我國蘋果主要類病毒的研究現(xiàn)狀

吳 然，徐秋良

(石家莊市農林科學研究院 果樹花卉研究中心，石家莊，050000)

類病毒的概念是由植物病理學家Diener在馬鈴薯紡錘塊莖病的研究中首次提出[1]。類病毒是目前為止發(fā)現(xiàn)的最小病原物，約由246～463個核苷酸組成[2]。類病毒一旦侵染果樹，就會對植株造成極大的影響，即使不表現(xiàn)病癥或無明顯病癥，果樹被類病毒侵染后很難有效根除。蘋果是我國的重要生產樹種，近年來類病毒對蘋果的侵染有蔓延趨勢，致使果實的產量和品質下降，還嚴重影響了果農的經濟收益。迄今為止類病毒病害在我國蘋果上發(fā)生的主要有：蘋果銹果類病毒ASSVd(AppleScarSkinviroid)、蘋果凹果類病毒ADFVd(Appledimplefruitviroid)、蘋果皺果類病毒AFCVd(Applefruitcrinkleviroid)等。

1 我國蘋果類病毒的種類及特性

1.1 蘋果銹果類病毒

蘋果銹果類病毒ASSVd屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospivioidae)蘋果銹果類病毒屬(Apscaviroid)，約含330個左右的核苷酸，是目前發(fā)現(xiàn)的最小病原物，存在于細胞核內，具有自我復制能力，有中央保守序列并且不具有核酶活性[3，4]。1987年，日本的病理學家Hashimoto等[5]確認其為類病毒，并首次報道了它的全序列。

研究發(fā)現(xiàn)，ASSVd不僅可侵染蘋果[6]，還可以侵染梨[7]、桃子[8]、杏[3]等，感病果實的病癥基本表現(xiàn)為花臉型、銹果型、銹果花臉復合型、環(huán)斑型和綠點型5種(表1)。研究檢測表明，植株一旦染病即全身帶毒，其葉、莖、砧木及果實都可檢測出ASSVd[9]；病樹的果實變小、硬度增加、表面有銹斑、風味變差，失去商品價值，對果農造成嚴重的經濟損失[10]；尤其是在近幾年，ASSVd在我國蘋果主產區(qū)發(fā)生嚴重，但目前尚未發(fā)現(xiàn)針對該病毒的有效防治措施。

1.2 蘋果凹果類病毒

蘋果凹果類病毒ADFVd目前在我國蘋果果園發(fā)生率較低。因其致使意大利的蘋果品種Starking Delicious表現(xiàn)出明顯的凹果病癥而由此得名,是一種新發(fā)現(xiàn)的類病毒病害。它與蘋果銹果類病毒同為Pospiviroidae 科Apscaviroid屬成員，其RNA有306 nt組成，ADFVd與ASSVd的序列相似性高達63.5%，包含了蘋果銹果類病毒組的整個保守區(qū)域[11]。我國的趙英等[12]在新疆栽培的國光蘋果品種上也檢測到ADFVd，并為進一步研究ADFVd的株系分化奠定了良好的基礎。

被ADFVd侵染的蘋果病癥表現(xiàn)為，果實畸形和果皮表面形成病斑(3～4 mm的凹形綠色斑點)，這些病斑的出現(xiàn)會導致部分下層果肉壞死和果實萎縮(表1)。另外，在某些蘋果品種上的發(fā)病癥狀與ASSVd侵染導致的斑點類似[11]。

1.3 蘋果皺果類病毒

蘋果皺果類病毒AFCVd一般約有368～372個核苷酸，非對稱性復制，存在于細胞核內，也同屬于Pospiviroidae科Apscaviroid屬[14]。1976在日本首次發(fā)現(xiàn)蘋果皺果病癥，后經試驗確認是由AFCVd引起[16]。我國趙英等[14]成功在新疆栽培的蘋果上檢測出了該病毒并對其序列進行了分析，確認其被AFCVd侵染，這也是我國首次對AFCVd的報道。

AFCVd侵染蘋果后，主要會對果實造成危害。其癥狀表現(xiàn)為果實粗糙皺縮和果肉壞死(表1)。在幼果期間，感病果實的果面就開始出現(xiàn)水漬狀凹陷斑，凹陷斑大小不一且形狀不規(guī)則，從而形成畸形果[15]；待到7月下旬后，感病斑塊發(fā)展為鐵銹色且木栓化；另外有一些品種感病后，樹皮也發(fā)生異常，如出現(xiàn)枝條末梢枯死等[16]。近年的研究中發(fā)現(xiàn)，在日本一些鄰近蘋果果園的啤酒花中也可檢測到AFCVd，這一發(fā)現(xiàn)說明AFCVd的寄主范圍有不斷擴大的趨勢[17]。

表1 我國蘋果類病毒的特性

2 蘋果類病毒的檢測技術

類病毒為環(huán)狀RNA分子，不具有外殼蛋白，所以不能編碼蛋白，因此不能用血清學的方法檢測，如酶聯(lián)免疫吸附法等。目前研究中，應用于蘋果類病毒的檢測方法主要包括指示植物法和分子生物學技術等。

2.1 指示植物法

指示植物法，是通過對病毒敏感性強并且能表現(xiàn)出明顯癥狀的植物，作為指示植物來鑒別是否被侵染的方法[18]。研究者們利用指示植物法研究病毒的侵染機理，汁液摩擦是將病毒接種到指示植物上的主要方法。檢測果樹是否被病毒侵染的指示植物分為木本和草本2種類型。董艷娜等[19]利用番茄為指示植物鑒定出了5種柑橘類病毒。在蘋果病毒病檢測方面，辛玉成等[20]在恒溫室利用雜種榅桲檢測出了蘋果莖痘病毒以及蘋果莖溝病毒。謝曉亮等[21]利用昆諾藜和心葉煙，檢測到蘋果莖溝病毒和蘋果褪綠葉斑病毒。利用指示植物法檢測病毒，不需要先進的儀器也無需復雜的檢測步驟。但是該方法耗時較長且對外部環(huán)境條件的要求很高；另外有些指示植物可以被幾種類病毒復合侵染，因為感染不同類病毒表現(xiàn)的病癥不同，所以要將其鑒別區(qū)分很難[22]。

2.2 分子生物學技術

2.2.1聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術，用于分離蛋白質和寡核苷酸。利用該方法即使不知道類病毒的核酸序列，也可判斷出病原物是否為類病毒。它的作用原理是在變性電泳條件下交換電極，使類病毒的環(huán)狀核酸打開由棒狀變?yōu)榄h(huán)狀，遷移速度變慢，從而類病毒的環(huán)狀分子與寄主的線性核酸分子分離，并因此產生明顯的條帶[23，24]。該方法最開始用于類病毒和環(huán)狀RNA的提純和分離，在運用于檢測類病毒后被進一步改進。Morris等[25]首次通過該方法從植物中成功檢測出馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RNA分子，經染色后呈現(xiàn)藍色條帶。利用該方法的檢測成本較低,但靈敏度不高且需要大量的植物樣本。

2.2.2RT- PCR擴增 RT- PCR是一種十分靈敏的檢測方法，即使是很低拷貝數(shù)的RNA，也可以檢測到。這種方法要求模板的純度很高，但是果樹類的檢測樣本通常具有大量的糖類，所以在提取中容易失敗，可將乙二醇單甲醚和聚乙烯吡咯烷酮加入PCR中來去除糖類和RNA的阻遏物[26]。當前利用RT- PCR的方法來檢測果樹類病毒已經非常普遍：趙英等[12，14]利用RT- PCR成功檢測出了蘋果凹果類病毒和蘋果皺果類病毒；陳紅霞等[27，28]利用RT- PCR檢測到了蘋果銹果類病毒，并且利用一步多重的RT- PCR方法同時快速檢測出3種蘋果潛隱性病毒；Ragozzino等[29]利用RT- PCR可同時檢測7種類病毒，這也證實了這種方法的便捷和高靈敏度。

2.2.3實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR是一種新興的定量試驗技術,它通過使用熒光化學物質來檢測DNA擴增反應中每次PCR循環(huán)后產物的總量。這種方法實現(xiàn)了對DNA模板的定量并且無需電泳，因此較RT- PCR不易出現(xiàn)因污染而導致的假陽性結果，所以其檢測結果更加精確[30]。

根據(jù)實時熒光反應體系中加入的不同熒光化學，將其分為熒光染料法和探針法。在近年來有關檢測蘋果病毒病的研究中，秦子禹等[31～33]利用Taqman探針法檢測到了3種蘋果潛隱性病毒，但探針的使用會大大提高病毒檢測的難度。研究表明利用SYBR Green I染料法檢測病毒，不僅成本低于探針法而且簡化了檢測步驟，因此更適于針對大量樣本的快速檢測[34]。吳然等[35]利用SYBR Green I染料法快速檢測出了蘋果銹果類病毒，且證實了其靈敏度要高于常規(guī)RT- PCR100倍。

表2 蘋果類病毒的檢測方法

3 展 望

蘋果是我國重要的經濟樹種，產量居世界第一位。類病毒的穩(wěn)定性極高，可通過嫁接、修剪等農事操作傳播，從而快速蔓延。目前蘋果類病毒病害已嚴重影響了我國蘋果產業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。由于果樹一旦感染類病毒就將終身帶毒的特性，至今還沒有有效的措施來防治類病毒。針對此現(xiàn)狀，培育無毒苗木并在無毒苗生產過程中有效篩除類病毒，便是在源頭上解決類病毒侵染和蔓延的關鍵。但是由于市場監(jiān)管不力、生產技術不規(guī)范等問題，市場上用于生產的真正的無毒苗很少。因此我國應健全蘋果無毒苗的生產規(guī)范，完善無毒苗的生產體系和和市場監(jiān)管系統(tǒng)；建立簡捷、準確的類病毒檢測體系，從而為我國蘋果的生產提供大量優(yōu)質、放心的無毒苗木；積極推廣無毒苗木，把政府部門、科研高校、相關企業(yè)和農戶結合起來，建成一個自下而上的網(wǎng)絡結構，從而從源頭控制果樹類病毒，有效防止類病毒的蔓延，進而提高我國蘋果的品質和增加果農的經濟效益[36]。

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