基于二硫代氨基甲酸鹽自組裝的糖芯片制備與表征

程 昉 王漢奇 許 曠 何 煒

(1大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點實驗室，遼寧 大連 116023；2大連理工大學(xué)制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023；3大連理工大學(xué)化工學(xué)院，遼寧 大連 116023)

基于二硫代氨基甲酸鹽自組裝的糖芯片制備與表征

程 昉1,2,*王漢奇1,2許 曠1,2何 煒3

(1大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點實驗室，遼寧 大連 116023；2大連理工大學(xué)制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023；3大連理工大學(xué)化工學(xué)院，遼寧 大連 116023)

糖基傳感芯片是定量研究糖－蛋白相互作用的有力工具。傳統(tǒng)糖基傳感芯片的制備過程通常涉及糖基硫醇衍生物的合成，過程復(fù)雜且產(chǎn)率較低。本文采用脫氧氨基糖與二硫化碳溫和條件下一步反應(yīng)合成了一類新型糖基自組裝功能分子-糖基二硫代氨基甲酸鹽(DTC)化合物，進而在金襯底芯片上構(gòu)筑了糖基傳感功能膜。采用X 射線光電子能譜(XPS)分析了該糖基傳感功能膜的元素組成和元素化學(xué)環(huán)境；采用表面等離子體共振(SPR)和酶聯(lián)凝集素分析(ELLA)技術(shù)定量分析了其在蛋白質(zhì)水平的糖生物學(xué)活性。通過混合自組裝的方法，制備了一系列表面葡萄糖密度不同的糖基傳感功能膜并測定了伴刀豆球蛋白(Con A)吸附的熱力學(xué)和動力學(xué)數(shù)據(jù)。通過調(diào)控表面密度，我們觀察到了蛋白在葡萄糖表面吸附的多價態(tài)現(xiàn)象。當(dāng)自組裝溶液中葡萄糖-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)低于 1%時，Con A 呈現(xiàn)單價態(tài)吸附，其解離平衡常數(shù)(Kd)為(39.10 ± 0.12) μmol·L－1；當(dāng)自組 裝 溶 液 中 葡萄糖-DTC 摩爾分 數(shù) 高 于 2%時 ，Con A 呈 現(xiàn)多價態(tài) 吸 附 ， 解離平衡 常 數(shù) 降 至(1.17 ± 0.18) μmol·L－1。本文所發(fā)展的糖基自組裝功能分子合成方法快速便捷、適用范圍廣，通過混合自組裝可以實現(xiàn)蛋白結(jié)合價態(tài)的調(diào)控，是一種深入研究基于糖-蛋白相互作用的諸多生物過程的有效工具。

糖－蛋白相互作用；二硫代氨基甲酸鹽；多價態(tài)吸附；熱力學(xué)；動力學(xué)；自組裝膜

1 引言

糖與蛋白質(zhì)的相互作用在生命體內(nèi)扮演著重要的角色。糖與受體蛋白的特異性識別介導(dǎo)了許多重要的生命活動，如細(xì)胞粘附、胞間信息傳遞、病毒感染、免疫應(yīng)答等1－5。糖與植物凝集素的相互作用可以激活 T-細(xì)胞而刺激免疫系統(tǒng)，如刀豆球蛋白 A(Con A)可結(jié)合不同細(xì)胞膜受體而引發(fā)細(xì)胞增殖6。糖與蛋白質(zhì)相互作用也會導(dǎo)致多種疾病，如免疫球蛋白(IgG)糖鏈上半乳糖的缺乏會導(dǎo)致IgG被甘露糖結(jié)合凝集素識別，從而導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生7。因此，研究糖與蛋白質(zhì)的相互作用，獲取相關(guān)的定量信息，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著重要意義。

無標(biāo)記生物傳感技術(shù)，如石英晶體微天平(QCM)、表面等離子體共振(SPR)等，由于其即時檢測、靈敏高、可定量等優(yōu)點，已成為近年來研究糖與蛋白質(zhì)相互作用的主要手段8－11。無標(biāo)記生物傳感技術(shù)檢測分子間相互作用的關(guān)鍵是制備具有特異性識別和捕捉目標(biāo)蛋白的生物傳感功能膜。最常見的制備生物傳感功能膜的方法是基于金襯底的硫醇自組裝12。為了構(gòu)建展示糖分子的生物傳感功能膜，多種糖的巰基衍生物被合成和純化并利用植物凝集素蛋白定量分析了所固定糖分子的生物學(xué)活性13。糖的巰基衍生物制備過程通常涉及羥基的保護與脫保護，以及構(gòu)型的保持，導(dǎo)致總產(chǎn)率偏低。例如，Corn等以半乳糖和甘露糖為原料合成巰基末端糖衍生物，該過程涉及糖分子多個羥基保護和脫保護，多次重結(jié)晶保持糖的構(gòu)型以及反復(fù)洗滌和干燥操作，耗時長，且總收率僅為11%8。

近年的研究表明二硫代氨基甲酸鹽(DTC)化合物是一類良好的雙齒配體，分子中的DTC結(jié)構(gòu)能夠與金原子形成配位鍵，從而在金襯底上形成自組裝膜14。由于 DTC 有結(jié)構(gòu)低電荷、齒距相對較小的優(yōu)點，其形成的自組裝結(jié)構(gòu)相對于硫醇自組裝膜具有高密度、高穩(wěn)定性的特點，因此已被應(yīng)用于金襯底上傳感功能膜的構(gòu)筑15。Morf等16使用掃描 隧 道 顯 微 鏡(STM)分 析 了 DTC 自 組 裝 膜 的 結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示僅有硫原子在金表面成鍵，形成的自組裝膜平整度高。Choi等17采用巰基乙醇溶液處理DTC自組裝膜和硫醇自組裝膜，比較了兩種自組裝膜結(jié)構(gòu)的變化，實驗表明DTC自組裝膜具有更高的穩(wěn)定性。用二硫化碳與氨基化合物在室溫下在堿性水溶液中反應(yīng)制備DTC類化合物，采用該溶液處理金襯底傳感元件即可制備高質(zhì)量的DTC 自組裝膜18。該方法操作簡單、條件溫和，是一種快速制備生物傳感功能膜的方法。尤其對于許多天然珍稀樣品，反應(yīng)步驟少、條件溫和，能夠保證較高的產(chǎn)率與活性。鑒于DTC化合物在自組裝中的優(yōu)勢，制備糖基DTC化合物將能很大程度簡化糖基傳感功能膜的制備過程，從而推動糖－蛋白質(zhì)相互作用的研究。

本文以單糖和二糖為例，通過氨基化糖分子與二硫化碳反應(yīng)，合成了一類糖基DTC化合物。采用所合成的糖基DTC化合物制備了基于金襯底的糖基傳感功能膜，采用X射線光電子能譜(XPS)表征糖基傳感功能膜的元素組成、高分辨碳譜和硫譜。使用SPR傳感技術(shù)在蛋白質(zhì)水平研究了多種糖基自組裝膜的生物活性。通過混合自組裝調(diào)控表面糖基密度，并結(jié)合酶聯(lián)凝集素檢測(ELLA)技術(shù)和SPR技術(shù)定量研究了表面糖基化密度介導(dǎo)的蛋白質(zhì)多價態(tài)生物現(xiàn)象。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

葡萄糖(98%)、阿拉伯糖(98%)、N-乙酰葡萄糖胺(98%)和乳糖(98%)均購于阿拉丁試劑有限公司；碳酸銨(98%)、氨水(25%)和二硫化碳(99%)均購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；可溶型單組分四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液購于天根生化科技(北京)有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，98%)和牛血清蛋白(BSA，98%)購于大連美侖生物有 限 公 司 ； 伴 刀 豆 球 蛋 白 (Concanavalin A， Con A，SDS-PAGE 級)、麥胚凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA，SDS-PAGE 級)、花生凝集素(Peanut agglutinin， PNA， SDS-PAGE 級)、 荊 豆 凝 集 素 I (Ulex europaeusI，UEAI，SDS-PAGE級)均購于Vector Laboratories(美國)；牛血清蛋白辣根過氧化酶復(fù)合物(BSA-hrp,＞ 95%)和伴刀豆球蛋白辣根過氧化物酶復(fù)合物(Con A-hrp,＞ 95%)購于北京博勝經(jīng)緯科技有限公司。

糖基二硫代氨基甲酸鹽結(jié)構(gòu)分析采用 Bruker Avance II 400M 核磁共振儀(Bruker公司，德國)和Thermo Fisher 6700 高 級 傅 里 葉 變 換 紅 外 光 譜 儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國)測定。紫外-可見光譜采用 Eppendorf BioSpectrometer(Eppendorf公司，德國)測定。糖基功能化傳感芯片的表面結(jié)構(gòu)采用 Thermo Scientific ESCALAB 250Xi X 射線光電子能譜儀(Thermo Fisher Scientific 公司，美國)表征。X 射線源采用 Al Kα(hv=1486.6 eV)，光電子出射角為 90°，采用污染碳 C 1s(結(jié)合能(EB)=285.0 eV)作為能量校正。采用 Thermo Advances和 XPS Peaker軟件分別對元素組成和高分辨譜圖進行分析。蛋白吸附實驗采用 BioSUPLAR 400 型雙通道角度分辨表面等離子共振儀(BioSuplar公司，德國)測定。

2.2 二硫代氨基甲酸鹽糖的合成

2.2.1 脫氧氨基糖的制備

以葡萄糖為例，制備 1-氨基脫氧葡萄糖。在15 mL 甲醇中加入 1.80 g 葡萄糖(0.01 mol)和 1.57 g碳酸銨(0.01 mol)，加熱至 46 °C 后，緩慢滴加氨水至溶液澄清?；亓鞣磻?yīng)12 h，冷卻結(jié)晶、抽濾、干燥，得到1-氨基脫氧葡萄糖。

2.2.2 糖基二硫代氨基甲酸鹽(glycol-DTC)的制備

將上述產(chǎn)物全部加入15 mL 甲醇中。取氫氧化鈉 0.4 g(0.01 mol)溶于 2 mL 水，加入其中，溶解后加入二硫化碳 0.605 mL(0.01 mol)。室溫反應(yīng) 12 h 后，加入乙醇結(jié)晶，抽濾、干燥得產(chǎn)物 1.55 g，收 率 60.7% 。 核 磁 共 振 碳 譜 (13C NMR)(100 MHz D2O)： δ 163.1(C＝S), δ 95.8(CHNH), δ 60.8 (CH2OH), δ 69.7 － 76.6(other CHOH). 質(zhì) 譜 峰 (Ms): 254.04[M-H]－。

2.2.3 肌氨酸二硫代氨基甲酸鹽(sarcosine-DTC)的制備

將 1.0 g 肌 氨 酸(0.011 mol)溶 于 3 mL 氨 水 中 ，冰浴下攪拌 5 min。將 1.2 mL 二硫化碳(0.020 mol)溶于 3 mL甲醇中，冰浴下緩慢滴入肌氨酸氨水溶液 中 ， 升溫至 40 °C 反 應(yīng) 30 min，4 °C 結(jié) 晶 。抽濾、甲醇洗滌、干燥，得肌氨酸二硫代氨基甲酸鹽 1.38 g，收率 63.0%。13C NMR(100 MHz D2O)：δ 209.7(COOH),δ 176.3(C＝S),δ 60.4(NCH2COOH)，δ 43.9(NCH3)。

2.3 糖基功能化傳感芯片的制備和應(yīng)用

將 SPR 芯 片 至 于 紫 外-臭 氧 清 洗 儀 處 理 30 min， 水 超 聲 清 洗 5 min × 3 次 ， 乙 醇 超 聲 清 洗 5 min × 3次，氮氣吹干備用。將清洗后的SPR芯片浸 入 2 mmol·L－1的 DTC 溶 液 中 ， 室 溫 靜 置 12 h，超純水沖洗3次，氮氣吹干，避光保存。

2.4 SPR檢測流程

(1)將處理后的SPR芯片裝入SPR儀內(nèi)，固定流速 50 μL·min－1，通入緩沖液 5 min 測得基線 ；

(2) 使 用 HEPES 緩 沖液(pH 8.5，含 0.1 mmol· L－1Ca2+)配置 0.1 mg·mL－1的 BSA、PNA、Con A、WGA、UEA I溶液，分別通入蛋白質(zhì)溶液 10 min測得吸附曲線；

(3)通入緩沖液 5 min，測得解離曲線；

(4) 通入 8 mol·L－1的尿素溶液 5 min 再生 ；

(5) 通入緩沖液 10 min 沖洗尿素溶液，重新構(gòu)筑基線。

2.5 表面自組裝密度對糖基化表面生物活性的影響

2.5.1 不同表面密度的糖基化表面的制備

將 1 cm × 1 cm 鍍 金 硅 片 浸 入 食 人 魚 溶 液(濃V(H2SO4):V(H2O2)=3:1，注意：食人魚溶液對有機物有強烈的腐蝕性)室溫處理 1 h，用水超聲清洗5 min × 2 次，乙醇超聲清洗 5 min × 2 次，氮氣吹干 備 用 。 分 別 配 置 glycol-DTC 摩 爾 分 數(shù) 為 0% 、25% 、50%、75%、100%的 glycol-DTC/sarcosine-DTC混合溶液。將清洗后的鍍金硅片浸入上述混合溶液中，室溫自組裝12 h，水沖洗3次，氮氣吹干，避光保存。

2.5.2 不同表面密度的糖基化表面生物活性定性實驗

(1)蛋白質(zhì)非特異性吸附實驗：將清洗后的鍍金硅片置于 BSA-hrp 溶液(0.01 mg·mL－1)中，37 °C孵育 1.5 h。HEPES 緩沖液沖洗 3 次后置于 200 μL HEPES 緩 沖 液 中 ， 加 入 200 μL 四 甲 基 聯(lián) 苯 胺(TMB)溶液，37 °C 孵育 5 min 后加入 200 μL 硫酸(1 mol·L－1)終止反應(yīng)，測定反應(yīng)液在 450 nm 處的吸光度。

(2)植物凝集素特異性結(jié)合實驗：將清洗后的鍍金硅片置于 BSA 溶液(0.01 mg·mL－1)中，37 °C孵育 1.5 h。用 HEPES 緩沖液沖洗 3 次后置于 Con A-hrp 溶 液 (0.01 mg ·mL－1)中 ， 37 °C 孵 育 1.5 h。HEPES 緩沖液沖洗 3 次后置于 200 μL HEPES 緩沖液中，加入 200 μL TMB 溶液，37 °C 孵育 5 min 后加入 200 μL 硫酸(1 mol·L－1)終止反應(yīng)，測定反應(yīng)液在450 nm處的吸光度。

2.5.3 不同表面密度的糖基化表面生物活性定量實驗

將清洗后的SPR芯片置于葡萄糖二硫代氨基甲 酸 鹽(glucose-DTC)摩 爾 分 數(shù) 分 別 為 1%、2% 、5%和 100%的 glucose-DTC/sarcosine-DTC 混合溶液中室溫下自組裝 12 h 制備表面密度不同的糖基化功能芯片。裝入SPR儀中，依次通入不同濃度的Con A 溶液，測定其吸附量，作等溫吸附曲線并獲取熱力學(xué)與動力學(xué)常數(shù)。

圖1 糖基二硫代氨基甲酸鹽的制備流程Fig.1 Synthesis of glycol-DTC

圖2 葡萄糖基二硫代氨基甲酸鹽化合物的紫外-可見(a)和紅外(b)光譜表征Fig.2 UV-Vis(a)and IR(b)spectra of glucose and glucose-DTC

3 結(jié)果與討論

3.1 糖基二硫代氨基甲酸鹽的合成與表征

糖基二硫代氨基甲酸鹽的制備如圖1所示。首先，糖和碳酸銨在甲醇和氨水中反應(yīng)，糖分子中異頭碳羥基活性較高，溶液中的氨與異頭碳羥基發(fā)生親核取代反應(yīng)生成脫氧氨基糖(2)。反應(yīng)中氨水提供氨源，碳酸銨維持溶液中氨的濃度，促進反應(yīng)正向進行。然后，脫氧氨基糖與二硫化碳在堿性條件下發(fā)生親電加成反應(yīng)，生成 glycol-DTC(3)。

DTC結(jié)構(gòu)是具有共軛體系，含有DTC結(jié)構(gòu)的化合物在紫外光區(qū)有兩個明顯的吸收峰，可以分別 歸 屬 為 N―C―S 結(jié) 構(gòu) 中 雙 鍵 的 π－ π*躍 遷(255 nm)和 S―C―S 結(jié)構(gòu)中硫原子上非鍵電子的 n－π*躍遷(290 nm)19，因此，使用紫外-可見光譜可以監(jiān)測化 合 物 分 子 中 的 DTC 結(jié) 構(gòu) 。 以 葡 萄 糖 為 例(圖2(a))， 原 料 葡 萄 糖 在 255 和 290 nm 處 無 吸 收 峰 ，而 glucose-DTC 在 255 和 290 nm 處有明顯吸收峰 ，表明通過兩步反應(yīng)成功在糖分子中引入DTC結(jié)構(gòu)。

采用紅外光譜對化合物(3)進行進一步表征，以葡萄糖為例，結(jié)果如圖 2(b)所示。與原料葡萄糖的紅外吸收譜圖相比，glucose-DTC 在 830 和 890 cm－1左右的吸收峰可歸屬為糖 的 α 或 β 構(gòu)型吸收峰，表明了反應(yīng)過程中未破壞糖分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；1609 cm－1處出現(xiàn)一個新的吸收峰，可以歸屬為 N―H 伸縮振動峰；1498 和 1350 cm－1處吸收峰為碳氮鍵伸縮振動吸收，二者分別對應(yīng)碳氮單鍵和碳氮雙鍵的伸縮振動，該結(jié)果是由DTC結(jié)構(gòu)的共振變換造成的；950 cm－1處吸收峰可歸屬為碳硫雙鍵伸縮振動峰20。紅外光譜表征結(jié)果表明了化合物(3)中糖環(huán)結(jié)構(gòu)和DTC結(jié)構(gòu)的存在。

3.2 糖基二硫代氨基甲酸鹽自組裝膜表征

將金襯底生物傳感元件浸泡在 glycol-DTC 水溶液中，即可獲得糖基二硫代氨基甲酸鹽自組裝膜(glycol-DTC SAMs)，流程如圖 3 所示。

本文對金襯底上的自組裝膜進行了XPS全譜掃描(圖 4(a))并定量分析了表面元素組成(表 1)。未經(jīng)自組裝修飾的裸金表面僅檢測出少量碳元素，可以歸 屬 為 表 面 存 在 的 少 量 有 機 污 染 。 glycol-DTC SAMs表面Au元素含量明顯降低，表明金襯底上有機膜的形成。XPS檢測到的硫、氮、氧三種元素，分別來自于二硫代氨基化合物中的硫和氮以及糖基團的氧。其中表面的硫元素與氮元素的摩爾比小于2，可能是由于硫原子存在于自組裝膜結(jié)構(gòu)的最下層，其信號強度受到表層原子的遮蔽效應(yīng)而降低。

圖3 糖基二硫代氨基甲酸鹽自組裝膜的制備流程Fig.3 Preparation of glycol-DTC SAMs

圖4 糖基二硫代氨基甲酸鹽自組裝膜 XPS 掃描譜圖(a)、高分辨 C 1s譜圖(b)和高分辨 S 2p 譜圖(c)表征Fig.4 Survey(a),high resolution C 1s(b)and high resolution S 2p(c)spectra of glycol-DTC SAM determined by XPS

自組裝膜的的高分辨 C 1s譜圖(圖 4(b))和 S 2p譜圖(圖 4(c))可以提供碳和硫元素的化學(xué)環(huán)境。自組裝膜的高分辨 C 1s譜圖中在 286.2 eV 附近出現(xiàn)明顯峰，可以歸屬為糖分子中連接羥基和氨基的碳原子。288.2 eV 附近出現(xiàn)較弱的峰，可以歸屬為DTC結(jié)構(gòu)中碳原子。該結(jié)果表明自組裝膜結(jié)構(gòu)中存 在 糖 分 子 和 DTC 結(jié) 構(gòu) 。 高 分 辨 S 2p 譜 圖 中 在162.0 eV 附近出現(xiàn)含硫化合物自組裝膜的經(jīng)典雙峰，兩個峰面積比接近1:2，表明自組裝結(jié)構(gòu)的存在。然而該雙峰的結(jié)合能差比經(jīng)典硫醇自組裝結(jié)構(gòu)小約 0.2 eV，表明該自組裝結(jié)構(gòu)中硫原子比硫醇中的硫原子具有更多負(fù)電荷，有可能是DTC結(jié)構(gòu)中共振結(jié)構(gòu)造成的21。自組裝膜室溫放置 2 周，其高分辨 S 2p 譜圖未發(fā)現(xiàn)顯著變化，表明了 glycol-DTC SAM具有較高的穩(wěn)定性。這可能是由于在二硫代氨基甲酸鹽中，兩個硫原子的間距接近金原子尺寸，并且硫原子和氮原子均提供了孤對電子，其電子云密度更高，與金表面的結(jié)合強度更高15。

綜上，XPS表征結(jié)果表明，通過二硫代氨基甲酸糖在金表面自組裝，我們成功構(gòu)筑了展示糖分子的表面，并且由于DTC結(jié)構(gòu)的特殊性質(zhì)，該自組裝膜具有較好的穩(wěn)定性。

表1 X射線光電子能譜測定的糖基二硫代氨基甲酸鹽自組裝膜的元素摩爾分?jǐn)?shù)(x)Table 1 Elemental molar fraction(x)of glycol-DTC SAM determined by XPS

3.3 糖基化功能芯片生物活性檢測

凝集素是一類能夠識別糖分子的蛋白質(zhì)，不同凝集素可以特異性識別相應(yīng)的糖，因此可以通過凝集素與糖的相互作用評價糖基化芯片的生物活性。本文使用 SPR 技術(shù)監(jiān)測凝集素蛋白在 glycol-DTC SAM 上的吸附/解離行為對其生物活性進行了評價，如圖5所示。未通入蛋白時，SPR信號平穩(wěn)，形成基線；通入 Con A 后，Con A 與表面葡萄糖發(fā)生特異性結(jié)合，SPR信號上升，形成吸附曲線；通入 HEPES 緩沖液，部分 Con A 發(fā)生解離，SPR 信號降低，形成解離曲線；通入 8 mol·L－1尿素溶液洗脫再生，高濃度尿素溶液折光率使曲線呈現(xiàn)急劇上升，形成洗脫曲線；再通入HEPES緩沖液，由于表面吸附的蛋白被尿素洗脫，曲線回歸基線。而在通入BSA和PNA時，SPR信號未發(fā)生明顯變化，表明蛋白吸附量很低，這是由于糖具有多羥基結(jié)構(gòu)，在表面固定后，形成了一層水合層，具有良好的抗蛋白非特異性吸附性能。該結(jié)果表明通過自組裝制備的糖基表面在蛋白質(zhì)水平具有糖的生物活性，并且該表面具備一定的抗非特異性蛋白吸附的功能。

圖5 蛋白在葡萄糖二硫代氨基甲酸鹽自組裝膜上吸附/解離的典型SPR曲線Fig.5 Typical surface plasmon resonance(SPR)image of protein adsorption/dissociation behavior on glucose-DTC self-assembled monolayer(SAM)

圖6 凝集素蛋白在不同糖基表面的吸附情況Fig.6 Adsorption behavior of lectins on different carbohydrates surfaces

本文使用不同的糖制備糖基功能芯片來驗證該 方 法 的 廣 譜 性 ， 并 分 別 通 入 Con A、 WGA、PNA、UEA I檢測凝集素蛋白在糖基功能芯片上的吸附情況，通過吸附曲線終點減去基線計算蛋白吸附量，實驗結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、乳糖、阿拉伯糖分別能與凝 集 素 Con A、 WGA、 PNA、UEA I分 別 發(fā) 生 結(jié)合，與已有報道22相符。WGA 與葡萄糖，ConA 與N-乙酰葡萄糖胺之間的結(jié)合是由于葡萄糖與 N-乙酰葡萄糖胺化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性造成的23,24。阿拉伯糖與 Con A，WGA 的結(jié)合未見文獻(xiàn)報道，對于該結(jié)果，我們推測可能是阿拉伯糖的結(jié)構(gòu)在修飾并在 金 片 表 面 完 成 自 組 裝 后 ， 其 構(gòu) 型 與 Con A 和WGA的結(jié)合位點部分吻合，因此會發(fā)生結(jié)合。

3.4 混合自組裝調(diào)控糖基表面生物活性

混合自組裝是控制表面配基密度的有效方法。當(dāng)金襯底傳感元件浸入多種自組裝分子的混合溶液時，溶液中各組分均可以在金表面自組裝，形成的自組裝膜上某一組分的表面密度隨溶液中該組分摩爾分?jǐn)?shù)升高而升高，從而達(dá)到調(diào)控自組裝膜表面配基密度的目的25。本文合成了同樣具有DTC結(jié)構(gòu)，但不與凝集素發(fā)生特異性結(jié)合的肌氨酸基二硫代氨基甲酸鹽，將兩種DTC化合物以不同摩爾比例制備混合溶液，用于制備含糖基的混合自組裝膜。

為了檢測表面糖基密度對生物活性的影響，本文首先采用ELLA評價了上述一系列混合自組裝膜的生物活性26，結(jié)果如圖 7 所示。圖 7(a)展示了BSA在不同摩爾比例的混合自組裝膜吸附的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，隨著自組裝溶液 glucose-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)升高，BSA蛋白吸附量降低。這是由于糖具有多個羥基，能夠與水分子通過氫鍵形成一層致密的水合層，從而達(dá)到抗蛋白的非特異性吸附的作用27,28；而肌氨酸結(jié)構(gòu)中僅存在一個羧基，水合層相對稀疏，因此抗蛋白非特異性吸附的性能相對較差。為排除非特異性吸附的影響，在使用Con A 檢測其生物活性前，先用 0.1 mg·mL－1BSA進行封閉，Con A 吸附結(jié)果如圖 7(b)所示。隨著自組裝溶液 glucose-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)的增加，Con A 的吸附量增大，也表明表面葡萄糖密度的增加。我們認(rèn)為通過混合自組裝的方法，可以實現(xiàn)對表面糖基密度的控制。

圖7 BSA(a)和 ConA(b)在含葡萄糖混合自組裝膜表面上的吸附情況Fig.7 Adsorption of BSA(a)and ConA(b)on mixed SAMs presenting glucose determined by ELLA

圖8 ConA在含葡萄糖的混合自組裝表面上的解離平衡常數(shù)(Kd)Fig.8 Dissociation constant(Kd)of Con A adsorption on mixed SAMs presenting glucose

3.5 糖基表面密度對蛋白吸附的影響

凝集素蛋白與糖分子之間的相互作用存在多價態(tài)現(xiàn)象，多價態(tài)結(jié)合能夠增強糖與蛋白之間的相互作用29。本文通過調(diào)節(jié)自組裝溶液中葡萄糖二硫 代 氨 基 甲 酸 鹽 的 摩 爾 分 數(shù) (1% ， 2% ， 5% ，100%)制備了一系列含有葡萄糖的混合自組裝膜，并采用SPR技術(shù)檢測不同濃度ConA蛋白在各個自組裝膜上的吸附情況，使用 Langmuir等溫吸附方程(1)進行擬合，計算出 Con A 蛋白在糖基密度不同的自組裝表面上的解離平衡常數(shù)30。

式中，Req和 Ceq分別為在平衡 吸附時的 SPR 響應(yīng)值和凝集素濃度；Rmax為最大響應(yīng)值，Kd為平衡解離常數(shù)。

如圖 8 所示，當(dāng)自組裝溶液 glucose-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)為 100%時，Con A 與葡萄糖之間為多價態(tài)結(jié)合 ， 結(jié) 合 強 度 較 高 ， 其 解 離 平 衡 常 數(shù) 為 (1.17 ± 0.18)μmol·L－1，與已有報道相符31。當(dāng)自組裝溶液glucose-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)降為 2%時，Con A 的解離平衡常數(shù)為(1.38 ± 0.12)μmol·L－1，與 glucose-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)為100%制備的自組裝膜表面相近，即Con A仍處于多價態(tài)結(jié)合狀態(tài)。該結(jié)果表明了自組裝表面的配基密度高，表明了二硫代氨基甲酸鹽化合物自組裝的高效性。當(dāng)自組裝溶液 glucose-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)降至 1%時，Con A 解離平衡常數(shù)為(39.1 ± 1.8) μmol·L－1，是高 密 度 糖基表面的 35 倍 ，表明Con A 與表面葡萄糖的結(jié)合強度發(fā)生了顯著降低 ，推測是由于蛋白與表面糖分子之間出現(xiàn)了單價態(tài)結(jié)合現(xiàn)象。這是由于Con A由四個亞基組成，每個亞基上有一個葡萄糖結(jié)合位點，在糖基表面上由于位阻的關(guān)系通常會有兩個亞基發(fā)生結(jié)合。Con A相鄰亞基上的結(jié)合位點間距離約為 6 nm，當(dāng)表面糖基密度較高時，相鄰糖分子之間的距離小于或等于 6 nm，此時 Con A 蛋白中有兩個亞基與葡萄糖發(fā)生結(jié)合，呈現(xiàn)多價態(tài)結(jié)合，結(jié)合強度較高，如圖8 中 glucose-DTC摩爾分?jǐn)?shù)為 2%－100%形成的糖基表面所示。隨著表面糖基密度降低，當(dāng)相鄰糖分子之間的距離大于 6 nm 時，Con A 蛋白一個亞基發(fā)生結(jié)合之后，相鄰亞基無法發(fā)生結(jié)合，呈現(xiàn)單價態(tài)結(jié)合，結(jié)合強度降低，如圖 8 中 glucose-DTC摩爾分?jǐn)?shù)為1%形成的糖基表面所示32。

多價態(tài)現(xiàn)象對于蛋白吸附的動力學(xué)也有著重要影響，蛋白分子的一個亞基與表面配基的結(jié)合能夠促進相鄰亞基與表面其余配基的結(jié)合，從而提高蛋白吸附速率常數(shù)(ka)，并降低其解離速率常數(shù)(kd)。本文采用 SPR 技術(shù)對 Con A 在上述一系列混合自組裝表面上吸附和解離過程進行監(jiān)測，并通過吸附動力學(xué)公式(2)與解離平衡方程(3)進行計算，結(jié)果如圖9所示。

式中，R(t)和 Ceq分別為在平衡吸附時的 SPR 響應(yīng)值和凝集素濃度；Rmax為最大吸附量，Kd為平衡解離常數(shù)，ka為吸附速率常數(shù)，kd為解離速率常數(shù)。

由圖9可知，隨著表面糖基密度的上升，Con A的吸附速率常數(shù)逐漸降低，這是由于表面結(jié)合位點增大了降低了蛋白結(jié)合的概率。當(dāng)自組裝溶液中 glucose-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)由 1%增 至 2%時，Con A解離速率常數(shù)急劇降低。這是由于蛋白在糖基密度低的自組裝膜表面上呈現(xiàn)單價態(tài)結(jié)合，結(jié)合強度低；自組裝溶液中 glucose-DTC 摩爾分?jǐn)?shù)增加到2%時，蛋白呈現(xiàn)多價態(tài)吸附，結(jié)合強度增大造成其解離速率常數(shù)降低。自組裝溶液中 glucose-DTC摩爾分?jǐn)?shù)由2%上升至100%，解離速率常數(shù)隨吸附速率常數(shù)增大，在該密度范圍內(nèi)解離平衡常數(shù)基本維持恒定。該結(jié)果表明通過調(diào)控表面糖基密度可以實現(xiàn)蛋白多價態(tài)結(jié)合的調(diào)控，從而達(dá)到蛋白結(jié)合動力學(xué)調(diào)控的目的。相較于通過鏈霉親和素-生物素體系調(diào)控蛋白質(zhì)與糖結(jié)合價態(tài)的方法32，本文提供的方法不需要通過復(fù)雜的反應(yīng)合成含有生物素分子的糖衍生物，而且可以通過混合自組裝一步完成糖基密度控制，快捷方便，經(jīng)濟綠色，是一種研究糖-蛋白相互作用的有效方法。

圖9 Con A在含葡萄糖的混合自組裝表面上的吸附速率常數(shù)(ka)與解離速率常數(shù)(kd)Fig.9 Adsorption rate constant(ka)and dissociation rate constant(kd)of Con A adsorption on mixed SAMs presenting glucose

4 結(jié)論

本文發(fā)展了一種制備糖基自組裝分子的合成方法，成功制備了一系列糖的二硫代氨基甲酸鹽衍生物，并對其進行了表征；利用二硫代氨基甲酸鹽化合物在貴金屬表面的自組裝，制備出相應(yīng)展示糖分子的生物傳感功能表面。研究中運用SPR技術(shù)，依據(jù)糖與凝集素的特異性結(jié)合，證實了該糖基化自組裝膜在蛋白質(zhì)水平具備良好的糖生物活性。本文還通過混合自組裝技術(shù)制備出一系列表面糖基密度不同的自組裝表面，并使用ELLA和SPR技術(shù)研究了自組裝密度與糖基表面生物活性的關(guān)系。實驗研究表明，自組裝溶液中糖基二硫代氨基甲酸鹽摩爾分?jǐn)?shù)越高，混合自組裝膜表面的糖基密度越高，對相應(yīng)的凝集素蛋白的吸附越多，且對非特異性蛋白吸附有較好的抗垢性能。通過上述的混合自組裝技術(shù)，我們觀測到蛋白結(jié)合的單價態(tài)和多價態(tài)現(xiàn)象，當(dāng)自組裝溶液中 glycol-DTC摩爾分?jǐn)?shù)低于1%時，蛋白在糖基自組裝表面上呈現(xiàn)單價態(tài)吸附，結(jié)合強度低；自組裝溶液中 glycol-DTC摩爾分?jǐn)?shù)大于2%時，蛋白在糖基自組裝表面上呈現(xiàn)多價態(tài)吸附，結(jié)合強度高。本文所發(fā)展的糖基自組裝功能分子合成方法快速便捷、適用范圍廣，制備的糖基化自組裝膜穩(wěn)定性高且在蛋白水平有較好的糖生物活性。通過混合自組裝技術(shù)控制表面糖基密度，實現(xiàn)了蛋白不同價態(tài)的結(jié)合。上述方法可以用于深入闡明基于糖－蛋白相互作用的病原體感染和細(xì)胞黏附等多種生物過程。

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Preparation and Characterization of Dithiocarbamate Based Carbohydrate Chips

CHENG Fang1,2,*WANG Han-Qi1,2XU Kuang1,2HE Wei3
(1State Key Laboratory of Fine Chemicals,Dalian University of Technology,Dalian 116023,Liaoning Province,P.R.China;2School of Pharmaceutical Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116023,Liaoning Province,P.R.China;3School of Chemical Engineering,Dalian University of Technology,Dalian 116023,Liaoning Province,P.R.China)

Carbohydrates chips are powerful tools for quantitatively studying protein－carbohydrate interactions. Typically,carbohydrate chips are prepared using the self-assembly of carbohydrate thiol/disulfide,which always requires multiple hydroxyl group protection/deprotection steps resulting low conversion in the preparation.In this paper,a kind of carbohydrate derivatives containing dithiocarbamate(DTC)group was synthesized through a two-step reaction to prepare self-assembled monolayers presenting carbohydrate(glycol-DTC SAMs).The glycol-DTC SAMs was characterized using X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)and the protein binding activity was quantitatively analysized using surface plasma resonance(SPR)and enzyme linked lectin assay (ELLA).By mixed self-assembly of carbohydrate dithiocarbamate and sarcosine dithiocarbamate,Glycol-DTC SAMs with different glucose density were prepared.The protein binding kinetics was monitored in real time and the thermodynamics was calculated.Interestingly,a 1 ∶1 binding of concanavalin A(Con A)was obtained on the SAMs prepared in solution containing 1%glucose-DTC,as the dissociation constant(Kd)was calculatedto be(39.10 ± 0.12) μmol·L－1.A 1 ∶2 binding of Con A was obtained on the SAMs prepared in solutions containing ＞ 2%glucose-DTC,as the Kdwas calculated to be(1.17 ± 0.18) μmol·L－1.By simply mixed selfassembly,multivalent binding of Con Acan be realized and separate kinetic parameters can be obtained.Our work would promote the study of protein－carbohydrate interactions and be helpful for revealing the relevant biological progress.

Carbohydrate－protein interaction;Dithiocarbamate;Multivalent adsorption; Thermodynamics;Kinetics;SAM

O642

10.3866/PKU.WHXB201609291

Received:August 12,2016;Revised:September 28,2016;Published online:September 29,2016.

*Corresponding author.Email:ffcheng@dlut.edu.cn;Tel:+86-411-84986336.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21104008,21231003),Fundamental Research Funds for the Central Universities,China(DUT16RC(3)019)and Recruitment Program of Global Youth Experts,China.

國家自然科學(xué)基金(21104008,21231003),中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(DUT16RC(3)019)和青年千人計劃資助項目? Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica