of the normal group and each treatment group (P<0.05);the expression of VEGF and bFGF mRNA in each treatment group and nornial group was significantly higher than that of model group (P<0.05),Prevention group was higher than intervention group and treat ment group (P<0.05),there was no Gignificont difference between prevention group and Western medicine group(P>0.05).Conclusion QUNTAI capsule can increase serum E2and AMH levels,lower serum FSH,LH levels,improve ovarian sensitivity to sex hormone levels,repair damaged ovarian tissue,promote follicular growth and development,Thereby inhibiting premature follicle depletion.

medicine Kuntai;ovarian failure,premature;estrogens;vascular endothelial growth factor A;fibroblast growth factor 2

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.006

河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研計劃課題(2016068)；國家中醫(yī)藥管理局全國名老中醫(yī)藥專家高慧傳承工作室建設(shè)項目(2015048157)；河北省省級重大醫(yī)學科研項目(zyzd2013018)；河北省政府資助臨床醫(yī)學優(yōu)秀人才培養(yǎng)項目(2014571024)。

徐文君(1990-)，在讀碩士，主要從事中醫(yī)婦科學研究?！?/p>

，E-mail：gaohuihbcd@163.com。

R271.9

A

1671-8348(2017)06-0738-04

2016-10-13

2016-11-16)