白虎定喘口服液的質(zhì)量檢測(cè)

趙增成，林樹乾，李桂明，馮敏燕，黃中利，楊世發(fā)，宋敏訓(xùn)，傅 劍，李 穎

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟(jì)南 250023)

白虎定喘口服液的質(zhì)量檢測(cè)

趙增成，林樹乾，李桂明，馮敏燕，黃中利，楊世發(fā)，宋敏訓(xùn)*，傅 劍，李 穎

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟(jì)南 250023)

為了建立白虎定喘口服液的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法(TLC)對(duì)處方中金銀花、黃芩、知母、板藍(lán)根進(jìn)行鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)黃芩中有效成分黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好，特異性強(qiáng)；在0.103 mg/mL～0.824 mg/mL范圍內(nèi)黃芩苷濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，陰性對(duì)照無(wú)干擾，加樣回收率平均為97.98%，精密度試驗(yàn)RSD為0.61%。說(shuō)明建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可對(duì)白虎定喘口服液的質(zhì)量進(jìn)行有效檢測(cè)。

白虎定喘口服液；薄層色譜；高效液相色譜；質(zhì)量檢測(cè)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一種急性、高度接觸性的呼吸道疾病，以氣喘、咳嗽、流鼻液為特征[1]，該病極易與支原體等發(fā)生混合感染，導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸困難，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了有效防控該病，我們研制了新型中獸藥制劑“白虎定喘口服液”。該制劑由生石膏、知母、黃芩、金銀花、板藍(lán)根等組成，可有效預(yù)防和治療家禽外感邪熱入肺所致的發(fā)熱、痰多、咳喘之證。質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立是新藥研究的主要內(nèi)容之一，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是否科學(xué)、合理、可行，直接關(guān)系到藥品質(zhì)量的可控性、安全性及有效性[2]。復(fù)方中藥制劑由多味中藥共同組成，所含成分復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)互相干擾現(xiàn)象嚴(yán)重[3]，因此對(duì)其質(zhì)量檢測(cè)方法進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究，制定出合理可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是中藥研發(fā)的關(guān)鍵內(nèi)容。本研究的目的就是要建立簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好的新獸藥薄層鑒別和含量測(cè)定方法，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效檢測(cè)、評(píng)價(jià)和控制，為制定出白虎定喘口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而申報(bào)國(guó)家三類新獸藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和器材 高效液相色譜儀，島津公司產(chǎn)品；MS205DU型分析天平，METTLER TOLEDO公司產(chǎn)品；KQ5200DB型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；硅膠G板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜，青島海洋化工廠產(chǎn)品。

1.1.2 藥品與試劑 金銀花對(duì)照藥材(批號(hào)121060-201107)、綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753-201314)、黃芩對(duì)照藥材(批號(hào)120955-201309)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715-201318)、知母對(duì)照藥材(批號(hào)121070-200804)、芒果苷對(duì)照品(批號(hào)111607-200402)、板藍(lán)根對(duì)照藥材(批號(hào)121177-201407)、(R，S)-告依春對(duì)照品(批號(hào)12090716)，中國(guó)食品藥品檢定研究院產(chǎn)品；白虎定喘口服液，山東昊泰科技藥業(yè)有限公司試制；乙睛為色譜純?cè)噭患状?、丙酮、甲酸、異丙醇、甲酸、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、冰醋酸、石油醚、磷酸等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 薄層鑒別 參照《中國(guó)獸藥典》(2010)各相關(guān)藥材的鑒別方法[4]，對(duì)本品中處方藥材成分進(jìn)行了鑒別研究。試驗(yàn)分別對(duì)樣品處理、薄層板、點(diǎn)樣量、展開劑等影響薄層色譜圖的因素進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，確定出最佳薄層色譜條件。

1.2.1.1 金銀花的薄層鑒別 取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取金銀花對(duì)照藥材0.5 g，加水50 mL，置沸水浴30 min，過(guò)濾，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)颖? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取本品20 mL，加甲醇60 mL，超聲處理30 min，3 500 r/min離心30 min，取上清液置水浴上蒸干，殘?jiān)颖?0 mL，充分溶解后濃縮至1 mL，作為供試品溶液。同法制成不含金銀花藥材的陰性對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法，取對(duì)照品溶液1 μL、對(duì)照藥材溶液2 μL，供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以異丙醇-甲酸-水(9∶1∶1)為展開劑，展開，取出晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.1.2 知母的薄層鑒別 取芒果苷對(duì)照品，加500 mL/L乙醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取知母對(duì)照藥材1 g，加水30 mL，置沸水浴0.5 h，過(guò)濾，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取本品10 mL，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，3 500 r/min離心30 min，取上清液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，充分溶解，作為供試品溶液。同法制成不含知母藥材的陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，取對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各1 μL，供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-水(1∶1)為展開劑，展開，取出晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.1.3 黃芩的薄層鑒別 取黃芩對(duì)照藥材1 g，加水30 mL，置沸水浴0.5 h，過(guò)濾，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取本品10 mL，加乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，合并乙酸乙酯層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，充分溶解，作為供試品溶液。同法制成不含黃芩藥材的陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各5 μL分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-丙酮-冰醋酸-甲酸(8∶1∶1∶1)為展開劑，展開，取出晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。

1.2.1.4 板藍(lán)根的薄層鑒別 取(R，S)-告依春對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取板藍(lán)根對(duì)照藥材1 g，加水50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取本品10 mL，加乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL，合并乙酸乙酯層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，充分溶解，作為供試品溶液。同法制成不含板藍(lán)根藥材的陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，取對(duì)照品溶液5 μL，對(duì)照藥材溶液5 μL～10 μL，供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60℃～90℃)-乙酸乙酯(1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。

1.2.2 高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷含量 本品處方中，黃芩苦寒，歸肺、胃、大腸、膽四經(jīng)，具清熱燥濕、瀉火解毒之功，尤長(zhǎng)于清肺熱。黃芩的主要活性成分為黃芩苷，是重要的生物活性物質(zhì)[5-6]，分子式、結(jié)構(gòu)式明確，因此將黃芩苷確定為本品含量測(cè)定的指標(biāo)成分。參照《中國(guó)獸藥典》(2010年版二部)黃芩的含量測(cè)定方法[4]，試驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)HPLC測(cè)定法進(jìn)行了方法學(xué)考察。

1.2.2.1 色譜條件 在對(duì)影響指標(biāo)成分黃芩苷分離度和響應(yīng)值的主要因素進(jìn)行了考察和優(yōu)化的基礎(chǔ)上，最終確定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-4 g/L磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液的制備 黃芩苷對(duì)照品溶液的制備：取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密量取本品2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20 min，混勻，即得。

陰性對(duì)照品溶液的制備：按處方制備工藝制成去除黃芩的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

1.2.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取黃芩苷對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各20 μL，按以上所建立的色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄色譜圖。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用甲醇分別配制不同濃度的黃芩苷溶液，按建立的色譜條件依次測(cè)定，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并做線性回歸。

1.2.2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液每次進(jìn)樣20μL，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 將同一批號(hào)的樣品，按供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，按建立的色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取供試品溶液，按建立的色譜條件分別于0、1、2、4、8、12 h進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，記錄峰面積。

1.2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取樣品(黃芩苷含量為15.588 3 mg/mL)1 mL，置50 mL容量瓶中，共9份，分別按樣品中黃芩苷量的80%、100%、120%加入黃芩苷對(duì)照品，用甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液定容至50 mL，搖勻，放置，取上清液作為供試品溶液。按照建立的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄色譜圖及峰面積。測(cè)定出加入標(biāo)準(zhǔn)品后樣品中黃芩苷的含量，并按以下公式計(jì)算回收率。

1.2.2.9 耐用性試驗(yàn) 耐用性是指測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度[7]。本試驗(yàn)對(duì)HPLC法測(cè)定中流動(dòng)相的組成比例、pH、不同品牌色譜柱、柱溫、流速及檢測(cè)波長(zhǎng)等主要變動(dòng)因素進(jìn)行考察。

檢測(cè)波長(zhǎng)考察：精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，在不同檢測(cè)波長(zhǎng)條件下(280 nm±5 nm范圍內(nèi)變化)分別測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

柱溫考察：精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，在不同柱溫條件下(30℃±5℃范圍內(nèi)變化)分別測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

流速考察：精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，分別進(jìn)樣，在不同流速條件下(±20%變動(dòng)范圍內(nèi))測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

流動(dòng)相組成比例考察：精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，分別進(jìn)樣，不同流動(dòng)相組成比例條件下(±5%變動(dòng)范圍內(nèi))測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

流動(dòng)相pH變化考察：精密吸取供試品溶液和對(duì)照品品溶液各20 μL，在不同pH條件下(2.34±0.2范圍內(nèi)變化)，分別測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

不同色譜柱考察：精密吸取供試品溶液和對(duì)照品品溶液各20 μL，使用3種不同的色譜柱分別進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

1.2.2.10 樣品黃芩苷含量測(cè)定 選取10批樣品，按照建立的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄峰面積，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量。

2 結(jié)果

2.1 薄層鑒別結(jié)果

2.1.1 金銀花的薄層鑒別 由圖1可知，供試品色譜中，在與對(duì)照品綠原酸色譜和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品色譜在相應(yīng)位置則無(wú)熒光斑點(diǎn)。3批樣品均出現(xiàn)了相同結(jié)果。

2.1.2 知母的薄層鑒別 由圖2可知，供試品色譜中，在與對(duì)照品芒果苷色譜和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品色譜在相應(yīng)位置則無(wú)熒光斑點(diǎn)。3批樣品均出現(xiàn)了相同結(jié)果。

2.1.3 黃芩的薄層鑒別 由圖3可知，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品色譜在相應(yīng)位置則無(wú)熒光斑點(diǎn)。3批樣品均出現(xiàn)了相同結(jié)果。

2.1.4 板藍(lán)根的薄層鑒別 由圖4可知，供試品色譜中，在與對(duì)照品(R，S)-告依春色譜和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上無(wú)熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)。3批樣品均出現(xiàn)了相同結(jié)果。

1.綠原酸；2.對(duì)照藥材；3.樣品Ⅰ；4.樣品Ⅱ；5.樣品Ⅲ；6.陰性對(duì)照

1.Chlorogenic acid;2.Control herbs;3.Sample Ⅰ;4.Sample Ⅱ;5.Sample Ⅲ ;6.Negative control

圖1 制劑中金銀花的薄層色譜圖

Fig.1 TLC of FlosLonicerae

1.芒果苷；2.對(duì)照藥材；3.樣品Ⅰ；4.樣品Ⅱ；5.樣品Ⅲ；6.陰性對(duì)照

1.Mangiferin;2.Control herbs;3.Sample Ⅰ;4.Sample Ⅱ;5.Sample Ⅲ ;6.Negative control

圖2 制劑中知母的薄層色譜圖

Fig.2 TLC ofRhizomaAnemarrhenae

1.對(duì)照藥材；2.樣品Ⅰ；3.樣品Ⅱ；4.樣品Ⅲ；5.陰性對(duì)照

1.Control herbs;2.Sample Ⅰ;3.Sample Ⅱ;4.Sample Ⅲ ;5.Negative control

圖3 制劑中黃芩的薄層色譜圖

Fig.3 TLC ofRadixScutellariae

2.2 黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜圖顯示(圖5)，供試品中黃芩苷峰與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致，并且黃芩苷與其他組分達(dá)到了較好分離，而陰性對(duì)照品在相同保留時(shí)間處未出現(xiàn)該峰。結(jié)果表明，樣品中黃芩苷峰與相鄰峰分離良好，分離度R>1.5，陰性對(duì)照品對(duì)黃芩苷測(cè)定無(wú)干擾作用。

1.(R，S)-告依春；2.對(duì)照藥材；3.樣品Ⅰ；4.樣品Ⅱ；5.樣品Ⅲ；6.陰性對(duì)照

1.Epigoitrinn;2.Control herbs;3.Sample Ⅰ;4.Sample Ⅱ;5.Sample Ⅲ ;6.Negative control

圖4 制劑中板藍(lán)根的薄層色譜圖

Fig.4 TLC ofRadixIsatidis

A.黃芩苷對(duì)照品;B.白虎定喘口服液樣品C.陰性對(duì)照

A.Baicalin control;B.Baihu Dingchuan Oral Liquid sample;C.Negative control

圖5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)HPLC色譜圖

Fig.5 HPLC of system suitability test

2.2.2 黃芩苷線性關(guān)系考察 5種不同濃度的黃芩苷所測(cè)定的色譜峰面積見表1。

表1 不同濃度的黃芩苷溶液色譜峰面積

以黃芩苷濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6。將表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程：y=7×107x+375 732，(R2=0.999 8)。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣濃度在0.103 mg/mL～0.824 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖6 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 精密度試驗(yàn) 6次測(cè)定的峰面積分別為43 832 184、43 502 860、43 813 253、43 923 347、44 214 572和44 194 768，RSD為0.61%，表明本方法精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 6次測(cè)定的峰面積分別為43 100 954、43 451 040、43 665 074、43 781 278、44 037 223和44 073 299，RSD為0.85%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品在0、1、2、4、6、8、12 h時(shí)，測(cè)定的峰面積分別為44 055 261、43 723 178、43 275 997、42 975 882、42 817 371和42 605 655，RSD為1.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 結(jié)果見表2，平均回收率為97.98%，RSD為3.4%，表明該方法準(zhǔn)確可信。

2.2.7 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察 結(jié)果見表3。試驗(yàn)表明，在設(shè)定吸收波長(zhǎng)280 nm上下浮動(dòng)5 nm時(shí)，含量測(cè)定結(jié)果RSD為0.086%，無(wú)顯著性影響。

2.2.7.2 柱溫考察 結(jié)果見表4。試驗(yàn)表明，在設(shè)定柱溫30 ℃上下浮動(dòng)5 ℃時(shí)，含量測(cè)定結(jié)果RSD為1.63%，無(wú)顯著性影響。

2.2.7.3 流速考察 結(jié)果見表5。試驗(yàn)表明，在設(shè)定流速1 mL/min上下浮動(dòng)20%時(shí)，含量測(cè)定結(jié)果RSD為0.82%，無(wú)顯著性影響。說(shuō)明在測(cè)定黃芩苷含量時(shí)，流速在0.8 mL/min～1.2 mL/min之間都能較準(zhǔn)確的測(cè)定其含量。

2.2.7.4 流動(dòng)相組成比例考察 結(jié)果見表6。試驗(yàn)表明，在設(shè)定流動(dòng)相比例50∶50上下浮動(dòng)5%時(shí)，含量測(cè)定結(jié)果RSD為3.29%，無(wú)顯著性影響。

2.2.7.5 pH考察 結(jié)果見表7。試驗(yàn)表明，在設(shè)定流動(dòng)相pH上下浮動(dòng)0.2時(shí)，含量測(cè)定結(jié)果RSD為5.84%，無(wú)顯著性影響。

2.2.7.6 不同色譜柱考察 結(jié)果見表8。試驗(yàn)表明，使用不同色譜柱，含量測(cè)定結(jié)果RSD為2.96%，無(wú)顯著性影響。

2.2.8 樣品黃芩苷含量測(cè)定 10批樣品的含量測(cè)定結(jié)果見表9，黃芩苷平均含量為13.113 mg/mL。

表2 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 不同檢測(cè)波長(zhǎng)條件下黃芩苷測(cè)定結(jié)果

表4 不同柱溫條件下黃芩苷測(cè)定結(jié)果

表5 不同流速條件下黃芩苷測(cè)定結(jié)果

表6 不同流動(dòng)相組成比例條件下黃芩苷測(cè)定結(jié)果

表7 流動(dòng)相不同pH條件下黃芩苷測(cè)定結(jié)果

3 討 論

薄層色譜法(TLC)是一種快速、靈敏、高效的分離和定性分析微量物質(zhì)的方法，其目的就是檢出制劑中處方藥物成分，以對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行控制[8-9]。高效液相色譜法(HPLC)是中藥有效成分含量測(cè)定中應(yīng)用最為廣泛的一種分析方法，具有分析速度快、分離效率高、應(yīng)用范圍廣、檢測(cè)靈敏度高、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。中藥制劑樣品的基質(zhì)和成分組成十分復(fù)雜，而且樣品中被測(cè)成分往往含量較低，因此對(duì)TLC、HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行研究，以保證檢測(cè)方法的專屬性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，是制定出科學(xué)合理質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵[12-13]。本研究所建立的TLC鑒別方法，專屬性強(qiáng)，色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，可快速確定制劑中處方藥味金銀花、知母、黃芩、板藍(lán)根成分的存在；所建立的HPLC測(cè)定法，精確性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性良好，可快速準(zhǔn)確地測(cè)定出制劑中黃芩苷的含量。以上所確定的TLC鑒別和HPCL含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步制定出白虎定喘口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。

表8 不同色譜柱黃芩苷測(cè)定結(jié)果

表9 樣品黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果

因本品為復(fù)方藥物，藥液中成分復(fù)雜，相互之間存在著干擾，單純按照國(guó)家獸藥典中各相應(yīng)中藥材的薄層色譜鑒別方法，對(duì)本品進(jìn)行鑒別難以達(dá)到理想效果。試驗(yàn)中在參照獸藥典的同時(shí)，根據(jù)每次試驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合藥物成分分析，逐步對(duì)樣品前處理、薄層板、點(diǎn)樣量、展開劑進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化，最終確定了本品中金銀花、知母、黃芩、板藍(lán)根四味中藥成分的最佳薄層色譜條件。如金銀花的鑒別，開始參照獸藥典金銀花項(xiàng)下的薄層鑒別方法，使用了硅膠H薄層板，但發(fā)現(xiàn)色譜分離度差、斑點(diǎn)不清晰、陰性對(duì)照中存在干擾。后參照中國(guó)藥典雙黃連口服液的薄層鑒別方法及查閱其他文獻(xiàn)資料，將薄層板改為聚酰胺薄膜，結(jié)果色譜分離度好、斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)。在知母的鑒別中，因制劑中知母成分含量低，按照獸藥典方法直接用稀乙醇提取，薄層色譜斑點(diǎn)不清晰、背景有干擾。采用甲醇提取，離心取上清液蒸干，再用少量甲醇溶解處理后，因去除了樣品中的部分雜質(zhì)、提高了知母成分濃度，結(jié)果薄層色譜斑點(diǎn)清晰。在黃芩的鑒別中，開始參照獸藥典使用了聚酰胺薄膜，但陰性對(duì)照存在干擾，最后選用硅膠GF254薄層板，消除了陰性對(duì)照干擾現(xiàn)象。在黃芩苷的含量測(cè)定上，參照獸藥典黃芩項(xiàng)下方法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，但采用原流動(dòng)相時(shí)，色譜圖中黃芩苷峰與相鄰峰難以分離，根據(jù)藥液的極性特點(diǎn)，對(duì)流動(dòng)相逐步進(jìn)行了調(diào)整，最終選擇以甲醇-4 g/L磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相，確定了最佳的色譜條件。

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Quality Detection of Baihu Dingchuan Oral Liquid

ZHAO Zeng-cheng,LIN Shu-qian,LI gui-ming,FENG Min-yan,HUANG Zhong-li, YANG Shi-fa,SONG Min-xun,FU Jian,LI Ying

(PoultryInstitute,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan,Shandong,250023,China)

In order to establish the quality detection method of Baihu Dingchuan oral liquid,FlosLonicerae,RadixScutellariae,RhizomaAnemarrhenaeandRadixIsatidisin the prescription were identified by TCL,and the method of HPLC for the determination of baicalin was studied.The results showed that the dots of TLC were clear,separation degree was good,specificity was strong;The baicalin has a good linear relationship in the range of 0.103 mg/mL-0.824 mg/mL.The negative control had no interference.The average recovery rate was 97.98%,and precision test RSD is 0.61%.The detection method established in this study is simple,accurate,specific and reproducible,which can effectively detect the quality of Baihu Dingchuan oral liquid.

Baihu Dingchuan oral liquid; TLC; HPLC; quality detection

2016-07-06

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303040-10)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GNC113004，2016GNC113007)；濟(jì)南市金種子企業(yè)關(guān)鍵產(chǎn)品提升計(jì)劃項(xiàng)目( 201602085)

趙增成(1968-)，男，山東濰坊人，大學(xué)，副研究員，主要從事禽病防治及獸藥研發(fā)工作。*通訊作者

S853.74

A

1007-5038(2017)03-0079-07