柿炭疽病研究進(jìn)展

王 潔，余賢美，艾呈祥

柿樹(shù)(Diospyros kaki Thunb.)原產(chǎn)于我國(guó)，是雙子葉植物綱(Magnoliopsida)柿目(Ebenales)柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物。柿果、柿蒂和柿霜等包含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有重要的藥療保健效用［1，2］。柿樹(shù)炭疽病是柿樹(shù)生產(chǎn)上的毀滅性災(zāi)害，主要危害柿果實(shí)和嫩枝，造成果實(shí)腐爛，枝條枯死導(dǎo)致樹(shù)體整株死亡，還能危害貯藏期柿果實(shí)，該病害分布于國(guó)內(nèi)主要柿樹(shù)栽培區(qū)，已嚴(yán)重制約了我國(guó)柿樹(shù)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［3～6］。炭疽菌是一類重要的植物病原真菌，具有豐富的形態(tài)學(xué)及遺傳多樣性。因此，明確柿樹(shù)炭疽病病原菌種類、炭疽菌的侵染過(guò)程，對(duì)保證果樹(shù)穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)具有重要意義。

1 柿炭疽病病原菌

1.1 柿炭疽菌的種類與命名

柿炭疽病病原最初被鑒定為柿盤長(zhǎng)孢菌(Gloeosporium kaki Hori)［7～9］。1921 年，Maffei［10］將在意大利帕維亞植物園柿葉部分離鑒定的病原菌鑒定為Colletotrichum.kaki，與G.Kaki Hori相比生物學(xué)特性略有差異。隨后，Von Arx［11］在系統(tǒng)研究炭疽菌的分類時(shí)，認(rèn)為柿盤長(zhǎng)孢菌(G.kaki Hori)和C.kaki是一樣的，他們與膠胞炭疽菌C.gloeosporioides均為同物異名，將柿樹(shù)炭疽病菌正式統(tǒng)一為柿盤長(zhǎng)孢菌(G.kaki Hori)，并在一段時(shí)間內(nèi)得到普遍應(yīng)用［3］。但是，同時(shí)期膠胞炭疽菌也作為柿炭疽病病原菌被頻繁應(yīng)用［5］。

炭疽菌具有豐富的形態(tài)學(xué)及遺傳多樣性，單純的形態(tài)學(xué)無(wú)法準(zhǔn)確的對(duì)其進(jìn)行分類鑒定［12，13］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多基因進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)合形態(tài)學(xué)方法已逐漸成為炭疽菌分類鑒定的可靠工具，得到了世界范圍內(nèi)的認(rèn)可［14～16］。Weir等［15］研究了來(lái)自中國(guó)、日本和新西蘭的標(biāo)本，形態(tài)學(xué)結(jié)合真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，將柿樹(shù)炭疽病菌的表位型重新界定為柿盤長(zhǎng)孢菌G.Kaki Hori，而分類學(xué)上將其歸類為一類新的炭疽菌，命名為柿樹(shù)炭疽菌C.horii，成為C.Gloeosporioides sensu lato復(fù)合種的成員之一。我國(guó)浙江無(wú)核柿樹(shù)炭疽菌也被重新鑒定為柿炭疽菌(C.horii)［17］。自此，柿樹(shù)炭疽病病原菌被正式命名為柿炭疽菌(C.horii)。

1.2 柿炭疽菌生理分化

國(guó)內(nèi)外研究表明，不同的炭疽菌可以侵染同種植物［16，18］。例如，我國(guó)蘋果炭疽病病原菌可分為7個(gè)分類單元，包括已知種6個(gè)，新種1個(gè)［18］。雖然柿炭疽病的病原菌種類未見(jiàn)系統(tǒng)研究的報(bào)道，但是從世界各地的報(bào)道中不難發(fā)現(xiàn)柿炭疽病病原菌同樣存在多樣性。Kim等［19］室內(nèi)試驗(yàn)證明，辣椒上分離的C.acutatum能侵染柿樹(shù)。Williamson等［20］發(fā)現(xiàn)，美國(guó)柿果實(shí)炭疽病菌是由C.acutatum引起的。此后，在韓國(guó)也發(fā)現(xiàn)C.acutatum侵染果實(shí)能引起柿果的黑斑病［21］。通過(guò)對(duì)我國(guó)5個(gè)省的柿主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行調(diào)查筆者發(fā)現(xiàn)，C.horii為我國(guó)柿炭疽病的主要病原菌，同時(shí)新發(fā)現(xiàn)喀斯特炭疽菌(C.karstii)也能引起柿葉片和枝條的炭疽病，喀斯特炭疽菌C.karstii比C.horii更易侵染葉片，且引起的癥狀也更明顯［22］。Palou等［23］發(fā)現(xiàn)，C.gloeosporioides能引起貯藏期柿果實(shí)病害。由此可見(jiàn)，柿炭疽病病原菌存在多樣性，進(jìn)行大范圍的調(diào)查及鑒定，明確不同地區(qū)柿炭疽病病原菌種類及其侵染規(guī)律，對(duì)于柿炭疽病的防治具有重要意義。

2 炭疽菌致病機(jī)理研究

2.1 侵染策略

炭疽菌屬真菌在不同寄主植物和同種寄主不同組織器官上主要存在2種不同的侵染策略:細(xì)胞內(nèi)半活體營(yíng)養(yǎng)型(intracellular hemibiotrophy)和角質(zhì)層下內(nèi)部死體營(yíng)養(yǎng)型(subcuticular intramural necrotrophy)［24］。

研究表明，C.horii屬于細(xì)胞內(nèi)半活體營(yíng)養(yǎng)型。半活體營(yíng)養(yǎng)型炭疽菌侵染過(guò)程中，孢子在寄主表面迅速萌發(fā)，形成短芽管，然后分化形成成熟的黑褐色附著胞。這些附著胞產(chǎn)生較高的膨壓和再分化形成侵染釘，通過(guò)向植物細(xì)胞釋放水解酶穿透寄主表面的角質(zhì)層［24，25］。在柿炭疽菌(C.horii)附著胞形成過(guò)程中，核相發(fā)生2次有絲分裂變化。第一次有絲分裂發(fā)生在分生孢子固著聚苯乙烯塑料培養(yǎng)皿3～4 h后，隨后，分生孢子中部形成一個(gè)隔膜，把它分成2個(gè)細(xì)胞;6～7 h后，分生孢子發(fā)生第二次有絲分裂。分裂后，一個(gè)核通過(guò)芽管移入附著胞中。通過(guò)對(duì)不同柿品種及同一個(gè)柿品種的不同部位進(jìn)行接種，觀察致病性、附著胞形成和侵染特性，發(fā)現(xiàn)柿樹(shù)炭疽菌在不同柿樹(shù)表面均能形成附著胞，附著胞多產(chǎn)生在寄主表皮背斜細(xì)胞壁間結(jié)合處(JACWs)或近結(jié)合處。而侵染菌絲的形成和擴(kuò)展方式可能是其寄主?；?或致病性)差異的重要機(jī)制之一［5］。

凹陷的寄主原生質(zhì)膜圍繞侵染泡囊和初生菌絲，界面之間形成界面基質(zhì)，這些基質(zhì)把真菌細(xì)胞壁和凹陷的寄主原生質(zhì)膜分開(kāi)。超微結(jié)構(gòu)研究表明，機(jī)械力和酶降解作用，是柿炭疽菌(C.horii)初生菌絲和次生菌絲產(chǎn)生穿透性以破壞葉柄寄主細(xì)胞的主要作用力，在其侵染柿葉柄過(guò)程中有2個(gè)階段，即初生菌絲的活體營(yíng)養(yǎng)階段和次生菌絲的死體營(yíng)養(yǎng)階段。初生菌絲與具有沉積物的寄主原生質(zhì)膜之間有一層界面基質(zhì)(interfacial matrix)，初生菌絲擴(kuò)張并侵染相鄰細(xì)胞時(shí)，圍繞著初生菌絲層的界面基質(zhì)消失，具有沉積物的原生質(zhì)膜被逐步降解，細(xì)胞開(kāi)始死亡，產(chǎn)生次生菌絲，在死的細(xì)胞中繁殖和擴(kuò)展，并產(chǎn)生分枝直接穿透較薄的寄主細(xì)胞壁，無(wú)縊縮或任何變形現(xiàn)象，菌絲頂端部分未見(jiàn)隔膜產(chǎn)生;在穿透較厚的細(xì)胞壁時(shí)，靠近頂端處產(chǎn)生隔膜，頂端細(xì)胞膨大，使寄主細(xì)胞壁撕裂［25，26］。研究還發(fā)現(xiàn)，炭疽菌與柿樹(shù)互作的界面上，寄主原生質(zhì)膜具有明顯的波浪形皺縮［27］，這明顯不同于模式菌株菜豆炭疽菌與寄主互作界面上光滑的寄主原生質(zhì)膜，表明柿炭疽菌(C.horii)與植物的互作可能是一種新的體系。

與細(xì)胞內(nèi)半活體營(yíng)養(yǎng)型不同，角質(zhì)層下內(nèi)部死體營(yíng)養(yǎng)型炭疽菌整個(gè)侵染過(guò)程檢測(cè)不到活體營(yíng)養(yǎng)階段。豇豆與C.capsici的互作就是屬于這個(gè)類型。分生孢子萌發(fā)形成附著胞后，病原菌穿透角質(zhì)層，并在其下生長(zhǎng)形成菌絲網(wǎng)，侵染早期階段進(jìn)入細(xì)胞腔，在菌絲迅速擴(kuò)展前，提前殺死宿主細(xì)胞。菌絲侵入寄主植物表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞，引起更多細(xì)胞的死亡［28］。

2.2 致病相關(guān)基因克隆

病原菌與寄主互作是個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，其間必定涉及了大量的基因參予不同階段的表達(dá)調(diào)控。在炭疽菌屬真菌中已經(jīng)鑒定并克隆了多個(gè)與致病相關(guān)基因，例如影響致病性的果膠酸鹽裂解酶(PL)基因，介導(dǎo)附著胞形成的轉(zhuǎn)錄因子CLSTE12，在病菌侵染的初級(jí)階段起作用的cgdn3基因，影響致病性的2個(gè)功能不同果膠裂解酶基因pnl-1和pnl-2，以及二?；视王；D(zhuǎn)移酶(Diacylglycerol acyl transferase)和角質(zhì)酶CglCUT1等基因［29～34］。菜豆炭疽菌轉(zhuǎn)錄激活因子clta1基因可能調(diào)控菜豆炭疽菌從活體營(yíng)養(yǎng)向死體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的作用。李明江［35］利用同源擴(kuò)增及TAIL-PCR在柿炭疽菌中擴(kuò)增出了與cgta1同源的基因，證明了柿炭疽菌從活體體營(yíng)養(yǎng)向死體營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)換機(jī)制。孫虎［36］構(gòu)建了柿炭疽菌基因組文庫(kù)，并篩選了致病性突變體，克隆了3個(gè)無(wú)致病性突變體的側(cè)翼序列，證明它們分別與24-C甲基轉(zhuǎn)移酶、核糖體蛋白和真核翻譯起始因子3個(gè)致病性相關(guān)基因具有較高同源性。王偉［37］推測(cè)哈銳炭疽菌的fstf(Fungal specific transcriptional factor)基因可能和活體營(yíng)養(yǎng)相關(guān)，構(gòu)建并轉(zhuǎn)化了該基因的敲除載體，為研究其功能奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)柿炭疽菌(C.horii)比同屬的C.higginsianum和C.graminicola含有更多的系譜?；曰颍?8］。綜上所述，柿炭疽菌(C.horii)可能存在較為?；闹虏』颉?/p>

3 柿炭疽病的防治

通過(guò)十字交叉法和血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定柿樹(shù)炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)，結(jié)果表明，最適溫度為20～30℃，最適產(chǎn)孢溫度為25～30℃，最適生長(zhǎng)的pH值為5～6［39，40］。目前，柿炭疽病的防治還是以化學(xué)防治為主。利用菌絲生長(zhǎng)速率法和包子萌發(fā)法分別測(cè)定16種常用殺菌劑的作用，結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為33.5 g/L的喹啉銅懸浮劑，25 g/L的溴菌腈乳油和70 g/L的代森錳鋅可濕性粉劑對(duì)柿炭疽菌的抑菌效果最好，可作為優(yōu)選藥劑［40］。田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為25g/L的咪鮮胺乳油600倍液的防治效果可達(dá)到89.60%［41］。針對(duì)不同菌株及不同地區(qū)的化學(xué)防治藥劑還需進(jìn)一步研究。

4 展 望

中國(guó)柿品種資源豐富，種內(nèi)變異復(fù)雜，柿樹(shù)炭疽病作為一種毀滅性病害，對(duì)柿樹(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅。目前柿炭疽病研究還停留在傳統(tǒng)的病原鑒定上［5，41，42］，未見(jiàn)系統(tǒng)性研究柿炭疽病的報(bào)道。我國(guó)柿炭疽病的病原種類還未明確，抗病品種篩選研究相對(duì)較少［43］;同時(shí)，關(guān)于柿炭疽菌(C.horii)的致病機(jī)理研究相對(duì)滯后。為了更加合理的預(yù)防控制該病害，急需明確我國(guó)不同柿產(chǎn)區(qū)柿炭疽菌種類及其發(fā)病規(guī)律，制定有針對(duì)性的防治策略;同時(shí)加大篩選抗病品種的力度，為抗病育種奠定基礎(chǔ);進(jìn)一步開(kāi)展柿炭疽病致病機(jī)理，為更深入的了解柿炭疽菌與植物互作提供理論基礎(chǔ)。

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