豬圓環(huán)病毒2型誘導3D4/2細胞氧化應激模型的建立

尹 丹，譚紅連，郝祝兵，楊 劍，韋英益，曾 蕓，李 亮，廖玲玲*，胡庭俊*

(1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西南寧 530001；3.廣西柯新源原種豬有限責任公司，廣西南寧 530001)

豬圓環(huán)病毒2型誘導3D4/2細胞氧化應激模型的建立

尹 丹1，譚紅連1，郝祝兵1，楊 劍1，韋英益1，曾 蕓1，李 亮2,3，廖玲玲2,3*，胡庭俊1*

(1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西南寧 530001；3.廣西柯新源原種豬有限責任公司，廣西南寧 530001)

通過研究不同濃度豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)對體外感染3D4/2細胞產(chǎn)生氧化應激水平的影響，來確定建立PCV2體外誘導3D4/2細胞氧化脅迫模型的條件。以5個不同濃度PCV2感染組(100、10-1、10-2、10-3、10-4)作用于3D4/2細胞2 h，棄去病毒液，加入含100 mL/L胎牛血清1640培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，于4、8、12、24、48 h分別收集細胞上清液或細胞，測定NO、ROS、GSH、GSSG、XOD、MPO和iNOS等指標。10-1PCV2感染3D4/2細胞24 h、48 h后顯著升高細胞NO水平，感染4 h～24 h顯著升高細胞ROS水平，降低細胞GSH水平和GSH/GSSG比值；10-1PCV2感染3D4/2細胞4 h、8 h顯著升高細胞GSSG水平；10-1PCV2感染3D4/2細胞4、8、12、24 h均能顯著升高細胞XOD、MPO、iNOS活力，提示10-1PCV2感染3D4/2細胞一定程度上改變了細胞氧化還原狀態(tài)，誘導了細胞產(chǎn)生氧化應激，而病毒感染后48 h未檢測到PCV2核酸。表明PCV2感染后4 h～24 h能誘發(fā)3D4/2細胞氧化應激，選擇10-1PCV2作為氧化應激模型的感染劑量。

豬圓環(huán)病毒2型；豬肺泡巨噬細胞；氧化應激

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postwea-ning mutisystenic wasting syndrome，PMWS)的主要致病原，已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。PCV2復制的主要場所是機體的單核-巨噬細胞和抗原遞呈細胞，PCV2感染后，病豬體內(nèi)肺、肝、腎、扁桃體、胸腺、外周血單核細胞、支氣管淋巴結、腹股溝淋巴結中均能檢測到PCV2核酸[1]。PCV2感染主要表現(xiàn)為淋巴細胞缺失和單核細胞浸潤等，引起豬的免疫系統(tǒng)的破壞，免疫能力受到抑制。PCV2感染后誘導了B淋巴細胞的凋亡，使細胞減少，進而抗原遞呈的樹突細胞數(shù)量減少，T細胞無法識別抗原，從而引起免疫抑制[2]。氧化應激(oxidative stress)是指細胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，導致活性氧自由基(reactive oxy-gen species，ROS)產(chǎn)生速率大于清除速率，從而引起細胞和組織損傷的一種病理狀態(tài)。氧化損傷主要包括生物膜脂質(zhì)過氧化、細胞內(nèi)蛋白及酶活性、DNA損傷、最后導致細胞死亡或凋亡，并引發(fā)疾病[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染是引發(fā)多種動物疾病的直接原因，并與自由基堆積導致的氧化損傷密切相關。一方面，病毒感染引起細胞活性氧自由基的累積；另一方面，病毒感染后，吞噬細胞活化并釋放氧化性細胞因子，如TNF-α和IL-1β等。相關研究結果表明，部分病毒在感染動物機體和在動物機體內(nèi)復制的過程中，會破壞宿主細胞的氧化還原狀態(tài)的平衡，而宿主細胞氧化還原狀態(tài)的改變反過來也能影響病毒的感染和復制。Gray P等[4]研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染PK-15細胞能促進ROS的產(chǎn)生，誘導細胞產(chǎn)生氧化應激，而ROS的產(chǎn)生反過來促進了PCV2的復制。

為了探討PCV2感染是否能引起免疫細胞氧化還原狀態(tài)的改變，本試驗通過PCV2體外感染豬肺泡巨噬細胞系3D4/2細胞，測定感染細胞分泌一氧化氮(NO)的水平、活性氧(ROS)水平、還原型谷胱甘肽(GSH)含量、黃嘌呤氧化酶(XOD)活性、髓過氧化物酶(MPO)活性、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)活性，初步探討PCV2感染量、感染時間與活性氧水平動態(tài)變化的相關性，建立3D4/2細胞氧化脅迫體外模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細胞 豬圓環(huán)病毒2型(SH株)，南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室分離保存，經(jīng)PK-15細胞增殖后測得病毒滴度為104TCID50/0.1mL；豬腎傳代細胞系PK-15細胞、豬肺泡巨噬細胞系3D4/2細胞，廣西大學動物科學技術學院預防獸醫(yī)學教研室提供。

1.1.2 主要試劑 南美洲胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液，美國Gibco公司產(chǎn)品；黃嘌呤氧化酶(XOD)檢測試劑盒、髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究中心產(chǎn)品；噻唑藍、鄰苯二甲醛(OPT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；萘乙烯二胺，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；對氨基苯磺酸，天津福晨化學試劑。

1.1.3 主要儀器 UV1750型紫外可見光分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；Multimode Plate Reader多功能酶標儀，瑞士Perkin Elme公司產(chǎn)品；S1000梯度PCR儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；C150細胞培養(yǎng)箱，德國BINDER公司產(chǎn)品；TS100-F倒置顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離培養(yǎng)及分組處理

1.2.1.1 細胞的分離培養(yǎng) 3D4/2細胞復蘇后用含100 mL/L胎牛血清1640培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入瓶中，于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進行傳代培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106cell/mL鋪于24孔板，每孔1 mL，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)貼壁，棄上清，分別加入PCV2 200 μL，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2孵育2 h，PBS洗2遍，加入100 mL/L胎牛血清1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4、8、12、24、48 h。細胞處理后棄上清，PBS洗3次，收集細胞，反復凍融4次～5次，按照苯酚-氯仿法提取DNA，通過PCR擴增檢測病毒核酸。

1.2.1.2 試驗分組及處理 分別設置細胞對照組和5個不同濃度PCV2感染組(100、10-1、10-2、10-3、10-4)，調(diào)整細胞濃度為5×106個/mL，按1 000 μL/孔加至24孔板內(nèi)，細胞對照組加入無血清1640培養(yǎng)液200 μL，病毒組加入等量同濃度病毒液，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄去病毒液，PBS清洗3次后，每孔加入1 mL含50 mL/L胎牛血清1640培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，于4、8、12、24、48 h分別收集細胞上清液或細胞，用于NO、ROS、GSH、GSSG、XOD、MPO和iNOS等指標測定。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性 細胞培養(yǎng)44 h后吸出110 μL上清，加入10 μL 5 g/L MTT繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后棄上清，加入100 μL DMSO，室溫避光靜置10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD 450 nm值。

1.2.3 Griess法檢測上清中NO含量 細胞分別培養(yǎng)4、8、12、24 h后，收集細胞上清100 μL，加入100 μL Griess試劑，室溫避光反應10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD 450 nm值，根據(jù)NaNO2標準曲線計算NO含量。

1.2.4 DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平 細胞分別培養(yǎng)4、8、12、24、48 h，棄上清，每孔加入500 μL 10 μmol/L DCFH-DA熒光探針，孵育30 min后棄上清，PBS洗3次，再加入1 000 μL PBS，收集細胞200 μL于96孔黑板中，于熒光酶標儀測定其熒光值(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

1.2.5 OPT熒光法檢測細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài) 細胞處理后分別于4、8、12、24、48 h后收集細胞，加入0.05 g/mL三氯醋酸400 μL，冰水浴超聲破碎1 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清分裝于-80℃保存。

GSH測定：取200 μL上清加入3.6 mLPBS-EDTA緩沖液(pH8.0)和200 μL OPT，混勻室溫孵育40 min，于熒光酶標儀測定激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長425 nm處熒光值，并根據(jù)標準曲線計算含量。

GSSG測定：取100 μL上清加入40 μL NEM(0.04 mol/L)室溫孵育30 min，再加入1.9 mL NaOH(0.1 mol/L)和100 μL OPT(1 mg/mL)，混勻，室溫孵育15 min，于熒光酶標儀測定激發(fā)波長337.8 nm，發(fā)射波長421.6 nm處熒光值，并根據(jù)標準曲線計算含量。

1.2.6 分光光度法檢測細胞內(nèi)XOD、MPO及iNOS活性 細胞處理后，分別于4、8、12、24、48 h后棄上清，分別收集細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗3次，再加入500 μL PBS，超聲破碎，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用于XOD、MPO及iNOS活性的檢測，嚴格按照XOD、MPO、iNOS測定試劑盒說明進行操作。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SSP18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用LSD法進行兩兩比較。肩標*表示與細胞對照組相比差異顯著(P<0.05)，肩標**表示與細胞對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2 結果

2.1 PCV2感染3D4/2細胞的結果

PCV2感染3D4/2細胞8 h、12 h后經(jīng)PCR擴增，可見特異性片段，感染后24 h、48 h所得特異性片段較弱，而感染后4 h未見特異性片段(圖1)。結果表明PCV2能成功感染3D4/2細胞。

M.DNA 標準DL 2 000;1,2.4 h;3,4.8 h;5,6.12 h;7,8.24 h;9,10.48 h;11.陽性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1,2.4 h;3,4.8 h;5,6.12 h;7,8.24 h;9,10.48 h;11.Positive control

圖1 PCR檢測3D4/2細胞中PCV2 DNA結果

Fig.1 The results of PCV2 DNA in 3D4/2 cells detected by PCR

2.2 不同濃度PCV2體外感染對3D4/2細胞活性的影響

PCV2原液(100PCV2)感染3D4/2細胞，可明顯降低細胞活性，與細胞對照組相比差異顯著(P<0.05)；其余各濃度的PCV2感染3D4/2細胞組，細胞活性均有一定程度降低，但與細胞對照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

圖2 PCV2感染對3D4/2細胞存活率的影響

2.3 不同濃度PCV2體外感染3D4/2細胞對NO分泌的影響

10-1PCV2感染3D4/2細胞12 h，可升高細胞分泌NO水平，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；其余濃度PCV2感染，均能一定程度升高感染細胞分泌NO水平，但與細胞對照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖3)。結果表明，PCV2感染3D4/2細胞，能促進細胞分泌NO。

圖3 PCV2感染3D4/2細胞對NO分泌的影響

2.4 不同濃度PCV2體外感染3D4/2細胞對ROS產(chǎn)生的影響

PCV2感染3D4/2細胞4、8、12、24 h后，ROS水平隨時間逐漸升高。PCV2原液感染細胞8、12、24 h，可升高細胞內(nèi)ROS水平，與細胞對照組比較差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；10-1PCV2感染3D4/2細胞4、8、12、24 h，均能升高細胞內(nèi)ROS水平，與細胞對照組比較差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)(圖4)。

2.5 PCV2體外感染3D4/2細胞對細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響

10-1PCV2感染3D4/2細胞4、8、12、24 h后，可降低細胞內(nèi)GSH水平，與細胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)；10-2PCV2感染12 h、24 h后，可降低細胞內(nèi)GSH水平，與細胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)，感染后8 h降低細胞內(nèi)GSH水平，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；10-3PCV2感染3D4/2細胞12 h、24 h后，可降低細胞內(nèi)GSH水平，與細胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)(圖5)。

圖4 PCV2感染3D4/2細胞對ROS產(chǎn)生的影響

圖5 PCV2感染3D4/2細胞對細胞內(nèi)GSH的影響

10-1PCV2感染3D4/2細胞4、12、24 h，可升高細胞內(nèi)GSSG水平，感染4 h、12 h的升高水平與細胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)，感染24 h升高水平，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；100PCV2感染3D4/2細胞24 h，可升高細胞內(nèi)GSSG水平，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；10-2PCV2感染3D4/2細胞4 h，可升高細胞內(nèi)GSSG水平，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)(圖6)。

圖6 PCV2感染3D4/2細胞對細胞內(nèi)GSSG的影響

100PCV2感染3D4/2細胞4 h、24 h，可降低感染細胞內(nèi)GSH/GSSG比值，與細胞對照組比較差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；10-1PCV2感染3D4/2細胞4、8、12、24 h，可降低感染細胞內(nèi)GSH/GSSG比值，感染4 h、24 h時GSH/GSSG比值與細胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)，感染8 h、12 h GSH/GSSG比值與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；10-2PCV2感染3D4/2細胞4、8、24 h后，可降低感染細胞內(nèi)GSH/GSSG比值，與細胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)(圖7)。

圖7 PCV2感染3D4/2細胞對細胞內(nèi)GSH/GSSG的影響

2.6 不同濃度PCV2感染3D4/2細胞對XOD活性的影響

10-1PCV2感染3D4/2細胞4、8、12 h，可升高感染細胞XOD活力，與細胞對照組比較差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；10-2PCV2感染3D4/2細胞8 h，可升高感染細胞XOD活力，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)(圖8)。

圖8 PCV2感染3D4/2細胞對細胞XOD活力的影響

2.7 不同濃度PCV2感染3D4/2細胞對MPO活性的影響

100PCV2感染3D4/2細胞4 h、12 h，可升高感染細胞MPO活力，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；10-1PCV2感染3D4/2細胞4、8、12 h，可升高感染細胞XOD活力，與細胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)；10-2PCV2感染3D4/2細胞24 h，可升高感感染細胞XOD活力，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)(圖9)。

圖9 PCV2感染3D4/2細胞對細胞MPO活力的影響

2.8 不同濃度PCV2感染3D4/2細胞對iNOS活性的影響

100PCV2感染3D4/2細胞4、12、24 h，可升高感染細胞iNOS活力，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；10-1PCV2感染3D4/2細胞4、8、12 h，可升高感染細胞iNOS活力，與細胞對照組比較差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；10-2PCV2感染3D4/2細胞12 h、24 h，可升高感染細胞iNOS活力，與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)(圖10)。

圖10 PCV2感染3D4/2細胞對細胞iNOS活力的影響

3 討論

巨噬細胞的吞噬作用是機體清除外來微生物入侵并參與炎癥反應的一個免疫應答過程，豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages，PAM)和其他單核巨噬細胞能抵抗各種病原體的感染，在先天性免疫和獲得性免疫中都起著重要的作用，是肺臟初級防御的重要免疫細胞，又是PCV2感染的重要靶細胞[5-6]。PMWS患豬肺部的損傷程度與豬肺泡巨噬細胞感染PCV2有關[7-8]。3D4/2細胞作為豬肺泡巨噬細胞系，攜帶SV40大T抗原，經(jīng)轉(zhuǎn)染PSV3-neo，質(zhì)粒攜帶新霉素抗性基因，含有SV40病毒DNA序列，常用于豬病毒學及免疫學研究。相關研究表明，3D4/2細胞對牛腺病毒、豬瘟病毒、人副流感病毒、水皰性口炎病毒、豬腺病毒、單純皰疹病毒1、非洲豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、牛痘病毒、豬水皰病病毒等均易感[9-10]。但PCV2是否能成功感染3D4/2細胞尚未見報道。為了觀察PCV2是否能感染豬肺泡巨噬細胞系3D4/2細胞，本研究利用PCV2與3D4/2細胞共同培養(yǎng)2 h后，洗凈PCV2，3D4/2細胞進行培養(yǎng)，利用PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳觀察PCV2特異性擴增條帶。結果顯示，病毒感染后8 h～48 h均可檢測到特異性條帶，提示PCV2成功感染3D4/2細胞。為了探討不同劑量的PCV2感染3D4/2細胞不同時間，對3D4/2細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)是否有影響，本文觀察了PCV2感染3D4/2細胞后對細胞NO、ROS、GSH、GSSG水平及MPO、XOD、iNOS活力的影響。結果表明，10-1PCV2感染3D4/2細胞12 h后，可顯著升高細胞分泌NO水平、感染3D4/2細胞4 h～24 h，可顯著升高細胞ROS水平、降低細胞GSH水平和GSH/GSSG比值；10-1PCV2感染3D4/2細胞4、12、24 h，可顯著升高細胞GSSG水平；10-1PCV2感染3D4/2細胞4、8、12 h，可顯著升高細胞XOD、MPO、iNOS活力，提示10-1PCV2能成功感染3D4/2細胞，且一定程度上改變了細胞氧化還原狀態(tài)，誘導細胞產(chǎn)生氧化應激。

綜上所述，本研究采用PCV2成功誘導3D4/2細胞發(fā)生了氧化應激，并且確立10-1PCV2體外感染3D4/2細胞4 h～24 h，是建立3D4/2細胞氧化脅迫模型的最佳條件。該模型能夠進一步應用于PCV2感染與3D4/2氧化應激相關的研究，可為PCV2的感染機制和治療方法研究提供參考。

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Establishment of Oxidative Stress Model of 3D4/2 Cells Induced by PCV2 inVitro

YIN Dan1, TAN Hong-lian1, HAO Zhu-bing1, YANG Jian1, WEI Ying-yi1, ZENG Yun1, LI Liang2,3, LIAO Ling-ling2,3, HU Ting-jun1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530005,China; 2.GuangxiInstituteofAnimalHusbandry,Nanning,Guangxi,530001,China;3.GuangxiKeXinyuanLimitedLiabilityCompanyofOriginalBreeding,Nanning,Guangxi,530001,China)

The study was carried out to establish a oxidative stress model induced by PCV2invitro.The 3D4/2 cells were incubated with different concentrations of PCV2 to investigate the levels of oxidative stress in the cells.3D4/2 cells were incubated with PCV2 at dose of 100,10-1,10-2,10-3or 10-4.The supernatant or cells were collected at different time to observe the levels of NO,ROS,GSH,GSSG,cell viability,and the activities of XOD,MPO,iNOS.The level of NO in 3D4/2 cells infected with 10-1PCV2 was significantly increased after 24 h,48 h,and the levels of ROS,GSSG and the activities of XOD,MPO,iNOS were significantly upregulated post infection.These findings suggested that PCV2 infection changed the redox state of 3D4/2 cells and induced 3D4/2 cells to be in state of oxidative stress.PCV2 infection induced oxidative stress in 3D4/2 cells,and 10-1PCV2 was selected as the infection dose of oxidative stress model,the infection time was determined to be 4 h-24 h.

PCV2;porcine alveolar macrophage;oxidative stress

2016-07-10

國家自然科學基金項目(31260619)；高等學校博士學科點專項科研基金博導類資助項目(20134501110004)；國家科技支撐計劃項目(2014BAD13B0102)

尹 丹(1990-)，女，貴州赫章人，碩士研究生，主要從事中藥藥理學研究。*通訊作者

S852.659.2;S852.33

A

1007-5038(2017)03-0016-06