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    滇池沉積物中反硝化細(xì)菌及產(chǎn)甲烷菌的分子鑒別研究

    2018-02-28 03:25:27尹利方陳澤斌夏體淵王定康姚麗媛華金珠徐勝光王家銀
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)甲烷菌滇池文庫(kù)

    尹利方,陳澤斌,夏體淵,王定康,姚麗媛,華金珠,徐勝光,王家銀

    (1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,云南 昆明 650214;2.云南省高校生物炭工程研究中心,云南 昆明 650214; 3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所,云南 昆明 650205)

    表1 所用PCR引物

    【研究意義】隨著中國(guó)工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展,城市污水的入湖量不斷增加,河口和近岸海域氮磷負(fù)荷逐年增加,近岸水質(zhì)持續(xù)下降,富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題日趨嚴(yán)重,導(dǎo)致了一系列的環(huán)境問(wèn)題,如頻繁的赤潮和水華。滇池是中國(guó)著名的高原淡水湖泊,水污染嚴(yán)重,氮磷有機(jī)污染嚴(yán)重超標(biāo),水質(zhì)為V類(lèi)水體,嚴(yán)重富營(yíng)養(yǎng)化?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】在過(guò)去幾十年里,圍繞滇池開(kāi)展的研究多為非點(diǎn)源污染控制、地球化學(xué)和生態(tài)學(xué)方面,而水體和沉積物中微生物的研究十分匱乏。甲烷(CH4)是產(chǎn)甲烷菌在厭氧條件下分解有機(jī)物產(chǎn)生的溫室氣體,它對(duì)全球變暖的貢獻(xiàn)僅次于二氧化碳[1]。20世紀(jì)80年代以來(lái),甲烷的溫室效應(yīng)已達(dá)20 %,并以每年0.8 %~1 %的速度增長(zhǎng),在溫室效應(yīng)中起著越來(lái)越重要的作用[2]。目前對(duì)湖泊甲烷釋放總量的研究主要集中在源和匯上,在低溫下,大型淡水湖泊是大氣CH4的來(lái)源,來(lái)源于沉積物中的產(chǎn)甲烷古菌,它在厭氧條件下產(chǎn)生和釋放甲烷[3]。因此,為全面了解甲烷排放的來(lái)源。有必要研究湖泊沉積物中甲烷菌群落結(jié)構(gòu),為湖泊沉積物CH4排放的準(zhǔn)確估算提供數(shù)據(jù)支持。反硝化作用在水體氮循環(huán)系統(tǒng)中起著重要作用。在此過(guò)程中,反硝化細(xì)菌受到缺氧外部條件的影響,將硝酸鹽或亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氮?dú)饣蛞谎趸?,并將其釋放到大氣中,減少了水體中氮元素?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】因此,對(duì)滇池沉積物中反硝化細(xì)菌的多樣性進(jìn)行研究,可為微生物對(duì)反硝化作用的調(diào)控、反硝化作用的時(shí)空耦合效應(yīng)和區(qū)域氮素生物地球化學(xué)循環(huán)模式的建立提供理論依據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】文章以滇池沉積物為研究對(duì)象,采用克隆文庫(kù)的分子克隆方法,研究產(chǎn)甲烷菌和反硝化菌的群落結(jié)構(gòu),從而使人們對(duì)滇池富營(yíng)養(yǎng)化和甲烷排放的機(jī)制有更全面的認(rèn)識(shí),為滇池水體修復(fù)提供生物學(xué)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    沉積物樣品DC6于2017年1月采集自滇池草海,采用抓斗式底泥采樣器在緯度N24°55′59″,經(jīng)度E102°41′8″位點(diǎn)分別進(jìn)行3次重復(fù)采樣,重復(fù)之間間隔10 m,重復(fù)樣品混勻后裝入滅菌的250 mL錐形瓶,用于總DNA的提取。

    1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

    按陳澤斌等[4]的方法提取沉積物總DNA,采用引物NirS1F / NirS6R和Me1 / Me2分別對(duì)沉積物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1),得到反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段。PCR反應(yīng)體系及條件參照周麗[5]和楊秀清[6]的文獻(xiàn),取5 μl PCR產(chǎn)物,用1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3 克隆與測(cè)序

    回收PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體(TaKaRa),按載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。用菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆(PCR反應(yīng)體系和條件同1.2),陽(yáng)性克隆測(cè)序委托上海桑尼生物科技有限公司完成。

    1.4 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

    使用Mothur軟件按相似性(>97 %)將測(cè)得序列劃分為不同操作分類(lèi)單元(OTU)并計(jì)算文庫(kù)的覆蓋率(C)[7];用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中完成序列比對(duì)[8];用MEGA軟件生成序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[9]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段的電泳檢測(cè)

    用表1列出的引物對(duì)反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)(圖1),分別得到長(zhǎng)度分別為1000和760 bp的單一片段,這與周麗[5]和楊秀清[6]的報(bào)道一致。反硝化細(xì)菌特異性片段濃度較低,低于50 ng/μl,產(chǎn)甲烷菌特異性片段濃度較高,高于100 ng/μl。試驗(yàn)證實(shí)了滇池沉積物中存在反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌,且產(chǎn)甲烷菌的豐度高于反硝化細(xì)菌。

    2.2 克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)

    分別在2個(gè)克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑取100個(gè)菌落,進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,獲得的陽(yáng)性克隆子數(shù)分別為55和99個(gè)(表2),說(shuō)明反硝化細(xì)菌克隆文庫(kù)中克隆子陽(yáng)性率偏低,約為55.00 %,這可能與2.1中PCR擴(kuò)增得到的反硝化細(xì)菌特異性片段的濃度較低有關(guān),導(dǎo)致其與pMD19-T載體連接率低,大量空載體被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌;2.1中PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)甲烷菌特異性片段的濃度高(>100 ng/μl),其克隆文庫(kù)的陽(yáng)性率也高,約為99.00 %。Mothur軟件按大于97 %的相似性將2個(gè)克隆文庫(kù)的測(cè)得序列分別劃分為10個(gè)和5個(gè)OUT(表2),說(shuō)明盡管反硝化細(xì)菌的豐度低于產(chǎn)甲烷菌,但物種多樣性高于產(chǎn)甲烷菌。2個(gè)文庫(kù)的覆蓋率分別為81.82 %和94.95 %(表2),均大于80 %,說(shuō)明構(gòu)建的2個(gè)文庫(kù)有效,測(cè)序深度適宜,可以代表沉積物中反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的物種多樣性。

    a:反硝化細(xì)菌特異性片段電泳圖;b:產(chǎn)甲烷菌特異性片段電泳圖;M:5 μl DL2000 DNA Marker;1、2、3-泳道a:Specific fragment electrophoresis of denitrifying bacteria; b:Specific fragment electrophoresis map of methanogenic bacteria; M:5 μl DL2000 DNA Marker; 1,2,3:Lane圖1 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段電泳Fig.1 Specific fragment electrophoresis of denitrifying bacteria and methanogenic bacteria

    2.3 反硝化細(xì)菌克隆文庫(kù)中代表序列的BLASTN比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

    結(jié)合MEGA軟件生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2),以及Mothur軟件劃分OTU的結(jié)果(表3),從55個(gè)陽(yáng)性克隆子中選出10個(gè)代表序列(圖2),并運(yùn)用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)55個(gè)陽(yáng)性克隆子可分為10個(gè)種類(lèi):OTU1(代表序列為1-6-1,占比1.82 %)類(lèi)序列與從污泥中一株未培養(yǎng)細(xì)菌CYCU的以亞硝酸鹽還原酶基因序列相似性達(dá)91 %[10],說(shuō)明該類(lèi)菌株具有反硝化活性,但其分類(lèi)地位未能準(zhǔn)確鑒定;OTU2(1-6-22,1.82 %)類(lèi)序列與Pandoraeafaecigallinarum的相似性達(dá)94 %;OTU3(1-6-20,1.82 %)類(lèi)序列與水稻土中對(duì)異化鐵還原反應(yīng)的貢獻(xiàn)最大的優(yōu)勢(shì)菌群Geoalkalibactersubterraneus的相似性達(dá)81 %[11],是潛在的未知種類(lèi);OTU4(1-6-33,10.91 %)類(lèi)序列與廢水活性污泥細(xì)菌Steroidobacterdenitrificans的相似性達(dá)82 %[12];OTU5(1-6-15,1.82)類(lèi)序列與有光異養(yǎng)制氫特性的細(xì)菌Rubrivivaxgelatinosus相似性達(dá)80 %[13];OTU6(1-6-27,7.28 %)類(lèi)序列與Azoarcussp.的相似性達(dá)80 %;OTU7(1-6-38,7.28 %)類(lèi)序列與Polymorphumgilvum的相似性達(dá)81 %;OTU8(1-6-41,10.91 %)類(lèi)序列與Sulfuritaleahydrogenivorans的相似性達(dá)79 %;OTU9(1-6-84,3.64 %)類(lèi)序列與具有甲苯降解特性的Thauerasp.相似性達(dá)82 %[14];OTU10(1-6-4,52.73)類(lèi)序列與污水處理廠(chǎng)尾水中細(xì)菌Dechloromonasaromatica的相似性達(dá)86 %[15],該類(lèi)群是反硝化細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群;OTU1、OTU2、OTU3、OTU5、OTU9類(lèi)序列的發(fā)現(xiàn)頻率較低,為反硝化細(xì)菌中的低豐度類(lèi)群。

    表2 反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌特異性片段克隆文庫(kù)分析

    表3 反硝化細(xì)菌特異性片段克隆文庫(kù)中各OUT代表序列分析

    粗體和下劃線(xiàn)標(biāo)記的序列為代表序列,下同Bold and underlined sequences were representative sequences. The same as below圖2 反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of denitrifying bacteria

    2.4 產(chǎn)甲烷菌克隆文庫(kù)中代表序列的BLASTN比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

    結(jié)合MEGA軟件生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3),以及Mothur軟件劃分OTU的結(jié)果(表4),從99個(gè)陽(yáng)性克隆子中選出5個(gè)代表序列(圖3),并運(yùn)用BLASTN程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)99個(gè)陽(yáng)性克隆子可分為5個(gè)種類(lèi):OTU1(I073,1.01 %)類(lèi)序列與水稻土及污泥中大量存在的Methanobacteriumoryzae相似性達(dá)85 %[16];OTU2(H10,1.01 %)類(lèi)序列與利用氫和甲酸的產(chǎn)甲烷菌甲酸甲烷桿菌(Methanobacteriumformicicum)相似性達(dá)85 %[17];OTU3(E12,3.03 %)類(lèi)序列與酸性泥炭沼澤中大量存在的CandidatusMethanoregulaboonei相似性達(dá)85 %[18];OTU4(E07,3.03 %)類(lèi)序列與采油廢水中檢測(cè)到的Methanolineatarda相似性達(dá)86 %。OTU5(H012, 91.92 %)類(lèi)序列與甲酸甲烷規(guī)則菌(Methanoregulaformicicum)相似性達(dá)86 %,該類(lèi)群是反硝化細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,該類(lèi)群也是最早被報(bào)道的產(chǎn)甲烷微生物;OTU1、OTU2為反硝化細(xì)菌中的低豐度類(lèi)群。

    表4 產(chǎn)甲烷菌特異性片段克隆文庫(kù)中各OUT代表序列分析

    圖3 反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of denitrifying bacteria

    3 討 論

    本研究測(cè)得的154條克隆子序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知可培養(yǎng)菌株的相似性在79 %~94 %,98.7 %的序列與可培養(yǎng)菌株的相似性低于90 %,說(shuō)明滇池沉積物中的反硝化細(xì)菌與產(chǎn)甲烷菌多為潛在的未被培養(yǎng)的新種,相似的可培養(yǎng)群落多來(lái)自于污泥、水稻土、廢水和沼澤,這與前人的研究報(bào)道一致。

    研究得到的反硝化細(xì)菌序列全部歸屬于Proteobacteria門(mén),這與大量反硝化菌屬于Betaproteobacteria綱的報(bào)道相符合[19]。與文庫(kù)中序列相似的可培養(yǎng)微生物屬于Pandoraea屬(1.82 %)、Thauera屬(3.64 %)、Geoalkalibacter屬(1.82 %)、Steroidobacter屬(1.82 %)、Rubrivivax屬(1.82 %)、Azoarcus屬(7.28 %)和Polymorphumgilvum屬等,在以往的研究中,這些屬也作為反硝化細(xì)菌被報(bào)道[20]。

    在《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版中,產(chǎn)甲烷菌的分類(lèi)包括甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)共5個(gè)目,本研究得到的所有序列都?xì)w屬于甲烷桿菌目,未檢測(cè)到其他目的產(chǎn)甲烷菌種類(lèi)。據(jù)報(bào)道,甲烷桿菌目微生物能以H2、CO2、甲酸鹽和甲醇為代謝底物,產(chǎn)生甲烷[21]。本研究發(fā)現(xiàn)的Methanoregula屬微生物被報(bào)道是泥炭蘚濕地土壤中優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)甲烷菌類(lèi)群[22]。

    本試驗(yàn)中,通過(guò)對(duì)目的片段的克隆得到了啟示:通過(guò)PCR獲得的目的片段如果要克隆到載體上,連接體系中目的片段的濃度必須要達(dá)到要求。例如反硝化細(xì)菌特異性片段濃度過(guò)低導(dǎo)致其與pMD19-T載體連接率低,大量空載體被轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,文庫(kù)中克隆子陽(yáng)性率偏低。相反,產(chǎn)甲烷菌特異性片段的濃度高(>100 ng/μl),其克隆文庫(kù)的陽(yáng)性率也高,約為99.00 %。

    本研究只采用引物Me1/Me2對(duì)產(chǎn)甲烷菌的多樣性進(jìn)行研究,尚且存在不足。Banning[23]和Juottonen[24]等人研究指出,Mcr引物和Me引物在檢測(cè)產(chǎn)甲烷菌檢測(cè)中具有不同的靈敏度。Me引物無(wú)法檢測(cè)到產(chǎn)甲烷菌中的Methanosaetaceae和Methanobacteriaceae類(lèi)群,導(dǎo)致研究結(jié)果不能覆蓋全部物種,這與本研究的結(jié)果一致。因此,為了全面準(zhǔn)確的評(píng)估環(huán)境中的產(chǎn)甲烷菌的多樣性,需要選用多對(duì)引物進(jìn)行研究,其次,還應(yīng)結(jié)合傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法,生理生化鑒定方法,才能得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

    4 結(jié) 論

    隨著厭氧培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們對(duì)反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的群體研究會(huì)更加詳細(xì)和全面。今后的相關(guān)研究可以集中在以下2個(gè)方面:首先,可以通過(guò)改進(jìn)微生物分類(lèi)技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多的產(chǎn)甲烷菌群;其次,對(duì)產(chǎn)甲烷菌的代謝特征進(jìn)行更詳細(xì)的研究,為環(huán)境治理和生物能源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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