下氣道菌群結(jié)構(gòu)的變化與嬰幼兒喘息的研究

張蕾 艾濤 謝誠 夏萬敏 廖惠玲 樊映紅 張瑩 賈良琴

電子科技大學醫(yī)學院附屬婦女兒童醫(yī)院·成都市婦女兒童中心醫(yī)院呼吸科（成都610000）

喘息是兒童時期最為常見的呼吸道癥狀之一，嬰幼兒表現(xiàn)尤為明顯。近年來，以喘息為主要表現(xiàn)的疾病發(fā)生率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。流行病學調(diào)查資料顯示，約1/3 兒童在3歲前至少有一次喘息發(fā)作，6歲時有將近50%兒童有過喘息發(fā)作。而反復喘息可能為早期的哮喘。哮喘是一種常見的且危害兒童健康的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，未控制的哮喘不僅影響兒童的健康和學習，而且耽誤家長的工作和生活，同時會給社會造成沉重的負擔，故應(yīng)重視早期嬰幼兒反復喘息的認識和治療。兒童哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病，引起的原因是多方面的，包括復雜的環(huán)境、免疫和宿主遺傳等相關(guān)因素。已有大量研究顯示，除了遺傳和過敏性體質(zhì)因素外，呼吸道病毒及非典型病原菌的感染是引起喘息甚至導致喘息的最主要的因素[1-2]。

近10年來，隨著16S rRNA 擴增后進行測序分析技術(shù)的應(yīng)用，人們可以將微生物分類到種甚至對亞種級別進行分析，已經(jīng)研究證實下呼吸道并不是無菌的，也隱藏著大量多元微生物。支氣管粘膜上的細菌定植并不是單一的菌群，不同呼吸疾病狀態(tài)下呼吸道菌群的組成也不一樣，改變這種共生的狀態(tài)將會導致包括哮喘在內(nèi)的呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3-6]。但目前關(guān)于下氣道細菌微生態(tài)對喘息的影響研究甚少，本研究檢測喘息患兒支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），分析其下呼吸道的菌群譜，結(jié)合患兒的臨床表現(xiàn)探討氣道微生態(tài)與喘息發(fā)生的關(guān)系，為臨床的反復喘息疾病早期干預(yù)治療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批，選擇2018年1至12月成都市婦女兒童中心醫(yī)院呼吸科就診的反復喘息（喘息次數(shù)≥3次）患兒44例，其中男26例，女18例，年齡6個月至2.5歲。近1周無使用抗生素的病史，無心臟病、肺結(jié)核、支氣管異物、支氣管肺發(fā)育不良等疾病及血液檢查結(jié)果提示免疫功能異常者，影像學檢查未提示明顯異常。

1.2 術(shù)前檢查入院后24 h內(nèi)完成嬰兒潮氣肺功能（潮氣量、達峰時間比、達峰容積比、呼吸頻率）、呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)e-NO）、皮膚點刺試驗、血常規(guī)等相關(guān)檢查。

患兒入院后進行纖維支氣管鏡檢查的術(shù)前檢查，所選患兒均已經(jīng)控制喘息癥狀有行纖支鏡檢查的適應(yīng)證，并簽署支氣管鏡檢查知情同意書。在靜脈復合麻醉下經(jīng)喉罩通氣實施鏡檢術(shù)。呼吸科醫(yī)師沿氣管導管或鼻腔插入電子支氣管鏡依次觀察會厭、氣管及各段、部分亞段開口，觀察病變部位情況。選擇肺段進行灌洗，采集的氣道分泌物進行細胞計數(shù)、細菌培養(yǎng)藥敏，余分裝后高速離心，15 600 ×g4℃離心30 min，棄上清，細胞沉淀-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因組DNA的提取采用CTAB 或SDS 方法對樣本的基因組DNA進行提取，-20℃保存留待進一步分析。通過PCR擴增16S V4區(qū)引物為515F-806R，使用New England Biolabs 公 司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，高效和高保真的酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。擴增條件：98℃預(yù)變性1 min；30個循環(huán)包括（98℃，10 s；50℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min。脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，選擇主帶大小在400～450 bp 之間的序列，割膠回收目標條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒

1.4 生物信息學分析使用New England Biolabs公司的NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，合格后，使用HiSeq進行上機測序?；谟行?shù)據(jù)進行OTUs（Operational taxonomic units）聚類和物種分類分析，同時，對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算、以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs 信息等。

1.5 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析進行比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料44例研究對象中，具有異質(zhì)性患兒（皮膚點刺試驗陽性、既往醫(yī)生診斷濕疹、過敏性疾病等）分為（atopy，A）組；無異質(zhì)性患兒為（normal，N）組；無異質(zhì)性及纖維支氣管鏡下檢查結(jié)果為氣道軟化、狹窄引起喘息者為（stenosis，S）組。3 組患兒BALF 細菌培養(yǎng)均為陰性，在年齡、性別、BALF細胞計數(shù)、血常規(guī)分類計數(shù)、肺功能、FeNO 值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 測序數(shù)據(jù)樣本共獲得2 918 985條可用的高質(zhì)量序列，序列平均長度為254 bp，所有樣品文庫的覆蓋率達98%以上，說明每個樣品的測序量均已達到飽和。以97%相似度聚類，獲得5 408個OTU，圖1顯示A 組共獲得3 364個OTU，B 組共獲得3 900個OTU，S 組共獲得3 090個OTU，3 組共有1 758個OTU。見圖1。

圖1 3 組Venn 圖Fig.1 Venn diagram of OTU in the 3 groups

2.3 Alpha多樣性分析Alpha多樣性是對樣本中物種多樣性的分析，基于OTU 種類和豐度計算ace、shannon 指數(shù)。3 組的菌群的豐度及多樣性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。

表1 44例患兒的臨床特征Tab.1 Epidemiologic characteristics of the 44 children investigated in this study±s

表1 44例患兒的臨床特征Tab.1 Epidemiologic characteristics of the 44 children investigated in this study±s

組別例數(shù)年齡（月）性別（男/女）BALF 嗜酸細胞百分比（%）BALF 中性粒細胞百分比（%）血液嗜酸細胞百分比（%）血液白細胞數(shù)（×106 /g）FeNO（ppb）潮氣量（mL/kg）達峰容積比（%）達峰時間比（%）呼吸頻率（次/min）A 組16 13.68±6.6 10/6 0.625±1.707 35.5±31.9 1.80±1.49 9.50±3.11 11.62±5.86 8.03±1.29 18.71±4.14 21.38±3.19 32.00±7.03 N 組17 16.42±10.9 9/8 0.294±1.212 24.05±20.84 2.41±1.99 9.98±4.15 10.41±2.98 8.02±1.45 18.81±6.81 21.42±5.14 31.35±1.80 S 組11 9.63±6.28 7/4 0 27.18±26.12 2.16±2.11 9.73±4.40 14.36±7.04 8.12±1.84 19.42±7.16 22.85±5.78 29.45±4.18統(tǒng)計值0.779 0.437 0.794 0.941 0.447 0.687 1.608 0.009 0.05 0.387 0.542 P 值0.446 0.804 0.459 0.398 0.643 0.509 0.213 0.991 0.950 0.652 0.586

圖2 3 組Alpha多樣性盒形圖Fig.2 The boxplot of Alpha diversity index in 3 groups

圖3 3 組Beta多樣性盒形圖Fig.3 The boxplot of Beta index in 3 groups

2.4 菌群結(jié)構(gòu)分析Beta多樣性表示的是微生物群落構(gòu)成的比較，評估微生物群落間的差異，T-test檢驗發(fā)現(xiàn)A 組與N 組、S 組比較存在明顯的菌群結(jié)構(gòu)差異（P＜0.05），見圖3。3 組從門到屬水平的菌種構(gòu)成的差異見圖4。在門水平上，3 組占主導地位的主要包括Proteobacteria 變形菌門、Firmicutes 厚壁菌門、Tenericutes軟壁菌門；其中A 組Proteobacteria 變 形 菌 門 較N、S 組 增多，而Firmicutes 厚壁菌門相對較少。在綱水平上主導的為Alphaproteobacteria a-變形菌綱、Gammaproteobacteria γ-變性菌綱、Bacilli 芽孢桿菌綱但A 組Gammaproteobacteria γ-變性菌綱更豐富。在目、科、屬水平上A 組的優(yōu)勢物種與N 組、S 組均有不同。

3 討論

圖4 3 組門、綱、目、科、屬水平的菌種的構(gòu)成差異Fig.4 Differences in composition of three groups of species at the level of phylum，class，order，family and genus

因兒童特有的解剖結(jié)構(gòu)、生理發(fā)育、免疫特點，喘息在兒童中的發(fā)生率很高。學齡前兒童反復喘息的不同表型預(yù)后不一，部分喘息表現(xiàn)可以持續(xù)到青少年甚至成年，成為哮喘，而反復喘息與哮喘之間的風險因素目前尚不明確，也導致了學齡前兒童哮喘診斷的困難和治療的不確定。在成人患者中，運用誘導痰細胞計數(shù)可將哮喘分為嗜酸性炎癥（過敏性與非過敏嗜酸性炎癥）、非嗜酸性炎癥[6-7]，用于評價氣道的炎癥及水平，指導臨床合理用藥。但誘導痰計數(shù)在兒童中開展困難[8]，本研究選取BALF細胞計數(shù)，欲探討氣道的炎癥性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 組的BALF的嗜酸性粒細胞及中性粒細胞均無異常，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究對象均未伴有發(fā)熱、影像學檢查未提示明顯異常，年齡、性別、血常規(guī)分類計數(shù)及肺功能、FeNO 等方面差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），單純從臨床表現(xiàn)很難區(qū)別喘息的表型。也進一步說明兒童不單純是成人的縮影，檢查的局限性及可信性妨礙了對反復喘息的正確認識和合理治療，導致發(fā)病率逐年上升。

初生嬰兒氣道為無菌的，但隨著年齡的增長、環(huán)境的變化氣道微生態(tài)也會發(fā)生改變，幾項研究已經(jīng)證明肺部在無外界感染的環(huán)境下并不是無菌的[9]。氣道微生態(tài)的變化與許多呼吸道疾病發(fā)生相關(guān)[10-11]。痰液樣本檢測發(fā)現(xiàn)嬰幼兒早期流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌感染與反復喘息相關(guān)，并且與健康嬰兒相比，喘息嬰兒上氣道的菌群構(gòu)成不一樣[2]。但下氣道的菌群與上氣道菌群不一致，隨著氣道的延伸，菌群的數(shù)量有減少，種類及結(jié)構(gòu)均有改變[12-14]。目前下氣道菌群的研究資料相對缺乏，國內(nèi)外少有下氣道菌群與兒童喘息的研究。因為倫理的原因，本研究未能收集健康兒童下氣道的BALF進行研究，將因氣道軟化或狹窄出現(xiàn)喘息的兒童作為研究對照組（S 組），比較3 組兒童的下氣道菌群的豐度及多樣性，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），證明3 組患兒下氣道細菌的含量及種類是一致的，結(jié)合BALF 未培養(yǎng)出細菌且中性粒細胞計數(shù)在正常范圍內(nèi)，認為通過16S rRNA擴增后進行測序檢測出的細菌為定植菌而不是感染菌。但有異質(zhì)性喘息的兒童（A 組）與其余兩組比較有明顯的菌群結(jié)構(gòu)的變化（P＜0.05）。而無異質(zhì)性喘息兒童（N 組）與因氣道軟化出現(xiàn)喘息兒童（S 組）的下氣道菌群結(jié)構(gòu)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在門水平上，3組占主導地位的菌群主要包括Proteobacteria 變形菌門、Firmicutes 厚壁菌門、Tenericutes軟壁菌門；與國外報道健康成人的下氣道主導菌群一致[10]。但A 組的Proteobacteria變形菌門較N 組及S 組更高，Proteobacteria 變形菌門在成人哮喘患者氣道中同樣增多[15-16]。而A 組的Firmicutes 厚壁菌門相對減少，國外學者通過成年鼠的動物實驗發(fā)現(xiàn)厚壁菌門可以防止氣道嗜酸細胞性炎癥[17]。因此筆者認為下氣道菌群結(jié)構(gòu)的改變與哮喘的發(fā)生是有關(guān)聯(lián)的，具有異質(zhì)性的喘息兒童也更容易發(fā)展成哮喘。生命早期的氣道菌群的失衡，可導致氣道黏膜生理機制的變化，出現(xiàn)免疫功能的改變[17-21]。相同的呼吸道病毒感染可能為喘息的促發(fā)因素，A 組患兒較其他兩組組患兒更可能出現(xiàn)氣道的高反應(yīng)，甚至發(fā)展成哮喘，不排除A 組患兒氣道菌群的失調(diào)而促進了免疫失衡的結(jié)果。而環(huán)境的保護、抗生素的合理使用均可防止氣道菌群的失調(diào)，有利于控制反復喘息及哮喘的發(fā)生。

本研究不足之處，其一、研究數(shù)量少、研究對象年齡范圍相對局限；其二、未能完善總IgE及sIgE 檢查，對于異質(zhì)性體質(zhì)的區(qū)別存在不足。因此進一步尋找氣道微生態(tài)的有益細菌，維持合理的菌群結(jié)構(gòu)，預(yù)防喘息及哮喘的發(fā)生，需要筆者更大范圍、更大樣本量、更長時間的觀察隨訪以期得出更準確的結(jié)論。