Foxl2基因?qū)π∈筌浌羌肮前l(fā)育的調(diào)控研究

薛建利

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨三科，陜西 西安 710004)

Foxl2基因?qū)π∈筌浌羌肮前l(fā)育的調(diào)控研究

薛建利

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨三科，陜西 西安 710004)

目的 Foxl2轉(zhuǎn)錄因子單倍劑量不足會(huì)導(dǎo)致小瞼裂綜合征(blepharophimosis ptosis epicanthus inversus syndrome，BPES)，表現(xiàn)為眼瞼異常和卵巢功能早衰。小鼠Foxl2基因缺乏亦導(dǎo)致眼瞼、額頭缺陷和雌性性腺發(fā)育不全。本試驗(yàn)旨在研究Foxl2缺乏對(duì)小鼠出生后的生長(zhǎng)和胚胎期骨、軟骨形成的影響。方法 對(duì)比雄性Foxl2-/-與野生型小鼠在不同發(fā)育階段的特征，測(cè)量繪制生長(zhǎng)曲線。骨骼用阿爾新蘭/茜素紅、硝酸銀染色，行免疫熒光分析和共聚焦顯微鏡下分析。RT-qPCR分析生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)/胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like grouth factor-1，IGF1)通路以評(píng)估下丘腦-垂體-骨軸上標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)果 較之野生型小鼠，F(xiàn)oxl2敲除小鼠表現(xiàn)出較小體型、骨骼異常、軟骨和骨礦化缺陷、GH/IGF1軸下調(diào)。結(jié)論 Foxl2是生長(zhǎng)發(fā)育、軟骨和骨形成的過(guò)程的主要轉(zhuǎn)錄因子。

Foxl2；骨發(fā)育；軟骨發(fā)育；小鼠

Foxl2基因位于細(xì)胞核內(nèi)，是一個(gè)2.7 kb的單外顯子基因，位于3q23區(qū)域，其編碼蛋白質(zhì)屬于forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族，由376個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)由100個(gè)氨基酸構(gòu)成的forkhead DNA結(jié)合區(qū)和一個(gè)多聚丙氨酸區(qū)[1]。Foxl2 (MIM # 605597)變異最初發(fā)現(xiàn)于一種常染色體顯性遺傳病[2]，小瞼裂綜合癥(blepharophimosis ptosis epicanthus inversus syndrome，BPES，MIM # 110100)，表現(xiàn)為眼瞼、前額異常和卵巢功能障礙所致原發(fā)性卵巢功能不全。Foxl2基因也被證實(shí)的在卵巢功能維持方面發(fā)揮重要作用[3]，是卵巢發(fā)育中的一種早期調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)oxl2基因突變導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)在聚丙氨酸區(qū)域前有截?cái)鄤t發(fā)生BPES I型的風(fēng)險(xiǎn)高，可致女性患者不育，原發(fā)性閉經(jīng)或提前絕經(jīng)；若基因突變引起聚丙氨酸區(qū)域擴(kuò)增可導(dǎo)致BPES Ⅱ型，男女皆可生育。有些病例還存在其他的異常，如智力低下、發(fā)育遲緩、心臟缺損、小頭及突出耳等。Foxl2-/-小鼠呈現(xiàn)的顱面部和性腺特征類似于人BPES，包括兩性眼瞼異常、卵泡發(fā)育不全所致雌性不育、睪丸決定基因上調(diào)(Sox9、Fgf9、Wt1、Gata4、Dhh、Sf1、Dmrt1和Fgfr2)和局部性反轉(zhuǎn)[4-6]。野生型小鼠交配后14.5 dpc，F(xiàn)oxl2即開(kāi)始在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)。但敲除小鼠folxl2基因后可出現(xiàn)更多表型，如兩性體型減小，血漿胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like grouth factor-1，IGF1)水平可降低60%。研究證實(shí)，F(xiàn)oxl2在垂體促性腺細(xì)胞(11.5 dpc)[7]、成人垂體促甲狀腺和促性腺細(xì)胞也有表達(dá)[8]，但foxl2基因缺失對(duì)體型及發(fā)育的影響機(jī)制尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

已有文獻(xiàn)報(bào)道Foxl2在眼瞼和卵巢發(fā)育中的作用，本試驗(yàn)擬探索Foxl2對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和頭面部、骨骼發(fā)育的影響，通過(guò)構(gòu)建Foxl2-/-小鼠，對(duì)比雄性Foxl2-/-與野生型小鼠在不同發(fā)育階段的特征，研究foxl2基因缺失影響激素水平和生長(zhǎng)發(fā)育的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立 利用Cre/Loxp技術(shù)敲除小鼠促性腺組織中的FOXL2，建立Foxl2-/-小鼠[9]，實(shí)驗(yàn)小鼠常規(guī)安置于溫度20～24℃、濕度50%～60%、12 h光暗循環(huán)的環(huán)境中，水、食物可自由獲取。小鼠通過(guò)二氧化碳窒息法處死。利用PCR基因分型方法檢測(cè)、驗(yàn)證野生型和突變小鼠的FOXL2基因(公用引物b：GGATCTCTGAGTGCCAACGC，野生型序列識(shí)別引物a：CACGGGAAAGCAGAGGCCGC或c：CACACTGCTCGACATTGGGTG)。

1.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)繪 利用卡尺和分析天平分別測(cè)量同窩出生的三種雄性小鼠(WT、Foxl2+/-和Foxl2-/-)的身長(zhǎng)、體重，分別于小鼠出生后0～100 d內(nèi)測(cè)量，每周3次，每次時(shí)間點(diǎn)相同。用GraphPad 6軟件進(jìn)行生長(zhǎng)曲線繪制、回歸分析和特異性生長(zhǎng)速率計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)組內(nèi)測(cè)量值的顯著性意義。

1.3 骨骼染色和影像學(xué)分析 新生、成年小鼠的骨骼用進(jìn)行茜素紅/阿爾新蘭染色[10]，小鼠窒息致死后，使用Faxitron X-Ray機(jī)器進(jìn)行X線攝像，觀察分析骨骼情況[11]。

1.4 組織學(xué)分析[4]取不同發(fā)育階段的胚胎(12.5 dpc，13.5 dpc，14.5 dpc，15.5 dpc，16.5 dpc)，在室溫下用Histochoice(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)固定液固定4～6 h，進(jìn)行石蠟包埋、5μm連續(xù)切片。利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增Y染色體性別決定區(qū)域(Sry)，僅選取雄性胚胎(SryF 5′-GTGGTGAGAGGCACAAGT-3′；SryR 5′-CTGTGTAGGATCTTCAATC-3′)。將切片先后行阿爾新蘭/茜素紅染色、硝酸銀染色，置于3%雙氧水中處理1 h，用1×檸檬酸鹽緩沖液和0.01 M EDTA(pH 8)洗滌，封閉液(Protein Block Serum-free，×0909，Dako，Glostrup，Denmar)室溫下封閉30 min，一抗4℃孵化過(guò)夜，再行免疫熒光檢測(cè)。相關(guān)抗體：1︰50兔抗-Foxl2(Eurogentec s.a.)，1︰500山羊抗兔IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)。Leica DMIRE激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.5 RT-qPCR分析 按RT-qPCR步驟，利用Trizol法抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將Gapdh設(shè)為內(nèi)部參照，分析Foxl2表達(dá)情況。反轉(zhuǎn)錄前利用熒光綠實(shí)時(shí)定量PCR分析三個(gè)生物學(xué)樣本(野生型，P0和P7 Foxl2-/-)的RNAs，檢測(cè)Ghrh，Ghrh-r，Gh，Igf1基因，內(nèi)部參照基因?yàn)棣?actin。每次檢驗(yàn)用10 ng cDNA和Universal TaqMan master mix 2X在測(cè)序點(diǎn)重復(fù)三遍，所有信號(hào)均可通過(guò)ABI PRISMR 7700系統(tǒng)檢測(cè)。

1.6 倫理聲明 本試驗(yàn)的動(dòng)物及操作符合西安交通大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)要求，并符合全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)發(fā)布的《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通用要求》。針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用方案和詳細(xì)的申請(qǐng)表格已獲西安交通大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 既往文獻(xiàn)報(bào)道Foxl2-/-小鼠多于出生后不久就死亡[4]，幸存小鼠體型發(fā)育相對(duì)較小，血漿IGF1水平有所降低。我們的試驗(yàn)擴(kuò)大了樣本量，從而定量分析雌性小鼠生育能力和后代的存活、生長(zhǎng)特征。Foxl2+/-雌性小鼠生育能力顯著降低，F(xiàn)oxl2-/-小鼠的一胎生仔數(shù)僅為野生型小鼠的40%。野生型和Foxl2-/-新生小鼠遵循孟德?tīng)栠z傳定律(χ2=3.51，185例新生小鼠)，但出生后可出現(xiàn)不明原因的驚厥樣發(fā)作，死亡率高達(dá)82%。為避免雌性小鼠激素水平影響表型造成偏倚，本試驗(yàn)全納入雄性Foxl2-/-小鼠。

2.2 發(fā)育期生長(zhǎng)加速遲緩導(dǎo)致Foxl2-/-成年小鼠體格減小 比較Foxl2-/-小鼠生長(zhǎng)期間體型，同窩WT和Foxl2-/-小鼠出生時(shí)體重和身長(zhǎng)相當(dāng)。出生后100 d(P100)內(nèi)，WT小鼠生長(zhǎng)呈三相曲線(見(jiàn)圖1)，新生兒期生長(zhǎng)加速，而后生長(zhǎng)速率陡降，斷奶后又迎來(lái)生長(zhǎng)突增。不同之處在于，WT小鼠在中間段的生長(zhǎng)速率僅單純下降，F(xiàn)oxl2-/-小鼠此期卻出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯。并且，隨后的生長(zhǎng)突增，WT小鼠開(kāi)始于P12，F(xiàn)oxl2-/-小鼠延遲至P20。P20時(shí)，WT和Foxl2-/-小鼠的體重、身長(zhǎng)已有顯著差異(P<0.05)，P100時(shí)Foxl2-/-小鼠的體重、身長(zhǎng)分別比WT小鼠低29.4%、10.6%。根據(jù)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的小鼠體重繪制特異性生長(zhǎng)速率圖，可見(jiàn)在P40內(nèi)，WT小鼠的生長(zhǎng)速率都高于Foxl2-/-小鼠，隨后變得不相上下，此后趨于穩(wěn)定。

2.3 Foxl2-/-小鼠生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)/IGF1軸受損 Foxl2-/-小鼠的血清IGF1水平較低，本實(shí)驗(yàn)又研究了變異小鼠GH/IGF1軸改變與異常生長(zhǎng)發(fā)育是否存在相關(guān)性[4]。經(jīng)RT-qPCR，P7時(shí)即可在WT小鼠的下丘腦、垂體和顱蓋骨檢測(cè)到Foxl2，肝臟中檢測(cè)不到。若下丘腦的Foxl2表達(dá)量定為1，則顱蓋骨和垂體的表達(dá)量分別是其10、244倍。在Foxl2-/-小鼠的同一組織內(nèi)，比較下丘腦-垂體-骨軸上的標(biāo)記物表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Foxl2-/-小鼠的下丘腦生長(zhǎng)激素釋放激素上調(diào)，而垂體Ghrh受體和生長(zhǎng)激素下調(diào)，而Igf1基因在顱蓋骨和肝臟中均可檢測(cè)到(見(jiàn)圖2)。

2.4 Foxl2-/-小鼠骨骼表型特征 新生同窩WT和Foxl2-/-小鼠僅可通過(guò)眼瞼發(fā)育不全加以區(qū)別，到2～3周時(shí)，F(xiàn)oxl2-/-小鼠開(kāi)始出現(xiàn)短鼻和牙反合。牙反合隨門牙不斷增長(zhǎng)而越發(fā)明顯，出生后13～15 d開(kāi)始每?jī)商鞂?duì)其下門牙做修剪以利生存。

用阿爾新蘭/茜素紅進(jìn)行骨架染色，發(fā)現(xiàn)Foxl2-/-小鼠骨骼形成異常。4周時(shí)，F(xiàn)oxl2-/-小鼠頭部明顯較短，上頜骨、前頜骨、鼻骨發(fā)育不足。因圓拱形的顱蓋骨、大小相對(duì)正常的下頜骨和其他面部小骨骼共同導(dǎo)致了明顯的牙反合(見(jiàn)圖3)。4周后，兩種小鼠出現(xiàn)體型差異，F(xiàn)oxl2-/-小鼠有明顯的脊柱過(guò)度前凸和后凸。通過(guò)放射顯影和茜素紅染色對(duì)比觀察到，F(xiàn)oxl2-/-和WT小鼠的體型和脊柱存在顯著差異，成年Foxl2-/-小鼠骨骼染色較WT小鼠顏色更淡，提示骨量減少(見(jiàn)圖4)。

2.5 Foxl2-/-小鼠存在骨骼發(fā)育遲緩和軟骨成熟缺陷 為探明新生和成年小鼠骨骼異常的緣由，我們檢測(cè)了WT和Foxl2-/-小鼠的胚胎。如圖5，交配后12.5 d(12.5 dpc)，經(jīng)阿爾新蘭/核固紅和硝酸銀染色后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxl2-/-小鼠椎體致密度受損(vc)，椎間間質(zhì)中(im)，間充質(zhì)紊亂(mt、箭頭處)、細(xì)胞數(shù)少，且阿爾新蘭染色略顯蒼白，提示致密軟骨形成延遲或減少(見(jiàn)圖5)。14.5 dpc和15.5 dpc時(shí)，F(xiàn)oxl2-/-小鼠胸椎處(Mk)可見(jiàn)成熟軟骨排列紊亂，同時(shí)WT小鼠該處著色較深，提示其軟骨已開(kāi)始鈣化(見(jiàn)圖6)。16.5dpc時(shí)Foxl2-/-小鼠椎體仍礦化不足(見(jiàn)圖7)。以上結(jié)果表明，F(xiàn)oxl2-/-小鼠存在骨骼發(fā)育延遲和軟骨成熟缺陷。

3 討 論

3.1 Foxl2通過(guò)GH/IGF1軸影響生長(zhǎng)發(fā)育 GH以旁分泌形式存在于大多數(shù)組織中，其調(diào)節(jié)是機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育重要的生理過(guò)程，通過(guò)直接活化特定的GH受體或由肝臟產(chǎn)生IGF1間接應(yīng)答GH刺激[12-13]。Gh和Igf1缺陷的小鼠模型出現(xiàn)生長(zhǎng)缺陷，但除局部長(zhǎng)骨礦化缺陷外并沒(méi)有顯著的骨骼異常[14]。

本試驗(yàn)中，F(xiàn)oxl2-/-小鼠GH/IGF1軸活性降低可解釋兩種小鼠的生長(zhǎng)曲線差異?？赡艿臋C(jī)制為，Gh負(fù)反饋調(diào)節(jié)Ghrh表達(dá)，F(xiàn)oxl2-/-小鼠垂體內(nèi)缺乏Gh，因此下丘腦Ghrh上調(diào)，故Gh在Ghrh通路中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用明顯減弱。而垂體中經(jīng)Foxl2調(diào)節(jié)的Gh和Ghrh-r水平降低，也能解釋肝臟、骨骼、血清中IGF1水平降低。

a WT、Foxl2-/-小鼠出生后21～23 d(虛線所示)體重開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異 b WT、Foxl2-/-小鼠出生后10～30 d(虛線所示)生長(zhǎng)速率(dW/dt)出現(xiàn)顯著差異 c WT、Foxl2-/-小鼠出生后10～30d(虛線所示)比時(shí)生長(zhǎng)速率[(dW/dt)*(1/W)]有顯著差異

圖1 WT、Foxl2-/-小鼠出生后體重-生長(zhǎng)曲線比較

a 下丘腦Ghrh上調(diào) b 垂體Ghrh-r和Gh下調(diào) c 顱蓋骨和肝臟中Igf 1下調(diào)

圖2 WT和Foxl2-/-小鼠的IGF1/GH軸基因表達(dá)比較

a 腹位像 b 側(cè)位放射顯象 c 側(cè)位茜素紅染色 d 背位示頭骨形態(tài)差異

注：白線示Foxl2-/-小鼠篩骨(et)缺失；箭頭示Foxl2-/-小鼠額骨隆起；i-人字形骨縫；s-矢狀縫；c-冠狀縫；if-額間縫

圖3 WT與Foxl2-/-成年小鼠頭蓋骨發(fā)育缺陷對(duì)比(標(biāo)尺=1 cm)

a 放射顯影 b 茜素紅染色

圖4 WT和Foxl2-/-成年小鼠骨骼對(duì)比(標(biāo)尺=1 cm)

注：vc-椎體致密度；im-椎間間質(zhì)；mt-間充質(zhì)

圖5 WT和Foxl2-/-小鼠胚胎軟骨形成比較(12.5 dpc，阿爾新蘭/核固紅和硝酸銀染色，×20，標(biāo)尺=50 μm)

a WT小鼠胚胎軟骨細(xì)胞 b Foxl2-/-小鼠胚胎軟骨細(xì)胞

圖6 WT和Foxl2-/-小鼠胚胎的骨骼礦化分析(15.5 dpc，×200，標(biāo)尺=5 μm)

a WT小鼠胚胎軟骨細(xì)胞 b Foxl2-/-小鼠胚胎軟骨細(xì)胞

圖7 注：np-髓核；vb-椎體WT和Foxl2-/-小鼠胚胎的骨骼礦化分析(16.5 dpc，×200，標(biāo)尺=5 μm)

3.2 Foxl2對(duì)顱面部和骨骼發(fā)育的影響 顱骨間質(zhì)分化自頭部軸旁中胚層和顱神經(jīng)嵴兩個(gè)不同的胚胎來(lái)源，F(xiàn)oxl2-/-小鼠顱面部和骨骼異常表型和骨化受損與神經(jīng)管上皮細(xì)胞和頭部間質(zhì)細(xì)胞在9.5 dpc時(shí)Foxl2表達(dá)缺失有關(guān)。這些細(xì)胞作為多潛能細(xì)胞群，可以分化出許多不同的細(xì)胞類型，包括面部軟骨和骨[15]。神經(jīng)管上皮細(xì)胞和頭部間質(zhì)細(xì)胞中有Foxl2表達(dá)，提示Foxl2參與上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)變和間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的過(guò)程。

根據(jù)對(duì)Foxl2-/-小鼠模型的全面研究，我們發(fā)現(xiàn)Foxl2不僅在卵巢和眼瞼發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，還可通過(guò)GH/IGF1軸特異調(diào)節(jié)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育。盡管配對(duì)的WT和Foxl2-/-小鼠均存在由基因差異引起的骨骼表型差異，但Foxl2是直接還是間接地參與這些調(diào)節(jié)尚不明確。Foxl2在顱面部、骨和軟骨的發(fā)育過(guò)程中復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，有待今后進(jìn)一步研究。

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Modulations of FOXL2 on Cartilage and Skeletal Development in Mice

Xue Jianli

(The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China)

Objective Haploinsufficiency of the Foxl2 transcription factor in humans causes Blepharophimosis/Ptosis/Epicanthus Inversus syndrome(BPES)，characterized by eyelid anomalies and premature ovarian failure.Mice lacking Foxl2 recapitulate human eyelid/forehead defects and undergo female gonadal dysgenesis.Our experiment aims to explore the influence of lacking Foxl2 in postnatal growth and embryonic bone and cartilage formation in mice.Methods Foxl2-/-male mice at different stages of development have been characterized and compared to wild type.Body length and weight were measured and growth curves were created.Skeletons were stained with alcian blue and/or alizarin red.Bone and cartilage formation was analyzed by Von Kossa staining and immunofluorescence using anti-Foxl2 antibodies followed by confocal microscopy.Analysis of the GH/IGF1 pathway was done evaluating the expression of several hypothalamic-pituitary-bone axis markers by RT-qPCR.Results Compared to wild-type，F(xiàn)oxl2 null mice are smaller and show skeletal abnormalities and defects in cartilage and bone mineralization，with down-regulation of the GH/IGF1 axis.Conclusion Our results support Foxl2 as a master transcription factor in a spectrum of developmental processes，including growth，cartilage and bone formation.

foxl2；bone development；cartilage development；mice

陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2016SF-187)

1008-5572(2017)02-0142-05

R322.7+1

A

2016-03-18

薛建利(1981- )，男，主治醫(yī)師，西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨三科，710004。

薛建利.Foxl2基因?qū)π∈筌浌羌肮前l(fā)育的調(diào)控研究[J].實(shí)用骨科雜志，2017，23(2)：142-146.

實(shí)驗(yàn)研究