銀杏葉聚戊烯醇納米乳液聯(lián)合抗生素抗菌活性研究

陶 冉， 王成章*， 葉建中， 周 昊， 陳虹霞

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所， 北京 100091；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實(shí)驗(yàn)室；國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210042)

銀杏葉聚戊烯醇納米乳液聯(lián)合抗生素抗菌活性研究

TAO Ran

陶 冉1,2， 王成章1,2*， 葉建中2， 周 昊1,2， 陳虹霞2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所， 北京 100091；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實(shí)驗(yàn)室；國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210042)

通過探討銀杏葉聚戊烯醇納米乳液(GBP)的平均粒徑對(duì)其自身抗菌增效作用的影響，以及考察最小抑菌濃度(MIC)和分級(jí)抑菌濃度(FIC)；同時(shí)研究亞抑菌濃度條件下，聚戊烯醇納米乳液與抗生素聯(lián)合作用的時(shí)間-殺菌曲線，研究了銀杏葉聚戊烯醇納米乳液與氨芐西林(A)、環(huán)丙沙星(C)、硫酸慶大霉素(G)、紅霉素(E)和多粘菌素B硫酸鹽(P)這5種抗生素的協(xié)同抗菌作用。結(jié)果顯示：聚戊烯醇乳液配伍抗生素的抑菌圈直徑隨著乳液平均粒徑增大而減小，由此推斷聚戊烯醇納米乳液可能具有提高聚戊烯醇自身的增效能力。聚戊烯醇納米乳液與硫酸慶大霉素混合對(duì)金黃色葡萄球菌具有協(xié)同抗菌作用(FIC指數(shù)為0.5)，混合樣抑菌圈值為(25.8±0.1)mm， MIC值為33 mg/L。聚戊烯醇與硫酸慶大霉素混合可以有效地提高對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果并延長抗菌時(shí)間。

銀杏；聚戊烯醇；納米乳液；抗生素；抗菌作用

抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用，已成為中國乃至國際醫(yī)療、食品安全管理中最為關(guān)注的問題。抗生素的濫用導(dǎo)致的微生物耐藥性以及其本身的毒副作用，在不知不覺中威脅著人類生命健康。因此，在科學(xué)用藥的前提下，尋找更強(qiáng)抗生素的同時(shí)，能夠篩選出天然高效、具有廣泛抗菌增效作用以及延長抗菌時(shí)效的化合物，是緩解此類問題較為有效的途徑。聚戊烯醇是由若干個(gè)異戊烯基單元及終端異戊烯羥基組成的線性長鏈同系物，是生物體細(xì)胞膜糖蛋白生物合成的關(guān)鍵產(chǎn)物，以游離態(tài)醇或磷酸酯形式分布于細(xì)胞膜中，并能夠參與生物體內(nèi)多種生理代謝活動(dòng)[1-2]。目前已有報(bào)道的聚戊烯醇及其衍生物已有幾十種，生物活性主要包括抗癌、抗病毒、改善大腦功能、保肝以及抗菌等作用[3-6]。聚戊烯醇廣泛存在于高等植物中，銀杏葉和綠色針葉中的聚戊烯醇含量相對(duì)較高，銀杏葉中含聚戊烯醇達(dá)2.0%，碳鏈分布范圍在C70～C120[7]。利用聚戊烯醇作為良好的生物細(xì)胞膜調(diào)節(jié)劑輔助抗菌藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部參與代謝，可以較好地提高藥物的生物利用度以及靶向性，從而達(dá)到減少抗生素用量和提高抗菌治療效果的目的。然而，聚戊烯醇的強(qiáng)疏水性導(dǎo)致其在水中不能良好分散，影響其生物活性研究以及相關(guān)制劑開發(fā)。利用乳化劑復(fù)配及納米分散技術(shù)制備聚戊烯醇水包油型納米乳液可以有效達(dá)到聚戊烯醇在水中良好分散的目的[8]。為了研究銀杏葉聚戊烯醇納米分散后的抗菌協(xié)同作用，本研究選擇5種化學(xué)結(jié)構(gòu)類型不同、作用機(jī)理不同且較為明確的抗生素(氨芐西林、環(huán)丙沙星、硫酸慶大霉素、紅霉素和多粘菌素B硫酸鹽)作為抗菌劑，考察聚戊烯醇納米乳液的平均粒徑對(duì)其自身抗菌增效作用的影響，進(jìn)而通過比較最小抑菌濃度(MIC)和分級(jí)抑菌濃度(FIC)來考察聚戊烯醇納米乳液的抗菌增效作用；進(jìn)一步分析了亞抑菌濃度條件下，聚戊烯醇納米乳液與抗生素聯(lián)合作用的時(shí)間殺菌曲線。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

銀杏葉聚戊烯醇(C70～C120)，按文獻(xiàn)[6]方法制備(波長210 nm，HPLC面積歸一法測(cè)得純度>99.0%)[9]。供試菌種：大腸桿菌(Escherichiacoli)NCTC 12923、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 25923，中國典型培養(yǎng)物保藏中心。柱層析用硅膠G(40～45 μm)，試劑級(jí)；薄層析用硅膠G，分析純；硫酸慶大霉素(Sigma G3632, 100 mg)；牛肉膏、魚粉蛋白胨、卵磷脂、瓊脂條等，均為生物試劑，其他試劑為分析純或色譜純。

ZLE-B300型均質(zhì)乳化機(jī)，上海眾時(shí)機(jī)械有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，SPD-20A型(DAD)檢測(cè)器，日本島津；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1G凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CASBA- 4 菌落掃描儀及軟件，美國Spiral Biotech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米乳液的制備 稱取銀杏葉聚戊烯醇10 g(約8.3 mmol)于250 mL錐形瓶中，邊攪拌邊加入17.5 g乳化劑(m(Span 80) ∶m(Tween 80) 0.514 ∶0.486，HLB值9.5)，充分?jǐn)嚢韬?，緩慢加入少量去離子水，充分混合后繼續(xù)加水轉(zhuǎn)相至100 mL，充分?jǐn)嚢韬螅ㄟ^調(diào)整溫度、攪拌速度以及時(shí)間，得到質(zhì)量濃度均為500 mg/L的不同粒徑聚戊烯醇納米乳液GBP-1、GBP-2、GBP-3和GBP- 4,平均粒徑分別為90.2、289.7、632.9和11 012.2 nm[8]。

1.2.2 抑菌活性測(cè)定 采用牛津杯檢測(cè)法對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)[10]。將500 mg/L納米乳液并滴加到牛津杯中，按相等間距分別放置在瓊脂表面上，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。每個(gè)濃度相同的樣品重復(fù)測(cè)定3次。以氨芐西林(A)、硫酸慶大霉素(G)、環(huán)丙沙星(C)、紅霉素(E)和多粘菌素B硫酸鹽(P)等5種抗生素作為陽性對(duì)照，質(zhì)量濃度分別為10 mg/L氨芐西林，10 mg/L環(huán)丙沙星，10 mg/L 硫酸慶大霉素，15 mg/L紅霉素，10 mg/L 多粘菌素B硫酸鹽，以空白(只有水和乳化劑，不含樣品和抗生素)作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌圈直徑(mm，包含杯的外邊)。混合樣品各終濃度與單一樣品濃度保持一致，即為10 mg/L氨芐西林+500 mg/L聚戊烯醇，10 mg/L環(huán)丙沙星+500 mg/L聚戊烯醇，10 mg/L硫酸慶大霉素+500 mg/L聚戊烯醇，15 mg/L紅霉素+500 mg/L聚戊烯醇，10 mg/L多粘菌素B硫酸鹽+500 mg/L聚戊烯醇。所有試驗(yàn)樣品均含3個(gè)平行樣，用標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)來表示抑菌圈直徑的誤差。

1.2.3 最小抑菌質(zhì)量濃度的測(cè)定 利用肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。樣品質(zhì)量濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1和0.5 mg/L，按文獻(xiàn)[11]方法在37 ℃培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)皿顯示沒有明顯的菌株生長的濃度即為MIC。

1.2.4 分級(jí)抑菌濃度的測(cè)定及抗菌協(xié)同作用類型的確定 A和B聯(lián)合用藥的分級(jí)抑菌濃度(FIC)指數(shù)是其單獨(dú)用藥時(shí)與兩種藥物聯(lián)合用藥時(shí)MIC比值的總和?？咕鷧f(xié)同作用類型的確定：04，拮抗作用[12]。

1.2.5 對(duì)金黃色葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線 研究在亞抑菌質(zhì)量濃度下(硫酸慶大霉素2 mg/L，聚戊烯醇 64 mg/L 及其混合樣品中含有0.5 mg/L硫酸慶大霉素和16 mg/L聚戊烯醇)樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線[13]。用預(yù)熱的陽離子調(diào)節(jié)肉湯(CA-MHB)稀釋菌液30倍后隔離培養(yǎng)過夜，然后在37 ℃ 進(jìn)一步培養(yǎng)直至對(duì)數(shù)生長期晚期，用CA-MHB稀釋好的菌液在630 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)瓶中的菌液濃度為109個(gè)/mL，在搖床中37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，前12 h中，樣品每2 h取樣一次，之后在18和24 h各取樣一次。細(xì)菌總數(shù)通過稀釋10倍的樣品(50 μL)轉(zhuǎn)移到米勒-海頓瓊脂(MHA)板來確認(rèn)。在加濕的孵化器中孵化(37 ℃)18至24 h，每個(gè)樣品中的細(xì)菌密度由CASBA- 4菌落掃描儀相關(guān)軟件確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性及協(xié)同作用的確定

將4種不同粒徑的聚戊烯醇乳液(GBP-1、GBP-2、GBP-3和GBP- 4)分別與5種抗生素按1.2.2節(jié)終濃度混合，通過抑菌圈直徑大小的比較考察其抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性，并通過方差(Tukey檢驗(yàn)在5%的概率)進(jìn)行分析，結(jié)果見1。

表1 抑菌圈直徑比較Table 1 The diameters of the inhibition halos

1)*:比抗生素組抑菌圈值大且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異greater and having statistical difference compared with the corresponding antibiotics group (Tukey 檢驗(yàn)Tukey′s HSD test,p<0.05)，同組同一列不同小寫字母(a, b, c, d)表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異the different lowercase letters (a,b,c,d) in the column of the same group indicate statistical difference (Tukey 檢驗(yàn)Tukey′s HSD test,p<0.05)

由表1結(jié)果顯示，銀杏葉聚戊烯醇納米乳液除了與氨芐西林(A)、多粘菌素B硫酸鹽(P)配伍對(duì)大腸桿菌無協(xié)同作用外，其它配伍對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的協(xié)同抑制作用，即單抗生素抑菌圈由8.9～26.8 mm上升至配伍后抑菌圈11.6～29.5 mm(陰性對(duì)照為0)。GBP-1配伍組抑菌性能增強(qiáng)最多，其次是GBP-2和GBP-3，GBP- 4最弱?？梢钥闯觯畚煜┐既橐簠f(xié)同抑菌活性隨著乳液平均粒徑的減小而增強(qiáng)，由此推斷聚戊烯醇納米乳液可能具有對(duì)于抗生素抗菌活性的增效能力。進(jìn)一步研究聚戊烯醇納米乳液與抗生素抑菌的MIC值和FIC指數(shù)(見表2)，可以有效地說明其協(xié)同抗菌作用。

表2 不同樣品的MIC值及聯(lián)合FIC值Table 2 MIC and FIC index of the different samples

1)括號(hào)中前者為抗生素，后者為GBP-1 the former is antibiotics, the latter is GBP-1 in bracket; 2)*:協(xié)同作用synergistic effect (0

表2的結(jié)果表明，與其他抗生素相比，GBP-1與硫酸慶大霉素(G)混合對(duì)金黃色葡萄球菌具有協(xié)同抗菌作用(FIC指數(shù)為0.5)，混合樣抑菌圈直徑為(25.8±0.1)mm， MIC值為33 mg/L(GBP-1為32 mg/L，硫酸慶大霉素為1 mg/L)。GBP-1與環(huán)丙沙星(C)、硫酸慶大霉素、紅霉素(E)混合樣對(duì)大腸桿菌具有相加作用，以及與氨芐西林(A)、環(huán)丙沙星、紅霉素、多粘菌素B硫酸鹽(P)混合樣對(duì)金黃色葡萄球菌具有相加作用，F(xiàn)IC指數(shù)范圍為0.75～1。GBP-1與氨芐西林、多粘菌素B硫酸鹽混合樣對(duì)大腸桿菌具有無關(guān)作用，F(xiàn)IC指數(shù)為3。由此，有必要在亞抑菌濃度條件下研究聚戊烯醇納米乳液、硫酸慶大霉素及其混合樣品對(duì)金黃色葡萄球菌在不同時(shí)間段的殺菌曲線。

2.2 對(duì)金黃色葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線

圖1 亞抑菌濃度下不同樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線Fig.1 Time-killing curves of S. aureus in different samples under sub-MIC conditions

在亞抑菌質(zhì)量濃度下，GBP-1、硫酸慶大霉素(G)及其混合樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線如圖1所示。由圖1可知，在0～6 h時(shí)，硫酸慶大霉素的抗菌活性比其與GBP-1的混合樣品強(qiáng)； 6～24 h時(shí)，GBP-1與硫酸慶大霉素混合樣品的抗菌活性明顯強(qiáng)于硫酸慶大霉素，且抗菌活性能保持一定的強(qiáng)度而不減弱，而硫酸慶大霉素12 h后的抗菌作用逐漸減弱。然而，0～24 h時(shí)GBP-1本身始終保持著微弱的抗菌作用。因此，可以看出，聚戊烯醇納米乳液與硫酸慶大霉素混合可以有效地提高對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果并延長抗菌時(shí)間。

2.3 討論

有研究報(bào)道，植物中某些活性成分的納米乳液和聚合物膠束可作為良好的載體傳輸系統(tǒng)，能夠表現(xiàn)出更優(yōu)異的口服生物利用度和生物功效(抗炎、抗癌等等)[14]。因此研究不同粒徑的聚戊烯醇納米乳液與抗生素的聯(lián)合抗菌作用，可以有效證明納米分散對(duì)于聚戊烯醇對(duì)抗生素藥物抗菌效果以及抗菌時(shí)效的增強(qiáng)作用。有研究指出[15]倍半萜類化合物作為膜的滲透促進(jìn)劑可以提高透過膜的效率，而這類物質(zhì)可能來自其結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞膜類脂。Cornwell 等[16]發(fā)現(xiàn)橙花叔醇和法尼醇比紅沒藥醇更適合作為有效的透皮促進(jìn)劑，相比其它萜類化合物，這些化合物分子中含有更長的碳鏈，并與細(xì)胞膜內(nèi)部的雙層結(jié)構(gòu)結(jié)合可以發(fā)揮重要的促進(jìn)透過作用。相比倍半萜類化合物，聚戊烯醇具有更長的碳鏈，可以更有效地增強(qiáng)細(xì)胞膜的透過性。此外，在真核生物和細(xì)菌生物膜中也發(fā)現(xiàn)了未改性的聚戊烯醇存在，這也為聚戊烯醇聯(lián)合抗生素的協(xié)同抗菌作用奠定了理論基礎(chǔ)。有大量證據(jù)表明，聚戊烯醇可以有效地增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性、離子滲透性以及形成雙層六角II形的傾向[17]。

聚戊烯醇納米乳液與抗生素聯(lián)用提高抗菌效果的現(xiàn)象與當(dāng)前報(bào)道具有一定的關(guān)聯(lián)性，上述研究結(jié)果也表明，聚戊烯醇與不同種類的抗生素聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)出的體外抗菌效果增強(qiáng)能力，具有非特異性以及一定的廣泛性。結(jié)合聚戊烯醇生物膜生物活性研究可以預(yù)見，其它類細(xì)胞質(zhì)靶向抗菌藥物包括食品防腐劑、消毒劑、殺菌劑，以及其他抗生素與聚戊烯醇聯(lián)用也將表現(xiàn)出增強(qiáng)抗菌活性的作用。由于聚戊烯醇與細(xì)胞膜的滲透交換作用，由此推斷，作用于細(xì)胞膜的抗菌活性化合物更容易受到外源性聚戊烯醇增加的影響，即增強(qiáng)其抗菌性能。本研究結(jié)果反映了硫酸慶大霉素支持這一理論。因?yàn)槌伺c細(xì)菌核糖體的相互作用，陽離子氨基糖苷類抗生素硫酸慶大霉素也具有破壞膜穩(wěn)定性的作用[18]。

3 結(jié) 論

3.1 銀杏葉聚戊烯醇納米乳液與5種抗生素的協(xié)同抗菌作用研究結(jié)果表明，聚戊烯醇乳液配伍抗生素的抑菌圈直徑隨著乳液平均粒徑增大而減小，由此推斷聚戊烯醇納米乳液可能具有提高聚戊烯醇自身的增效能力。

3.2 聚戊烯醇納米乳液與硫酸慶大霉素混合對(duì)金黃色葡萄球菌具有協(xié)同抗菌作用(FIC指數(shù)為0.5)，混合樣抑菌圈為(25.8±0.1)mm， MIC值為33 mg/L(GBP-1為32 mg/L，硫酸慶大霉素為1 mg/L)。

3.3 聚戊烯醇與硫酸慶大霉素混合可以有效地提高對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果并延長抗菌時(shí)間。聚戊烯醇的抗菌增效作用有望促使其在藥物以及食品防腐劑、消毒劑、殺菌劑等領(lǐng)域的開發(fā)及應(yīng)用，并為銀杏資源的綜合利用拓展新的方向。

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Antibacterial Activity ofGinkgobilobaLeaves Polyprenols Nanoemulsion in Combination with Antibiotics

TAO Ran1,2, WANG Chengzhang1,2, YE Jianzhong2, ZHOU Hao1,2, CHEN Hongxia2

(1.Research Institute of Forestry New Technology,CAF, Beijing 100091, China; 2.Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF;National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization;Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering,SFA;Key Lab.of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province, Nanjing 210042, China)

The synergistic antibacterial effects ofGinkgobilobaleaves polyprenols nanoemulsion (GBP) combined with five types of antibiotics，i.e.， ampicillin (A), ciprofloxacin (C), gentamicin sulfate(G), erythromycin(E), and polymyxin B sulfate (P), were determined through analyzing the average diameter of the inhibition halos, minimal inhibitory concentration (MIC), fractional inhibitory concentration (FIC) index and the time-killing curves under sub-MIC conditions. The results showed that the antibacterial effect of polyprenols nanoemulsion combined with the antibiotics enhanced with the increase of the average diameter of polyprenols nanoemulsion. The antibacterial effect of polyprenols could be improved by nanoemulsion. The polyprenol combined with gentamicin sulfate had synergistic antibacterial effect againstStaphylococcusaureuswith the FIC index of 0.5, the diameter of the inhibition halos of (25.8±0.1)mm, and the MIC value of 33.0 mg/L. The time-killing curves showed that the antibacterial effect and the antibacterial time could be increased after polyprenols mixed with gentamicin sulfate.

Ginkgobiloba;polyprenol;nanoemulsion;antibiotic;antibacterial activity

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.01.010

2016- 01- 06

中國林科院林業(yè)新技術(shù)所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(CAFINT2014C10)；江蘇省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(BK20150070)； 江蘇省林業(yè)三新工程項(xiàng)目(LYSX[2014]09)

陶 冉(1982— ),男，江蘇連云港人，助理研究員，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)的研究；E-mail:trmoon1949@163.com

*通訊作者：王成章，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物研究與利用方面的工作：E-mail:wangczlhs@sina.com。

TQ35

A

0253-2417(2017)01- 0081- 06

陶冉，王成章，葉建中，等.銀杏葉聚戊烯醇納米乳液聯(lián)合抗生素抗菌活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2017，37(1)：81-86.