綿羊IL-6啟動子的克隆及pIL6-TLR4載體構(gòu)建

宗炎，闞童童，潘求真，王靜宜，連正興

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院）

綿羊IL-6啟動子的克隆及pIL6-TLR4載體構(gòu)建

宗炎1，闞童童2，潘求真1，王靜宜1，連正興2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院）

為生產(chǎn)抗病轉(zhuǎn)基因綿羊，并確保轉(zhuǎn)基因羊的安全性?？寺【d羊IL-6啟動子序列，以IL-6為啟動子構(gòu)建TLR4過表達載體，轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞驗證功能。用1 μg·L-1的LPS刺激轉(zhuǎn)染后的綿羊成纖維細胞，利用qPCR技術(shù)和ELISA方法檢測受LPS刺激后的成纖維細胞TLR4 mRNA表達量和TLR4蛋白表達量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的TLR4 mRNA表達量在2、4、24、48 h顯著高于對照組（P＜0.05），其中2、4、24 h極顯著高于對照組（P＜0.01），TLR4蛋白表達量始終高于對照組。說明pIL6-TLR4過表達載體構(gòu)建成功。

TLR4；IL-6啟動子；轉(zhuǎn)基因；綿羊

革蘭氏陰性菌是經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色的一類細菌，其病原能力通常與其細胞壁的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）有關(guān)[1]。在動物體中，LPS可以刺激并激發(fā)強烈的免疫炎癥反應(yīng)[2]，另外由于脂多糖在革蘭氏陰性菌死亡后被釋放出[3]，許多種類的抗生素都不能非常有效地抑制此類細菌的繁殖和釋放LPS。很多革蘭氏陰性菌如：沙門氏菌和布魯氏菌等，在羊群中大面積地引發(fā)消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及血液等傳染病，某些人畜共患的疾病甚至大面積的感染人群，如布魯氏菌病的爆發(fā)，對養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的危害。

LPS可以與TLR4的信號受體結(jié)合，通過激活TLR4信號通路，介導(dǎo)生物體先天性免疫應(yīng)答與獲得性免疫應(yīng)答[4]，引發(fā)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激從而達到清除病原菌的目的[5]。白細胞介素-6（IL-6）既是一種促進炎癥反應(yīng)的因子可以在炎癥反應(yīng)早期就及時上調(diào)表達[6]，同時又是一種抗炎因子可以在炎癥反應(yīng)達到一定程度時適當(dāng)抑制[7]。基于TLR4在機體免疫中的功能與IL-6啟動子在炎癥反應(yīng)中的正反向調(diào)控作用以及動物轉(zhuǎn)基因在動物疾病模型建立中的用途，可以將三者有效地結(jié)合在一起進行進一步的功能探討，同時也會彌補國內(nèi)外在相關(guān)研究中的空白。

1 材料與方法

1.1 綿羊IL-6啟動子區(qū)域的克隆與測序

根據(jù)IL-6啟動子重要啟動元件所在位置，使用primer 5.0對綿羊IL-6基因啟動子區(qū)域設(shè)計PCR擴增特異性引物（TLR4 F：5'-TAC CCC CTC TAA AAC TCT G-3'，TLR4 R：5'-GGA TTT CCT TCA CTT ACT TG-3'），將PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果與GenBank提供的綿羊IL-6基因啟動子序列相似性為100%，可以通過膠回收后進行后續(xù)試驗將PCR回收片段與pMD19-T載體進行連接（pMD19-T Vector 1 μL，Insert DNA 1 μL，ddH2O 3 μL，Solution I 5 μL，Total 10 μL，16℃連接過夜），將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過藍白斑篩選進行初步鑒定后，挑取白斑劃線并進行菌落PCR鑒定，挑選部分菌落PCR鑒定陽性的菌線搖菌并提取質(zhì)粒。使用XbaI和PstI雙酶切進行鑒定，隨機挑選5個酶切正確的質(zhì)粒進行測序。

1.2 pIL6-TLR4載體的構(gòu)建

根據(jù)目的載體酶切位點的選擇以及IL-6啟動子重要啟動元件的位置，用Primer 5.0設(shè)計一對含有酶切位點及保護堿基的引物擴增IL-6啟動子適宜（IL-6酶切F：CGA TTA ATA CCC CCT CTA AAA CTC TGT GCA，IL-6酶切R：CTA GCT AGC GGT CTC AGA CAT CCC CGG TCT），其中CG和CTA為保護堿基，上游加入AseI酶切位點ATTAAT，下游加入NheI酶切位點GCTAGC。

對已有的3S載體和PCR擴增片段分別用AseI和NheI進行雙酶切，雙酶切后，需切膠回收載體長度：7 340 bp，PCR片段長度350 bp（其中IL-6啟動子長度為345 bp），然后將二者進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機挑取較大菌斑劃線并進行菌落PCR鑒定，挑選部分菌落PCR鑒定陽性的菌線搖菌并提取質(zhì)粒。隨機挑選5個酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序，并進行新3S-pIL6-TLR4載體圖譜的繪制。

1.3 綿羊IL-6啟動子驅(qū)動效率評價

接種綿羊成纖維細胞到6孔板中，待細胞生長良好達到70%時進行轉(zhuǎn)染[8]。轉(zhuǎn)染24 h狀態(tài)穩(wěn)定并開始表達外源基因時，每孔加入1 μg·L-1LPS進行刺激，并在0、0.5、2、4、8、12、24、48 h時對細胞進行收集，用于做mRNA表達檢測和蛋白表達檢測。

2 實驗結(jié)果

2.1 IL-6啟動子區(qū)域的克隆與測序

結(jié)果顯示，引物設(shè)計非常理想，可以在較大的溫度范圍內(nèi)特異地擴增出單一目的條帶，且PCR產(chǎn)物測序結(jié)果無雜峰，與挑選的5個成功連接T載體的單克隆質(zhì)粒測序結(jié)果都相同，均與Genbank所提供的序列相一致，表明IL-6啟動子克隆成功。

圖1 綿羊全基因組IL-6啟動子區(qū)域的克隆Fig.1The clone of IL-6 gene promoter region from the whole sheep genome

2.2 pIL6-TLR4載體的構(gòu)建

選取菌落PCR為陽性的菌落搖菌提取質(zhì)粒后進行雙酶切鑒定，全部成功連接。結(jié)果表明引物引入的保護堿基與酶切位點十分理想。隨機選取的5個成功連接的3S載體的單克隆質(zhì)粒進行測序，結(jié)果與Genbank所提供的序列完全一致，這表明重組3S-pIL6-TLR4載體構(gòu)建成功。

圖23 S-pIL6-TLR4載體的構(gòu)建Fig.2The construction of 3S-pIL6-TLR4 vector

2.3 IL-6啟動子驅(qū)動效率評價

從qPCR結(jié)果可以看出，IL-6啟動子組在4 h時TLR4 mRNA表達量達到高峰，表現(xiàn)出了IL-6啟動子調(diào)節(jié)的特異性。且在2、4、24、48 h時，轉(zhuǎn)基因組的TLR4 mRNA顯著高于對照組。ELISA結(jié)果表明，TLR4蛋白的表達與mRNA的表達基本趨于一致，且出現(xiàn)了表達累積的現(xiàn)象。通過對質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染后TLR4表達的檢測，證明3S-pIL6-TLR4載體的IL-6啟動子可以有效外驅(qū)動外源TLR4基因的表達。

3 討論

實現(xiàn)基因的選擇性、特異性表達不在于是哪種基因，而在于這種基因是被哪種啟動子所啟動。因此，要想使某個目的基因能夠特異性的表達就需要運用相應(yīng)特異性的啟動子來啟動該基因的轉(zhuǎn)錄[9]。IL-6既充分發(fā)揮了促炎因子的作用同時還具有一定的抗炎因子的作用[10-11]，IL-6基因的表達受相應(yīng)的調(diào)控基因的控制，其啟動子在這個過程中起到了十分重要的作用[12-13]。并且IL-6在組織中的表達比較廣泛，又具有一定程度的組織特異性，在淋巴細胞、單核細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞以及肌細胞中表達[14]。因此我們選擇了IL-6基因啟動子來提高轉(zhuǎn)基因綿羊抗病能力。

由轉(zhuǎn)染細胞TLR4 mRNA的相對定量及TLR4蛋白ELISA結(jié)果分析得出pIL6-TLR4轉(zhuǎn)基因綿羊在4 h時TLR4 mRNA與蛋白的表達量均迅速上升，并達到峰值，極顯著地高于對照組綿羊（P＜0.01）。而對照組綿羊在4 h時還在緩慢上升，8 h時才迅速上升并達到峰值。在24 h后，pIL6-TLR4轉(zhuǎn)基因綿羊TLR4的表達量再次高于對照組綿羊。轉(zhuǎn)然后的TLR4 mRNA表達量在2、4、24、48 h顯著高于對照組，其中2、4、24 h極顯著高于對照組，TLR4蛋白表達量始終高于對照組?？梢钥闯觯琓LR4蛋白與mRNA的表達趨勢基本一致，只是在表達時間點密集檢測時相比mRNA的表達出現(xiàn)了逐漸累積的現(xiàn)象。

參考文獻：

［1］Ozinsky A，Underhill D M.The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between Toll-like receptors［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（25）：13766-13771.

［2］Vasselon T，Detmers P A.Toll receptors：A central element in innate immune responses［J］.Immunity，2002，70（3）：1033-1041.

［3］Zgurskaya HI1，Lo¨pez CA2，Gnanakaran S2.permeability barrier of gram-negative cell envelopes and approaches to bypass it，2015，1（11）：512-522.

［4］Kieran A R，Michael F S，Jr M K，et al.Reactive oxygen and nitrogen species differentially regulate Toll-like receptor 4-mediated activation of NF-kappa B and interleukin-8 expression［J］.Infect Immunol，2004，72（4）：2123-2130.

［5］Ishida I，Kubo H，Suzuki S，et al.Hypoxia diminishes tolllike receptor 4 expression through reactive oxygen species generated by mitochondria in endothelial cells［J］.J Immunol，2002，169（4）：2069-2075.

［6］Roded Sharan.Analysis of biological networks：transcriptional networks-promoter sequence analysis［J］.Tel Aviv University，2007（4）：11.

［7］孫乃恩，孫東旭，朱德胞.分子遺傳學(xué)［M］.南京：南京大學(xué)出版社，1999.

Cloning of Sheep IL-6 promoter and the Construction of the pIL6-TLR4 Vector

Zong Yan1，Kan Tongtong2，Pan Qiuzhen1，Wang Jingyi1，Lian Zhengxing2
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；
2.College of Animal Science and Technology，China Agricultural University）

To produce disease resistance transgenic sheep and to ensure its security，the sheep IL-6 promoter sequences were cloned. The TLR4 over-expression vector was constructed by using sheep IL-6 as a promoter，and transfected into sheep fibroblasts successfully.The transfected sheep fibroblasts was stimulated with 1 μg·L-1of LPS，and the technology of qPCR was used to detect the mRNA and protein expression.The results showed that，the mRNA expressions of TLR4 in transfected sheep fibroblasts after 2，4，24，48 h were significantly higher than that in the control group（P＜0.05），in which after 2，4，24 h were extremely significantly higher（P＜0.01），meanwhile the TLR4 protein expression was always higher than that in the control group.It was proved that the pIL6-TLR4 over-expression vector was constructed successfully.

TLR4；IL-6 promoter；transgene；sheep

Q78

A

1002-2090（2017）01-0045-04

2016-03-10

國家重大轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ棧?014ZX08008-005）。

宗炎（1990-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2013級碩士研究生。

潘求真，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：panqiuzhen@163.com。